劉 萍 祁興普 劉 靖 姚 芳 李志方

(江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院食品科技學(xué)院，江蘇 泰州 225300 )

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芋頭多糖提取工藝優(yōu)化及其體外結(jié)合脂類和膽酸鹽能力研究

劉 萍 祁興普 劉 靖 姚 芳 李志方

(江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院食品科技學(xué)院，江蘇 泰州 225300 )

以新鮮龍香芋為原料，對其水溶性多糖的水溶醇沉提取工藝進行優(yōu)化，并通過體外模擬人體胃腸消化環(huán)境，測定其對脂肪、膽固醇、膽酸鹽的結(jié)合能力，考察芋頭多糖的體外降脂效果。結(jié)果表明，當(dāng)提取溫度80 ℃、提取時間6 h、料液比1∶6(g/mL)、乙醇體積分?jǐn)?shù)85%時，芋頭多糖提取效果最好，提取率達(dá)(4.92±0.18)%。芋頭多糖經(jīng)過胃腸消化系統(tǒng)后，對脂肪和膽酸鹽的吸附效果優(yōu)于對照纖維素，對兩者的結(jié)合能力與其質(zhì)量濃度呈現(xiàn)顯著相關(guān)性；對膽固醇的吸附效果低于纖維素，表明芋頭多糖具有一定的降脂功能，降脂機理與纖維素不同。

芋頭；多糖；體外降脂；膽酸；膽固醇

目前肉類、乳制品等脂肪含量較高的食品已成為日常膳食的主要來源，脂肪的過多攝入可能導(dǎo)致肥胖、脂肪肝、高血脂癥等。高血脂癥常繼發(fā)于糖尿病、腎病綜合癥等疾病，是動脈粥樣硬化、冠心病等心腦血管疾病的危險因素之一[1]。有研究[2]顯示，機體內(nèi)血脂變化與體內(nèi)總膽固醇含量變化呈正相關(guān)。因此，開發(fā)降膽固醇的藥物或營養(yǎng)膳食以降血脂、減少心腦血管疾病的發(fā)病危險性是目前醫(yī)藥及膳食營養(yǎng)領(lǐng)域研究方向之一。大量研究表明植物活性多糖具有降血脂等生理活性，已證實的有銀杏多糖[2]、杏鮑菇多糖[3]、何首烏多糖[4]、黑木耳多糖[5]、南瓜多糖[6]等，且?guī)缀鯚o副作用，部分植物多糖已用于保健食品、醫(yī)藥等方面[7-8]。

芋頭俗稱芋艿，屬天南星科，是多年生塊莖植物，產(chǎn)地遍布中國大部分地區(qū)，長江流域主要分布在泰州靖江、泰興、興化等地。芋頭營養(yǎng)物質(zhì)含量高，除了富含蛋白質(zhì)、鈣、磷、鐵、鉀、鎂、鈉、胡蘿卜素、煙酸、B族維生素等多種成分外，還含有黏液多糖、黏液皂素、堿性物質(zhì)等[9]生理活性物質(zhì)，兼具營養(yǎng)和保健作用。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)芋頭多糖具有一定的降脂作用，但主要集中在芋頭淀粉上，如Sebnem等[10]從芋頭中分離得到純度為98%的淀粉，并進一步制備出抗性淀粉，通過體外試驗得出抗性淀粉的血糖生成指數(shù)(eGI)與正常淀粉相比有顯著性的下降，且兩種淀粉均具有一定的膽酸結(jié)合能力，由此推測其具有潛在的降膽固醇作用。除淀粉外，芋頭中的水溶性多糖也是其活性功能的關(guān)鍵組分，已報道有免疫調(diào)節(jié)[11]、抗氧化[12]等功能，但是尚未見有關(guān)其降脂方面的研究報道。因此，本研究擬以泰州市興化的龍香芋為原料，優(yōu)化龍香芋頭中水溶性多糖的提取工藝，得到芋頭粗多糖，同時通過模擬其在人體胃腸消化環(huán)境中與脂肪、膽固醇和膽酸鹽結(jié)合能力，探討芋頭粗多糖的降脂效果，旨在從營養(yǎng)保健方面，為預(yù)防高血脂功能性芋頭產(chǎn)品的研發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

