樊 苗，孫 海，唐信威，趙波波，歐陽寒梅，鄒 強

1.成都醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院(成都 610500)；2.成都醫(yī)學(xué)院 科研實驗中心(成都 610500)

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·論 著·

苯并咪唑衍生物BMT-1對Jurkat細胞增殖及凋亡的影響*

樊 苗1，孫 海1，唐信威1，趙波波1，歐陽寒梅1，鄒 強2△

1.成都醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院(成都 610500)；2.成都醫(yī)學(xué)院 科研實驗中心(成都 610500)

目的 探討苯并咪唑衍生物BMT-1對急性T淋巴細胞白血病Jurkat細胞增殖及凋亡的影響。方法 采用CCK-8測定BMT-1對Jurkat細胞增殖的影響，采用流式細胞術(shù)檢測BMT-1對Jurkat細胞的細胞周期、細胞凋亡和線粒體膜電位的影響。結(jié)果 BMT-1可顯著抑制Jurkat細胞增殖，呈劑量依賴效應(yīng)，GI50為1.08 μmol/L。BMT-1可誘導(dǎo)Jurkat細胞SubG1峰顯著增強、凋亡細胞比例顯著增加和線粒體膜電位顯著改變。結(jié)論 苯并咪唑衍生物BMT-1能顯著抑制Jurkat細胞增殖，并誘導(dǎo)細胞凋亡。

苯并咪唑衍生物；Jurkat細胞；細胞凋亡

急性淋巴細胞白血病是血液系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，表現(xiàn)為大量原始及幼稚的淋巴細胞增殖累積侵犯多個造血器官和組織，表現(xiàn)為細胞惡性增殖、分化異常和凋亡受抑。目前治療白血病多采取以化療為主的綜合治療，而通過誘導(dǎo)白血病細胞凋亡，是化療藥物作用的主要作用機制之一[1]。

苯并咪唑衍生物是一類含氮芳香雜環(huán)化合物，因具有抗炎[2]、抗風濕免疫[3]、抗腫瘤[4]和抗寄生蟲[5]等廣泛的生物活性和應(yīng)用前景越來越受到研究人員的青睞，前期研究發(fā)現(xiàn)苯并咪唑衍生物BMT-1[2-(1H-benzimidazol-2-yl)-4,5,6,7-tetrahydro-2H-indazol-3-ol]能夠抑制骨髓瘤細胞增殖、并誘導(dǎo)細胞凋亡，且不影響正常淋巴細胞的存活[6]。但目前，尚未見BMT-1抑制急性T淋巴細胞白血病Jurkat細胞增殖的報道。本文探討B(tài)MT-1對的Jurkat細胞的增殖和凋亡作用，旨在為臨床抗白血病藥物開發(fā)應(yīng)用提供科學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

BMT-1購于Chembridge公司；CCK-8試劑盒購于日本Dojingdo公司；細胞周期檢測試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)公司；細胞凋亡檢測試劑盒購于美國Roche公司；線粒體膜電位檢測試劑盒購于美國Sigma公司；美國Biotek公司Powerwave XS全波長酶標儀，美國BD公司Accuri C6流式細胞儀。

1.2 細胞培養(yǎng)

急性T淋巴細胞白血病Jurkat細胞為四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)院傳代保存株。細胞在5% CO2，37 ℃恒溫及飽和濕度的培養(yǎng)箱中，使用含10%滅活胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng),定期換液或傳代。

1.3 CCK-8法檢測細胞增殖抑制率

取對數(shù)生長期Jurkat細胞2×104個/孔細胞密度，加入96孔平底板，每孔體積200 μL，除對照組外，實驗組加入不同濃度的BMT-1作用48 h后,加入20 μL CCK-8，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，使用酶標儀選擇450 nm波長檢測光吸收值，實驗重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。按以下公式計算藥物對腫瘤細胞生長抑制率：[(Ti-Tz)/(C-Tz)]×100 ，公式中Ti代表藥物組培養(yǎng)48 h后測定的OD值；Tz代表不含藥物組，起始培養(yǎng)測定的OD值；C代表不含藥物組，培養(yǎng)48 h后測定的OD值[7]。

