孫海燕

(1. 陜西理工大學陜西省資源生物重點實驗室，陜西 漢中 723000；2. 陜西理工大學生物科學與工程學院，陜西 漢中 723000；3. 國家農(nóng)產(chǎn)品保鮮工程技術研究中心秦巴地區(qū)保鮮工作站，陜西 漢中 723000；4. 陜南秦巴山區(qū)生物資源綜合開發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西 漢中 723000)

?

天麻多酚的超聲輔助提取工藝優(yōu)化及抗氧化活性研究

孫海燕1,2,3,4

(1. 陜西理工大學陜西省資源生物重點實驗室，陜西 漢中 723000；2. 陜西理工大學生物科學與工程學院，陜西 漢中 723000；3. 國家農(nóng)產(chǎn)品保鮮工程技術研究中心秦巴地區(qū)保鮮工作站，陜西 漢中 723000；4. 陜南秦巴山區(qū)生物資源綜合開發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西 漢中 723000)

以鮮天麻為試材，研究了天麻總酚的超聲輔助提取工藝條件，以最佳工藝對不同干燥條件下的天麻粉進行總酚提取，測定其總酚含量與抗氧化能力，并分析兩者的相關性。結果表明，影響天麻總酚提取效果的最主要因素是提取溫度，最優(yōu)工藝條件為：提取溫度50 ℃、提取時間35 min、提取功率80 W，料液比1∶10(g/mL)，在該條件下，天麻總酚含量最高為5.62 mg/g；不同干燥條件下，55 ℃熱風干燥制得的天麻粉總酚含量最高，達5.754 mg/g，其總抗氧化能力、抗超氧陰離子自由基能力、抑制羥自由基能力和DPPH自由基清除能力也最高，同時，天麻總酚含量與其抗氧化能力呈顯著相關，說明天麻總酚具有一定的抗氧化能力。

天麻；多酚；超聲輔助提??；抗氧化活性

天麻(GastrodiaelataBl)，又名赤箭、獨搖芝、離母、合離草、神草、鬼督郵、木浦、明天麻、定風草、白龍皮等，根狀莖肥厚，無綠葉，蒴果倒卵狀橢圓形，常以塊莖或種子繁殖，是蘭科天麻屬多年生草本植物，為常用名貴中藥。主產(chǎn)于四川、貴州、云南、陜西等省，安徽省大別山區(qū)、皖南山區(qū)也有出產(chǎn)[1-2]。

植物多酚是廣泛存在于植物體內的一類多元酚類化合物，是植物的次生代謝產(chǎn)物，具有獨特的生理活性和藥用價值[3-4]。多酚具有較強的清除自由基、抗氧化活性、抗衰老等生物活性功能。目前，從天麻塊莖中共分離得到20個酚類化合物及其苷類，包括8種簡單酚類：天麻素、對羥基苯甲醇、香莢蘭醇、香莢蘭醛、對羥基苯甲醛、對羥芐基甲醚、3,4-二羥基苯甲醛、對羥芐基乙醚；12種含2個或3個苯環(huán)的酚類化合物，如4,4'-二羥基二苯基甲烷等[5]。但目前在天麻總酚提取工藝以及天麻粉的制備方法對總酚含量與抗氧化能力方面的影響研究報道甚少，僅廖全斌等[6]對天麻提取物的抗氧化活性進行過簡單研究，即采用DPPH自由基清除法研究抗氧化活性與天麻素含量的關系，而對天麻總酚的提取工藝及其它抗氧化方法未進行研究。本試驗擬確定超聲提取法提取天麻總酚的最優(yōu)提取工藝條件，并研究不同干燥方法對天麻總酚抗氧化能力的影響，旨在為后續(xù)天麻干燥及總酚的提取與抗氧化能力的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

紅苔鮮天麻：采自陜西省漢中市南鄭縣青樹鎮(zhèn)柳樹村，挖取當天運回實驗室；

Folin-酚試劑、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) ： 北京索萊寶科技有限公司；

無水乙醇、鹽酸、甲醇、碳酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸鹽：分析純，天津科密歐化學試劑有限公司；