新鮮龍香芋及豆油：食品級，泰州世紀(jì)聯(lián)華超市；

透析袋：截留分子量3.5 kDa，上海國藥集團；

α-淀粉酶：BR級，上海國藥集團；

膽固醇測定試劑盒：BR級，南京建成生物工程研究所；

牛磺膽酸鈉、牛膽鹽：BR級，上海瑞永生物科技有限公司；

膽固醇、油酸：AR級，上海瑞永生物科技有限公司；

其他試劑：AR級，上海國藥集團。

1.1.2 主要儀器

分光光度計：722型，上海棱光技術(shù)有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RE-52D型，上海青浦滬西儀器廠；

高速冷凍離心機：Heraeus PRIMO-R型，美國Thermo Fisher公司；

凍干機：Labconco 6L型，照生有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 芋頭粗多糖提取工藝 在文獻(xiàn)[12]的基礎(chǔ)上略有修改。稱取適量芋頭丁(1 cm3)按料液比1∶6(g/mL)加入水，進行組織搗碎后全部轉(zhuǎn)移至燒杯中，80 ℃水浴提取6 h；提取結(jié)束后多次4 000×g離心15 min去渣，合并上清液，用0.1 mol/L NaOH溶液調(diào)整pH為6.0，按照18 U/g比例加入耐高溫α-淀粉酶，85 ℃酶解1.5 h，I2/KI檢驗直至碘液不變色。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將水解液濃縮至約原體積的1/5。加4倍于濃縮液體積的無水乙醇，攪拌均勻后4 ℃條件下靜置過夜。將靜置液4 000×g離心15 min所得沉淀用Sevage法(氯仿∶正丁醇=5∶1)[13]脫蛋白，濾液經(jīng)流水透析(截留分子量3.5 kDa)后凍干，制成芋頭粗多糖備用。

1.2.2 芋頭水分含量的測定 按GB 5009.3—2010常壓干燥法執(zhí)行。

1.2.3 芋頭中多糖含量的測定

(1) 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：采用苯酚硫酸法[14]，以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)，測得標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.079 4x+0.032 4，R2=0.999 6。

(2) 芋頭粗多糖含量的測定：在文獻(xiàn)[15]和[16]的基礎(chǔ)上略作改動。精密稱取芋頭粗多糖凍干粉末10 mg，加適量水溶解，室溫下超聲15 min，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，用水定容，作為粗多糖供試品溶液。稀釋粗多糖供試品溶液至適當(dāng)濃度，準(zhǔn)確吸取1 mL稀釋液于具塞量筒中，取超純水1 mL作空白對照，按1.2.3(1)方法測定，測定芋頭多糖的含量(以芋頭干重計)。

1.2.4 芋頭多糖得率 按式(1)計算：

(1)

式中：

Y——多糖得率，%；

C——測量用粗多糖溶液中葡萄糖的濃度，μg/mL；

V——測量用粗多糖溶液的體積，mL；

D——稀釋倍數(shù)；

m——粗多糖供試品的質(zhì)量，mg；

M1——提取所得粗多糖凍干粉的質(zhì)量，g；

M0——提取用新鮮芋頭的質(zhì)量，g；

w——新鮮芋頭水分含量，g/100 g。

1.2.5 膽酸鹽含量測定 參照文獻(xiàn)[17]。

1.2.6 芋頭粗多糖提取單因素試驗設(shè)計 根據(jù)已報道文獻(xiàn)[12,15,18]，料液比、乙醇濃度、提取溫度和提取時間是影響多糖提取率的主要因素，因此本研究以多糖得率為指標(biāo)，選擇以上參數(shù)對龍香芋多糖的提取工藝進行優(yōu)化；所有試驗都平行測定3次，取平均值。