1.4 細胞周期和細胞凋亡的檢測

Jurkat細胞按2×105個/mL接種于12孔細胞培養(yǎng)板，2 mL/孔，加入不同濃度BMT-1作用24 h后，收集細胞，用預(yù)冷的PBS重懸洗滌，70%乙醇4 ℃固定過夜，使用PI染色，37 ℃避光孵育30 min，使用BD公司Accuri C6流式細胞儀進行檢測、CFlow software (version 1.0.227.4)進行數(shù)據(jù)分析。Annexin V-FITC /PI 雙染法檢測細胞凋亡，按照試劑盒說明書進行操作。收集不同濃度BMT-1作用后的Jurkat細胞，用預(yù)冷的PBS洗滌并重懸于100 μL含有Annexin V-Fluos和PI結(jié)合緩沖液中，室溫避光孵育15 min后，用流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡情況[8]。

1.5 JC-1染色法檢測細胞線粒體膜電位的改變

不同濃度的BMT-1作用Jurkat細胞12 h后，按照試劑盒說明書進行操作，細胞濃度調(diào)整為5×105個/mL，加JC-1染色液，37 ℃孵育20 min，采用流式細胞術(shù)檢測細胞線粒體膜電位的變化[9]。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 BMT-1抑制Jurkat細胞增殖

不同濃度BMT-1作用Jurkat細胞48 h后,用CCK-8法測定BMT-1對Jurkat細胞的GI50。結(jié)果顯示，BMT-1可顯著抑制Jurkat細胞增殖，呈劑量依賴關(guān)系。抑制Jurkat細胞的活性GI50是1.08 μM(圖1)。

圖1 BMT-1抑制Jurkat細胞增殖

注：A. BMT-1化學(xué)結(jié)構(gòu)式；B. BMT-1可抑制Jurkat細胞增殖，呈劑量依賴關(guān)系，GI50為1.08 μmol/L

2.2 BMT-1對Jurkat細胞周期的影響 不同濃度(0.625、1.250、2.500和5.000 μmol/L)BMT-1作用Jurkat細胞24 h后進行細胞周期檢測。結(jié)果顯示，BMT-1可顯著阻滯Jurkat細胞周期于SubG1期且呈劑量依賴關(guān)系(圖2)。

2.3 BMT-1誘導(dǎo)Jurkat細胞凋亡

BMT-1作用Jurkat細胞24 h后，用Annexin V和PI雙染法流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率。結(jié)果顯示，BMT-1在劑量為0.625、1.250、2.500和5.000 μM時，均能夠誘導(dǎo)Jurkat細胞發(fā)生凋亡，凋亡比例明顯增加且呈劑量依賴關(guān)系(圖3)。

2.4 BMT-1降低Jurkat細胞線粒體膜電位

不同濃度BMT-1作用Jurkat細胞12 h后，使用熒光染料JC-1進行染色，用流式細胞術(shù)檢測線粒體膜電位的變化。與空白對照組比較，經(jīng)不同濃度BMT-1作用的Jurkat細胞，線粒體膜電位降低的細胞比例明顯增加且呈劑量依賴關(guān)系(圖4)。

圖 2 BMT-1對Jurkat細胞周期的影響

圖3 BMT-1誘導(dǎo)Jurkat細胞凋亡

圖4 BMT-1對Jurkat細胞膜電位的影響

3 討論

越來越多的資料顯示，細胞凋亡異常在許多惡性腫瘤的發(fā)病學(xué)中占有重要地位[10]，在造血系統(tǒng)惡性腫瘤的臨床治療中，目前大多數(shù)化療藥物是通過誘導(dǎo)細胞凋亡來清除腫瘤細胞。本實驗中苯并咪唑衍生物BMT-1能顯著抑制Jurkat細胞增殖，刺激48 h后的半數(shù)抑制率(GI50)為1.08 μmol/L。經(jīng)BMT-1作用Jurkat細胞用PI染色后，采用流式細胞儀進行細胞周期分析，隨藥物劑量增加，SubG1期細胞比例明顯增加。而SubG1峰是細胞凋亡的重要標志[11]。不同濃度BMT-1作用Jurkat細胞，與對照組相比，Jurkat凋亡細胞比例顯著增加，線粒體膜電位下移明顯。線粒體在細胞凋亡中占有重要作用，多種凋亡刺激如化療藥物的使用均可活化線粒體途徑[12]。上述結(jié)果表明BMT-1能夠抑制Jurkat細胞增殖，其作用機制可能是通過降低細胞線粒體膜電位誘導(dǎo)Jurkat細胞凋亡來實現(xiàn)抑制細胞增殖的作用。