沒食子酸(Gallic acid)標準品：純度90.8%，中國食品藥品檢定研究院；

總抗氧化能力(T-AOC)試劑盒、抗超氧陰離子自由基試劑盒、羥自由基試劑盒、過氧化氫(H2O2)試劑盒：南京建成生物科技有限公司。

1.1.2 主要儀器設備

打漿機：DZJ-405型，廣東天際電器有限公司；

電熱恒溫鼓風干燥箱：GZX-GF101-3BS型，上海躍進醫(yī)療器械有限公司；

微波爐：G70F20CN/L-DG型，格蘭仕微波生活電器有限公司；

超聲波清洗儀：Sb-5200 DFD型，中國寧波新芝生物科技股份有限公司；

真空干燥冷凍機：DZF型，中國寧波新芝生物科技股份有限公司；

紫外分光光度計：L5型，上海儀電科學儀器股份有限公司；

高速離心機：H1850R型， 中國湘儀公司；

旋轉蒸發(fā)儀：RE-52AA型，上海亞榮生化儀器廠；

萬分之一天平：BAC2245型，賽多利斯科技儀器(北京)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 天麻干粉樣品的制備 將鮮天麻清洗、切片、打漿，制成漿液后，分別用熱風干燥、真空冷凍干燥、微波干燥制得天麻干粉，具體干燥處理方法：

(1) 熱風干燥法：取一定量的天麻漿液，分別放于45，55，65 ℃下的干燥箱中干燥至恒重，取出裝進自封袋中貼上標簽，放于-80 ℃冰箱備用。45，55，65 ℃干燥的分別為樣品1、樣品2、樣品3。

(2) 真空冷凍干燥法：將切片蒸煮后的天麻制成漿液，并與未蒸煮直接打漿的天麻漿液放入-80 ℃冰箱凍藏24 h，之后分別放入真空冷凍干燥機凍干成粉，取出裝進自封袋中貼上標簽，放于-80 ℃冰箱備用。漿液蒸煮后冷凍干燥制備的為樣品4，直接冷凍干燥制備的為樣品5。

(3) 微波干燥法：將打漿后的天麻平鋪在玻璃托盤中，分別用4個火力(40%，50%，60%，70%)干燥至恒重，微波爐的功率恒定在800 W，取出裝進自封袋中貼上標簽，放于-80 ℃冰箱備用。40%，50%，60%，70%火力干燥的分別為樣品6、樣品7、樣品8、樣品9。

1.2.2 天麻總酚的提取工藝流程

天麻干粉→過篩(40目)→超聲輔助提取→離心→取上清液→旋轉蒸發(fā)濃縮→定容→天麻總酚提取液

1.2.3 天麻總酚提取條件

(1) 提取溫度對天麻總酚含量的影響：取55 ℃烘干的天麻干粉1 g于50 mL離心管中，加入60%鹽酸乙醇10 mL，放入超聲提取器中，在功率60 W、時間30 min、頻率40 kHz的條件下分別選用30，40，50，60，70 ℃的提取溫度進行提取，然后在4 ℃、10 000 r/min下離心10 min，收集上清液，以上操作重復3次，3次上清液合并經(jīng)旋轉蒸發(fā)儀蒸發(fā)濃縮至體積≤5%，用甲醇定容至5 mL，測定總酚含量。

(2) 提取時間對天麻總酚含量的影響：取55 ℃烘干的天麻干粉1 g于50 mL離心管中，加入60%鹽酸乙醇10 mL，放入超聲提取器中，在功率60 W、溫度30 ℃、頻率40 kHz的條件下分別選用20，25，30，35，40 min的提取時間進行提取，后續(xù)步驟同1.2.3(1)。

(3) 超聲功率對天麻總酚含量的影響：取55 ℃烘干的天麻干粉1 g于50 mL離心管中，加入60%鹽酸乙醇10 mL，放入超聲提取器中，在時間30 min、溫度30 ℃、頻率40 kHz的條件下分別選用40，60，80，100，120 W的提取功率進行提取，后續(xù)步驟同1.2.3(1)。