(1) 料液比對芋頭粗多糖提取率的影響：固定1.2.1方法中其他因素不變，改變料液比為1∶2，1∶4，1∶6，1∶8，1∶10(g/mL)，篩選合適的料液比。

(2) 提取溫度和提取時間對芋頭粗多糖提取率的影響：將芋頭切成小丁，按照料液比1∶8(g/mL)進行組織搗碎，其他因素同1.2.1，分別于不同提取溫度(70，75，80，85，90 ℃)下提取不同時間(4，5，6，7，8 h)，篩選合適的提取溫度和提取時間。

(3) 乙醇體積分?jǐn)?shù)對芋頭粗多糖提取率的影響：將芋頭切成小丁，按照料液比1∶8(g/mL)進行組織搗碎，在80 ℃水溶中提取6 h，其他因素同1.2.1，改變乙醇體積分?jǐn)?shù)為75%，80%，85%，90%，95%，篩選合適的乙醇體積分?jǐn)?shù)。

1.3 芋頭多糖體外降脂試驗

1.3.1 芋頭多糖與油脂的結(jié)合 參考文獻(xiàn)[19]。分別稱取一定質(zhì)量的芋頭多糖樣品和纖維素于50 mL具塞量筒中，經(jīng)10 mL蒸餾水溶解后，用0.1 mol/L鹽酸溶液調(diào)pH至2.0，加入10 g豆油，充分混勻，在37 ℃恒溫水浴中培養(yǎng)2 h，取出，冷卻至室溫后，用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液將樣品pH調(diào)至7.6，37 ℃繼續(xù)恒溫孵育2 h后，4 ℃ 4 000 r/min離心20 min，小心移除上層未結(jié)合的油，并稱取其重量，實際用油量減去剩余油量即為樣品中所結(jié)合油的重量。多糖樣品結(jié)合油質(zhì)量減去空白對照中結(jié)合油質(zhì)量即為多糖/纖維素結(jié)合脂肪量。以每克多糖結(jié)合豆油的克數(shù)表示(g/g)。同時做3組平行試驗,取其平均值。

1.3.2 芋頭多糖與膽固醇的結(jié)合 參照文獻(xiàn)[20]。將不同質(zhì)量的芋頭多糖在膽固醇的膠束溶液中進行結(jié)合，其中1 mL膠束溶液中含有100 mmol/L?；悄懰徕c、20 mmol/L膽固醇、50 mmol/L油酸、1 320 mmol/L氯化鈉、150 mmol/L磷酸緩沖液(pH 7.4)。將空白對照、芋頭多糖樣品以及纖維素分別加入到膠束溶液中，然后將混合溶液在37 ℃恒溫振蕩水浴中培養(yǎng)2 h，并在10 000 r/min離心20 min，收集上清液用試劑盒測定其中膽固醇含量即為結(jié)合的膽固醇的量。以每克芋頭多糖結(jié)合膽固醇的毫克數(shù)表示(mg/g)。做3次平行試驗，取平均值。

1.3.3 芋頭多糖與膽酸鹽的結(jié)合 參照文獻(xiàn)[20]。稱取一定質(zhì)量的芋頭多糖樣品及纖維素分別置于50 mL具塞試管中，加入5 mL 0.1 mol/L鹽酸溶液在37 ℃恒溫水浴中培養(yǎng)2 h，用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液將樣品pH調(diào)至7.6，分別加入含0.5 mg/mL膽酸鹽的pH 7.6、0.1 mol/L磷酸緩沖液10 mL，37 ℃恒溫振蕩水浴中消化2 h。同時做底物空白和膽鹽空白。對上清液中的膽酸鹽進行分析。由膽酸鹽總量與未結(jié)合的膽鹽量的差值計算芋頭多糖結(jié)合膽鹽的量，以每克芋頭多糖結(jié)合膽鹽的毫克數(shù)表示(mg/g)。做3次平行試驗，取平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 芋頭多糖的提取條件優(yōu)化