線粒體途徑是細胞凋亡通路中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)和特征性事件[13]?，F(xiàn)臨床治療血液系統(tǒng)腫瘤常用的化療藥物如羥基喜樹堿、阿糖胞苷及高三尖杉脂堿等均可誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，其作用機制可能是通過破壞或改變線粒體跨膜電位或細胞色素C的釋放和 caspase的活化誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡來抑制腫瘤細胞增殖[14]。如喜樹堿誘導(dǎo)Jurkat細胞后，線粒體膜通透化使大量細胞色素C釋放，使ATP耗竭及活性氧增加，激活胞質(zhì)和線粒體中的caspase，導(dǎo)致線粒體膜電位喪失，使腫瘤細胞發(fā)生凋亡，細胞周期檢測到明顯的SubG1凋亡峰[15]。

苯并咪唑衍生物因其良好的生物活性為制藥發(fā)展提供了良好的藥物前體。之前有研究報道,苯并咪唑衍生物可誘導(dǎo)多種腫瘤細胞系抗有絲分裂和抑制腫瘤細胞增殖[16-17]。BMT-1是一種全新結(jié)構(gòu)的苯并咪唑衍生物，目前，有BMT-1誘發(fā)多發(fā)性骨髓瘤細胞系凋亡的報道，但尚未見其誘導(dǎo)血液系統(tǒng)腫瘤細胞系凋亡的報道。Jurkat細胞源于人T淋巴細胞白血病細胞系，是目前研究T 淋巴細胞凋亡的較好模型。本實驗初步觀察了BMT-1對Jurkat細胞凋亡作用，結(jié)果表明，BMT-1可顯著抑制Jurkat細胞增殖，作用于Jurkat細胞后，可使細胞內(nèi)線粒體膜電位顯著降低且呈一定的劑量依賴效應(yīng)，其降低程度反映了線粒體膜受損的程度，是細胞凋亡的早期事件，反映細胞進入不可逆的凋亡程序。

綜上所述，苯并咪唑衍生物BMT-1可通過降低細胞線粒體膜電位誘導(dǎo)細胞凋亡從而抑制Jurkat細胞增殖。BMT-1可作為先導(dǎo)化合物，用于進一步設(shè)計開發(fā)新型高效抗腫瘤藥物，為白血病治療提供更多藥物選擇。

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The Effect of Benzimidazole Derivative BMT-1 on the Proliferation and Apoptosis of Jurkat Cells

Fan Miao1, Sun Hai1, Tang Xinwei1, Zhao Bobo1, Ouyang Hanmei1, Zou Qiang2△.

1. School of Basic Medical Sciences, Chengdu Medical College, Chengdu 610500, China; 2. Center for Scientific Research，Chengdu Medical College, Chengdu 610500, China

Objective To explore the effect of benzimidazole derivative BMT-1 on the proliferation and apoptosis of Jurkat cells. Methods CCK-8 was used to detect the effect of BMT-1 on the proliferation of Jurkat cells, and the flow cytometer was adopted to measure the effect of BMT-1 on the cell cycle, cell apoptosis and mitochondrial membrane potential of Jurkat cells. Results BMT-1 strongly inhibited the growth of Jurkat cell with a GI50 value of 1.08 μmol/L in dose-dependent manner. It induced the enhancement of SubG1 phase of Jurkat cells, elevated the proportion of apoptosis, and changed the mitochondrial membrane potential of Jurkat cells greatly. Conclusion Benzimidazole derivative BMT-1 could significantly inhibit proliferation and induce apoptosis in Jurkat cells.

Benzimidazole derivative; Jurkat cell; Apoptosis

http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20161027.1704.052.html

10.3969/j.issn.1674-2257.2016.05.002

國家自然科學(xué)基金項目(No: 81273530)

R96

A

△通信作者：鄒強，E-mail:qiangzou99@gmail.com