(4) 料液比對天麻總酚含量的影響：取55 ℃烘干的天麻干粉1 g于50 mL離心管中，分別加入60%鹽酸乙醇5，10，15，20，25 mL，放入超聲提取器中，在時間30 min、溫度30 ℃、功率60 W、頻率40 kHz的條件下進行提取，后續(xù)步驟同1.2.3(1)。

(5) 正交試驗設計：為了綜合考慮各因素對天麻總酚含量的影響，根據(jù)單因素試驗結果，選取提取溫度、提取時間、料液比、超聲功率4個考察因素，設計四因素三水平正交試驗。

1.2.4 天麻總酚含量的測定

(1) 沒食子酸的標準曲線繪制：準確稱取0.5 g干沒食子酸于100 mL容量瓶中，用水定容至刻度；準確吸取0.0，0.1，0.2，0.3，0.5，1.0 mL上述溶液并分別定容至10 mL；另取6支試管，分別吸取上述溶液0.1 mL，各加水5 mL，混合，各加福林—肖卡0.5 mL，充分混合；在30 s至8 min中之內加入20%碳酸鈉溶液1.5 mL，混合后用水定容到10 mL，20 ℃避光靜置2 h，在波長765 nm處測量其吸光度，繪制標準曲線并求得線性回歸方程。

(2) 天麻總酚含量測定：準確吸取天麻總酚提取液0.1 mL，按標準曲線制作方法加入各試劑，并定容至10 mL，20 ℃避光靜置2 h，在波長765 nm處測量其吸光度，根據(jù)式(1)計算天麻總酚含量。

(1)

式中：

A——總酚含量，mg/g；

C——總酚濃度，mg/mL；

V——提取液體積，mL；

n——稀釋倍數(shù)，本試驗為5；

W——原料重量，g。

1.2.5 抗氧化能力測定

(1) DPPH自由基清除能力的測定：參考孟江飛[7]的方法，修改如下：取9種天麻總酚提取液的樣品各1 mL與2 mL 0.1 moL/L的磷酸鹽緩沖液(pH=6.0)，以及2 mL 200 μmoL/L的DPPH乙醇溶液混合均勻，漩渦震蕩后，室溫下避光靜置30 min，2 000 r/min離心15 min后，取上清液在517 nm處測定吸光值。重復3次。DPPH自由基清除能力按式(2)計算：

(2)

式中：

P—— DPPH自由基清除能力，%；

As——樣品吸光值測定值；

A0——以95%乙醇代替DPPH溶液時的吸光值；

A——以蒸餾水代替樣品時的空白測定值。

(2) 總抗氧化能力的測定：采用總抗氧化試劑盒法進行。在37 ℃時，每分鐘每毫升血清(漿)使反應體系的吸光度(OD)值每增加0.01時，為一個總抗氧化能力單位?？偪寡趸芰Π词?3)計算：

(3)

式中：

Q——總抗氧化能力，U/mL；

As——測定管吸光度值；

A——對照管吸光度值；

N——反應體系稀釋倍數(shù)(反應液總體積/取樣量)；

n——樣品測試前稀釋倍數(shù)，本試驗為1。

(3) 抗超氧陰離子自由基能力的測定：采用抗超氧陰離子試劑盒法測定。在反應系統(tǒng)中，每升血清(漿)在37 ℃反應40 min所抑制的超氧陰離子自由基相當于1 mg的Vc所抑制的超氧陰離子自由基的變化值為一個活力單位?？钩蹶庪x子能力按式(4)計算：

(4)

式中：

H——抗超氧陰離子自由基能力，U/L；

A——對照管吸光度值；

As——測定管吸光度值；

A0——標準管吸光度值；

C——標準品濃度，0.15 mg/mL；

n——樣品測試前稀釋倍數(shù)，本試驗為1。

(4) 過氧化氫含量的測定：按照南京建成生物公司過氧化氫試劑盒(AO24)說明操作。樣品中過氧化氫含量按式(5)計算：

(5)