2.1.1 料液比對芋頭多糖提取率的影響 提取溫度和提取時間一定時，多糖的提取量與料液比直接相關(guān)。料液比對芋頭粗多糖提取率的影響見圖1。

圖1 料液比對多糖提取率的影響

由圖1可知，芋頭多糖提取率隨料液比例的增大呈現(xiàn)上升趨勢；但當(dāng)料液比大于1∶6(g/mL)時，芋頭多糖得率增加趨勢變緩，當(dāng)料液比大于1∶8(g/mL)時，多糖得率基本不變。液料比過小，溶劑量少導(dǎo)致溶液的黏度大，阻止多糖的有效溶出，故提取率較低[16]；當(dāng)料液比增加到一定程度，即體系內(nèi)溶質(zhì)擴散和溶劑滲透達(dá)到動態(tài)平衡狀態(tài)時，所有多糖都已全部溶出，再增加溶劑的量，多糖的溶出率基本保持不變，還會導(dǎo)致芋頭中蛋白質(zhì)等水溶性成分的溶出，導(dǎo)致后續(xù)多糖提取中蛋白質(zhì)去除困難[15]。因此料液比取1∶8(g/mL)較適合，這與楊秀芳等[15]對陜西芋頭多糖的提取結(jié)果基本一致。

2.1.2 提取溫度和提取時間對芋頭多糖提取率的影響 提取溫度和提取時間對芋頭多糖提取率的影響見圖2。

由圖2可知，料液比不變時，當(dāng)溫度低于80 ℃，提取時間小于6 h時，隨著提取溫度的升高和提取時間的增長，芋頭多糖提取率急劇增加，但當(dāng)提取溫度超過80 ℃時，不同溫度條件下芋頭多糖的提取率變化差異不大，且提取時間超過6 h之后，隨提取時間的延長，提取率基本不變。這可能因為溶劑的滲透速率以及溶質(zhì)的擴散速率均隨溫度的升高而增大，一定溫度下，擴散滲透達(dá)到動態(tài)平衡，再次升高溫度對多糖提取率影響不大。考慮到溫度過高可能對多糖結(jié)構(gòu)及活性造成不利影響，此外，在實際生產(chǎn)過程中長時間和高溫會導(dǎo)致能耗增大。因此，綜合考慮能耗及多糖穩(wěn)定性，提取溫度取80 ℃，提取時間取6 h。

圖2 提取溫度和提取時間對多糖提取率的影響

Figure 2 Effects of extracting temperature and time on the extraction of taro polysaccharides

2.1.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對芋頭多糖提取率的影響 乙醇體積分?jǐn)?shù)是也是影響多糖提取率的重要因素之一。乙醇體積分?jǐn)?shù)對芋頭多糖提取率的影響見圖3。由圖3可知，多糖提取率與乙醇體積分?jǐn)?shù)基本呈正相關(guān)，但當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)85%后，隨著乙醇濃度增加，多糖提取率基本維持不變，而且乙醇濃度高，更多的醇溶性雜質(zhì)會析出，造成后續(xù)提純困難。因此，芋頭粗多糖提取較適的乙醇體積分?jǐn)?shù)為85%。

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對多糖提取率的影響

2.2.4 芋頭粗多糖的提取工藝優(yōu)化 在以上單因素試驗的基礎(chǔ)上對提取時間、提取溫度、料液比和乙醇濃度4個因素進行L9(34) 正交試驗設(shè)計，優(yōu)化芋頭多糖的提取工藝。各因素和水平見表1，芋頭粗多糖提取工藝的正交試驗優(yōu)化及方差分析結(jié)果見表2、3。

由表2可知，影響芋頭多糖提取率的各因素的主次順序依次為B>A>D>C，即提取時間影響最顯著，提取溫度其次，乙醇體積分?jǐn)?shù)再次之，料液比影響最小。方差分析結(jié)果(表3)顯示四因素中不同提取時間、提取溫度和乙醇體積分?jǐn)?shù)在0.1和0.05顯著性水平下對芋頭粗多糖得率的影響差異顯著，不同料液比對多糖得率的影響不存在顯著差異。即當(dāng)料液比高于1∶6(g/mL)時，料液比增加基本不影響芋頭得率，考慮成本，選擇料液比1∶6(g/mL)為宜。這與文獻(xiàn)[12,15]報道其它芋頭品種的多糖提取料液比基本一致，可見不同品種不同地區(qū)芋頭多糖水溶性差異不顯著。因此提取龍香芋粗多糖的最佳組合為：A2B2C1D2，即提取溫度80 ℃、提取時間6 h、料液比1∶6(g/mL)、乙醇體積分?jǐn)?shù)85%。以此最佳工藝條件進行芋頭多糖提取的放大驗證實驗，平行3次，芋頭多糖的平均提取率為(4.92±0.18)%，結(jié)果顯示A2B2C1D2為最佳提取工藝組合。