式中：

W——過氧化氫含量，mmoL/L；

As——測定管吸光度值；

A——空白管吸光度值；

A0——標準管吸光度值；

C——標準品濃度，163 mmoL/L；

n——樣品測定前稀釋倍數(shù)，本試驗為3。

(5) 羥自由基清除能力的測定：采用羥自由基測試盒測定。每毫升血清(漿)在37 ℃反應1 min，使反應體系中H2O2濃度降低1 mmoL/L為一個抑制羥自由基能力單位。羥自由基清除能力按式(6)計算：

(6)

式中：

Y——抑制羥自由基能力，U/L；

A——對照管吸光度值；

As——測定管吸光度值；

Au——標準管吸光度值；

A0——空白管吸光度值；

C——標準品濃度，8.824 mmoL/L；

V——取樣量，mL；

n——樣品測定前稀釋倍數(shù)，本試驗為1。

2 結果與分析

2.1 沒食子酸標準曲線

繪制沒食子酸吸光度與濃度的標準曲線，見圖1，并擬合線性回歸方程y=0.094 3x-0.001 4，R2=0.999 3。

2.2 單因素試驗結果與分析

2.2.1 提取溫度對天麻總酚含量的影響 由圖2可知，在30～70 ℃時，天麻總酚含量隨著溫度的升高，呈現(xiàn)出先增加后下降的趨勢，在50 ℃時天麻總酚含量最高，為5.26 mg/g。隨著溫度升高，天麻總酚含量反而下降。這可能是隨著提取溫度的提高，天麻總酚的溶解度也隨著增加，天麻含量隨之升高，但溫度過高會破壞天麻總酚含量，使其降低。

圖1 沒食子酸標準曲線

圖2 提取溫度對天麻總酚含量的影響

Figure 2 The influence of extraction temperature on the total phenol content ofgastrodiaelata

石恩惠等[8]采用水浴提取法提取板栗總苞多酚，在乙醇濃度為60%、液料比為20∶1(mL/g)、提取時間為120 min的條件下提取，發(fā)現(xiàn)在60～90 ℃時，板栗總苞多酚提取得率呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，到80 ℃時，提取得率達到最大，超過80 ℃時呈現(xiàn)降低的趨勢，與本試驗變化趨勢一致。

2.2.2 提取時間對天麻總酚含量的影響 由圖3可知，提取時間從20 min增加到35 min時，總酚含量逐漸增加，35 min達到最大，為4.27 mg/g，當提取時間超過35 min后，總酚含量不再增加，且略有下降，說明35 min時，天麻總酚已基本溶出完全，增加提取時間不能增大總酚含量，同時會造成部分總酚受到破壞[9]。

朱素英[9]利用響應曲面法優(yōu)化天麻多酚的提取工藝，結果顯示，在15～45 min時，天麻多酚提取量隨時間的增加而增加，45 min時達到最大，為41.789 mg/g，超過45 min時，提取量反略有所下降，與本試驗變化趨勢一致。

圖3 提取時間對天麻多酚含量的影響

Figure 3 The influence of extraction time on the total phenol content ofgastrodiaelata

2.2.3 超聲功率對天麻總酚含量的影響 由圖4可知，隨著超聲功率的升高，天麻總酚含量呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢，在80 W時天麻總酚含量最高為4.17 mg/g。超過80 W時，天麻總酚含量反而下降。這可能是超聲波在提取溶液中產(chǎn)生的空化效應和機械作用可以有效破碎植物細胞壁，使有效成分呈游離狀態(tài)并溶入提取溶劑，因此，一定功率時可促進總酚的提取。當功率過高時，總酚會在超聲的作用下分解，同時也會使更多的脂溶性物質溶入提取液中，影響總酚提取率[10]。

圖4 超聲功率對天麻總酚含量的影響

Figure 4 The influence of ultrasonic power on the total phenol content ofgastrodiaelata

羅磊等[11]采用超聲法提取金銀花中類黃酮，在液料比55∶1(mL/g)、55%乙醇、提取溫度50 ℃、提取時間30 ℃條件下提取，結果表明，隨著超聲功率的增大，金銀花葉中黃酮類化合物提取率先升高后下降，在250 W時黃酮提取率最大，與本試驗總體變化趨勢一致。