表1 芋頭多糖提取正交試驗的因素和水平

表2 芋頭多糖提取正交試驗結(jié)果

表3 方差分析表

?F0.05(2,8)=4.46，F(xiàn)0.1(2,8)=8.64。

2.2 芋頭多糖的體外降脂效果

2.2.1 芋頭多糖與油脂的結(jié)合能力分析 以纖維素為對照，芋頭多糖不同添加量對油脂的結(jié)合效果見圖4和表4。

由圖4可知，在體外模擬人體胃腸消化道環(huán)境中，芋頭多糖對豆油的結(jié)合量隨加入量的增加而增加，當(dāng)加入的芋頭多糖大于150 mg時，結(jié)合脂肪的量達(dá)到最大量(2.45±0.09) g/g，隨后變化不大。因此，研究芋頭多糖降脂活性的推薦添加量為150 mg。由表4可知，芋頭多糖結(jié)合脂肪能力強于纖維素，后者結(jié)合脂肪能力僅為(0.76±0.05) g/g。由此推測，芋頭多糖可以通過與脂肪的結(jié)合來減少脂肪在胃腸內(nèi)的消化吸收，具有一定的降脂功能。這與劉靜娜等[20]和王凱等[21]分別報道的殼聚糖、孔石莼多糖與脂肪的結(jié)合能力研究結(jié)果基本一致。

圖4 芋頭多糖添加量對脂肪結(jié)合效果的影響

Figure 4 Changes of fat-binding capacity of taro polysaccharides with different additions

表4 芋頭多糖與纖維素結(jié)合脂肪能力比較

2.2.2 芋頭多糖與膽固醇的結(jié)合能力分析 以纖維素為對照，不同含量的芋頭多糖樣品(1～3)結(jié)合膽固醇的效果見圖5。

由圖5可知，與對照相比，芋頭多糖與膽固醇的結(jié)合能力非常小，且隨含量的增加而略有下降。由此可見，芋頭多糖的降脂機理與纖維素并不相同。已知纖維素作為一種不溶性膳食纖維，主要通過吸附膽固醇，形成一些不能被人體消化吸收的沉淀物，使膽固醇不易透過腸黏膜吸收進入血液而實現(xiàn)降低血膽固醇效果[20-21]。芋頭多糖對膽固醇的結(jié)合能力很弱，說明芋頭多糖不能抑制膽固醇膠束化的形成。其降脂的具體機制還需要進一步研究。

樣品1. 芋頭多糖7.5 mg 樣品2. 芋頭多糖15 mg 樣品3. 芋頭多糖20 mg 對照. 纖維素20 mg

圖5 芋頭多糖與纖維素對膽固醇結(jié)合能力的影響

Figure 5 Effects of cellulose and taro polysaccharides on cholesterol-binding capacity

2.2.3 芋頭多糖與膽酸鹽的體外結(jié)合能力分析 膽酸鹽是一類具有甾核結(jié)構(gòu)膽固醇衍生物，在機體對脂肪和膽固醇的消化吸收、脂溶性維生素的代謝中起重要作用[22-23]。不同添加量的芋頭多糖樣品對膽酸鹽結(jié)合能力影響以及與對照纖維素結(jié)合膽酸鹽能力的比較結(jié)果見圖6和表5。

圖6 芋頭多糖添加量對膽酸鹽結(jié)合能力的影響

Figure 6 Changes of bile salts-binding capacity of taro polysaccharides with different additions