2.2.4 料液比對天麻總酚含量的影響 由圖5可知，料液比在1∶5～1∶10(g/mL)時，隨著溶劑量的增加，天麻總酚含量也隨之增大，當料液比為1∶10(g/mL)時，總酚含量達到最高，為4.49 mg/g，說明此時總酚的溶出量已達飽和，而當料液比在1∶10～1∶25(g/mL)時，天麻總酚含量則逐漸降低。

郭樹琴等[12]采用超聲提取綠茶茶多酚，在超聲功率480 W、提取時間15 min的條件下提取，結果顯示，隨著液料比增大，多酚逐漸上升，當達到40∶1(mL/g)后提取率開始緩慢下降，與本試驗變化趨勢一致。

圖5 料液比對天麻總酚含量的影響

Figure 5 The influence of the ratio of material to liquid on the total phenol content ofgastrodiaelata

2.3 天麻總酚提取工藝條件的優(yōu)化

為了綜合考慮各因素對天麻總酚含量的影響，根據(jù)單因素試驗結果，選取提取溫度、提取時間、料液比、超聲功率4個考察因素，設計四因素三水平正交試驗，試驗因素水平見表1。

由表2可知，在超聲提取天麻總酚的過程中，影響因素的主次順序為：提取溫度>料液比>提取功率>提取時間；最優(yōu)提取工藝為：提取溫度50 ℃、提取時間35 min、提取功率80 W，料液比1∶10(g/mL)。由于正交試驗分析得出的最優(yōu)工藝條件組合，并不在實施的9個試驗中。對正交試驗最優(yōu)水平組合進行驗證實驗，重復3次，天麻總酚含量為5.62 mg/g，證明該組合是超聲提取天麻中的總酚最佳工藝組合。

表1 正交試驗因素水平

表2 超聲法提取天麻總酚正交試驗的結果分析

Table 2 The result analysis of orthogonal experiment ofgastrodiaelatatotal phenol extraction by ultrasonic method

序號ABCD總酚含量/(mg·g-1)111112.650212224.530313332.960421234.340522314.190623124.850731323.770832133.680933214.040k13.3803.5873.7273.627k24.4604.1334.3034.383k33.8303.9503.6403.660R1.0800.5460.6630.756

2.4 不同處理方法的天麻總酚含量

由圖6可知，熱風干燥法的總酚含量高于其他兩種方法；樣品2(即55 ℃熱風干燥法處理)的總酚含量最高(5.754 mg/g)，樣品5(即直接凍干處理)總酚含量最低(1.529 mg/g)。

袁勝浩等[13]在天麻中天麻素含量的影響因子研究中，將新鮮天麻與凍干天麻、蒸制天麻、烤制天麻中的天麻素比較，結果發(fā)現(xiàn)，蒸制后的天麻素含量最高；葛進等[14]在蒸制斷生后真空冷凍干燥對天麻質量的影響研究中，發(fā)現(xiàn)與鮮天麻直接真空冷凍干燥相比，95 ℃蒸制后再真空冷凍干燥，其天麻素含量和復水率顯著高于鮮天麻直接冷凍干燥，與本試驗結果相同。

圖6 不同處理方法的總酚含量測定結果

2.5 不同處理方法的天麻總酚抗氧化能力

由表3可知，不同處理方法的天麻總酚抗氧化性能力差異顯著。9種樣品中，樣品2的總抗氧化能力、抗超氧陰離子自由基能力、抑制羥自由基能力、DPPH自由基清除能力最強，分別達5.763 U/mL、79.14 U/L、75.83 U/mL、88.73%；對于過氧化氫含量，樣品1含量最高為241.64 mmoL/L；樣品5總抗氧化能力與過氧化氫含量最低，分別為0.217，49.09 mmoL/L；樣品7抗超氧陰離子自由基能力能力最低，為4.6 U/L；樣品9抑制羥自由基能力最低，為7.06 U/mL；樣品8 DPPH自由基清除能力最低，為57.15%。

2.6 天麻總酚含量與抗氧化能力相關性分析

抗氧化活性物質的抗氧化能力與其成分之間緊密相關[15]，因此，對天麻總酚含量與其抗氧化特性進行相關性統(tǒng)計，結果(表4)表明，總酚含量與總抗氧化能力、抑制羥自由基能力、過氧化氫含量、DPPH自由基清除能力存在正相關，相關系數(shù)分別為0.722，0.304，0.718，0.297；其中，總酚含量與總抗氧化能力、過氧化氫含量呈現(xiàn)極顯著相關，與抗超氧陰離子自由基能力呈現(xiàn)負相關，相關系數(shù)分別為0.722，0.718，-0.241。結合以上，說明天麻總酚含量與其抗氧化能力密切相關。

表3 不同處理方法的天麻總酚抗氧化活性能力測定結果

? 同列不同字母表示在P=0.05水平上顯著差異。

表4 總酚含量與抗氧化特性相關性分析

? **表示在P=0.01水平(雙側)上極顯著相關；*表示在P=0.05水平(雙側)上顯著相關。

3 結論

(1) 天麻總酚提取的最優(yōu)工藝條件為：提取溫度50 ℃、提取時間35 min、提取功率80 W，料液比1∶10(g/mL)，在此試驗條件下，天麻總酚提取含量為5.62 mg/g。

(2) 熱風干燥法的總酚含量與抗氧化能力最大，其次是微波干燥，冷凍干燥的總酚含量與抗氧化能力最小。同時，天麻總酚含量與總抗氧化能力、過氧化氫含量相關性分析呈現(xiàn)極顯著相關，說明天麻總酚具有一定的抗氧化能力。

(3) 本研究的不足之處在于對天麻多酚的抗氧化研究僅停留在體外化學測定，未深入到細胞水平和體內動物試驗，下一步需更深入研究。

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Optimization of process extraction of polyphenols fromGastrodiaelataBIand its antioxidant activity

SUNHai-yan1,2,3,4

(1.ShaanxiSci-techUniversityShaanxiKeyLaboratoryofResourceBiology,Hanzhong,Shaanxi723000,China;2.ShaanxiSci-techUniversityofBiologicalScienceandEngineering,Hanzhong,Shaanxi723000,China;3.NationalEngineeringResearchCenterforPreservationofAgriculturalProductsinQinbaAreaPreservationWorkstation,Hanzhong,Shaanxi723000,China;4.Qinling-BashanMountainsBioresourcesComprehensiveDevelopmentC.I.C.,Hanzhong,Shaanxi723000,China)

The freshGastrodiaelatawas used to extract total phenolic content which help to explore an ultrasonic assisted extraction technology.. The total phenol from theG.elataunder different drying conditions was extracted by the optimized technology. The total phenolic content and antioxidant capacity were detected, and then the correlation between them was analyzed. The results showed that extraction temperature was the main factor that influenced the extraction efficiency of total phenol. The optimal process condition was.extracting the total phenol for 35 min at 50℃, using a solid-liquid ratio is 1∶10(g/mL)with extraction power 80 W, and consenquently 5.62 mg/g of total phenole was obtained fromG.Elata. Furthemor, it was found that the highest content of total phenolic content is 5.754 mg/g in hot air drying among all the different drying conditions, and total antioxidant capacity, anti superoxide anion free radical, hydroxyl radical scavenging activity and DPPH radical scavenging ability of it were also the highest. In addition, the total phenolic content and antioxidant capacity were found significantly correlated with each other, and this indicated that the total phenolic compounds might poccess certain antioxidant capacity.

Gastrodiaelata; polyphenols; ultrasound assisted extraction; antioxidant activity

陜西省教育廳專項(編號：16JK1155)；秦巴山區(qū)生物資源綜合開發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心項目(編號：QBXT-Z(P)15-22)

孫海燕(1979—)，女，陜西理工大學講師，碩士。

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2016-06-07

10.13652/j.issn.1003-5788.2016.10.036