表5 芋頭多糖與纖維素結(jié)合膽酸鹽能力比較

由圖6可知，在模擬胃腸環(huán)境中，芋頭多糖與膽酸鹽的結(jié)合能力隨含量的增加呈現(xiàn)先增后減的趨勢，此時芋頭多糖對膽酸鹽的最大結(jié)合能力為(7.11±0.36) mg/g。說明芋頭多糖對膽酸鹽具有良好的結(jié)合能力，且最適宜添加量為12.5 mg，添加過多會因多糖黏度大使得結(jié)合能力有所下降。表5表明芋頭多糖對膽酸鹽的結(jié)合能力遠(yuǎn)高于纖維素，由此可推測：與纖維素吸附膽固醇不同，芋頭多糖通過吸附膽酸鹽，抑制其在腸道的吸收并將其排出體外，從而促進膽固醇在體內(nèi)代謝轉(zhuǎn)化成膽汁酸，降低了血中的膽固醇，達(dá)到降脂效果。此外，有研究[24]顯示，一些多糖可能通過抑制脂肪酶和膽固醇酯酶的活性，從而抑制甘油三酯和膽固醇酯的水解，在一定程度上抑制脂肪和膽固醇的吸收。芋頭多糖除結(jié)合膽酸鹽外，是否也可通過抑制脂肪酶和膽固醇酯酶活性實現(xiàn)降脂活性，以及體內(nèi)降血脂活性及其具體降脂的分子機制還不清楚，尚待進一步研究。

3 結(jié)論

(1) 在單因素基礎(chǔ)上，通過正交試驗設(shè)計優(yōu)化了龍香芋多糖提取的最佳工藝條件：當(dāng)提取溫度80 ℃、提取時間6 h、料液比1∶6(g/mL)、乙醇體積分?jǐn)?shù)85%時，芋頭多糖的提取率達(dá)(4.92±0.18)%。

(2) 以不溶性膳食纖維纖維素為對照，對提取的芋頭多糖在體外模擬胃腸環(huán)境下結(jié)合脂類、膽鹽、膽固醇的能力進行了比較，發(fā)現(xiàn)多糖與脂肪、膽酸鹽、膽固醇均具有一定結(jié)合能力，對脂肪和膽酸鹽的結(jié)合能力高于纖維素，而對膽固醇的結(jié)合能力卻遠(yuǎn)低于纖維素。表明芋頭多糖具有一定的體外降脂效果，為開發(fā)高附加值營養(yǎng)保健芋頭產(chǎn)品提供了一定的理論依據(jù)。

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Optimization of polysaccharide extraction from taro and its binding capacities of lipid and bile salts in vitro

LIUPingQIXing-puLIUJingYAOFangLIZhi-fang

(SchoolofFoodScienceandTechnology,JiangsuAgri-AnimalHusbandryVocationalCollege,Taizhou,Jiangsu225300,China)

The extraction technology of water-soluble polysaccharides in fresh taro was investigated in this paper. Using simulated conditions of human digestioninvitro, its fat-binding, cholesterol-binding and bile salts-binding capacities were studied in order to evaluate its potential hypocholesterolemic activityinvitro. The results showed that the highest extraction efficiency of taro polysaccharide could be obtain under the conditon of using solid-liquid ratio at 1∶6, reacting at 80 ℃ for 6 h with 85% ethanol, and the extraction ratio reaches (4.92±0.18)%. Taro water-soluble polysaccharides exhibited much higher binding capacities of both fat and bile acid, while much lower one of cholesterol, compared to cellulose. The above results revealed that taro water-soluble polysaccharides could potentially alleviate the hyperlipidemia.

Taro; polysaccharide; lipid-lowering in vitro; bile acid; cholesterol

泰州市農(nóng)業(yè)科技支撐項目(編號：TN2013001)；江蘇省青藍(lán)工程科技創(chuàng)新團隊培養(yǎng)對象

劉萍，女，江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院副教授，博士。

李志方(1972—)，男，江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院副教授，碩士。E-mail：292510731@qq.com

2016-08-29

10.13652/j.issn.1003-5788.2016.10.031