效碧亮 楊轉萍 羅麗媛 孫 靜

(蘭州理工大學技術工程學院，甘肅 蘭州 730050)

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南瓜醪糟發(fā)酵液對α-葡萄糖苷酶的抑制作用

效碧亮 楊轉萍 羅麗媛 孫 靜

(蘭州理工大學技術工程學院，甘肅 蘭州 730050)

以糯米和南瓜為原料，安琪酒曲為發(fā)酵菌劑，采用半固態(tài)發(fā)酵法制作南瓜醪糟，比較分析南瓜醪糟與純米醪糟對α-葡萄糖苷酶的抑制作用，研究發(fā)酵液不同稀釋倍數(shù)、發(fā)酵時間、南瓜加入量對α-葡萄糖苷酶抑制作用的影響，同時測定南瓜醪糟的部分理化指標。結果表明，南瓜醪糟發(fā)酵液對α-葡萄糖苷酶具有較強的抑制作用，原液抑制率可達80%以上，且抑制活性較純米醪糟發(fā)酵液強；發(fā)酵液不同稀釋倍數(shù)、發(fā)酵時間及南瓜加入量對α-葡萄糖苷酶的抑制作用均有極顯著影響，發(fā)酵時間為48 h時，抑制效果最好，南瓜加入量以米∶南瓜2∶1(g/g)為宜；南瓜醪糟中多糖為2.87 mg/g，還原糖為3.88%，VC為0.024 mg/100 g，蛋白質為0.071 2 mg/g，酒精為2 mL/g，pH為3.75。

南瓜醪糟；α-葡萄糖苷酶；抑制；成分含量

α-葡萄糖苷酶抑制劑在防治糖尿病、肥胖癥、抗腫瘤和抗病毒等方面具有重要的作用[1]，尤其在治療糖尿病方面，是一類新型的抗糖尿病藥物。葡萄糖苷酶抑制劑的種類較多，按照其來源可以分為三類：微生物的代謝產物中得到，天然產物中提取以及化學法合成。但市場上降糖藥物總體價格昂貴，且副作用明顯。

因此，食療是最安全、最經濟、最放心的方法。目前資料表明具有抑制α-葡萄糖苷酶活性物質的食材有大豆(皂苷[2])、苦瓜[3]、山藥[3]、苦蕎(提取物)[4]和醪糟發(fā)酵液[5]等。相對大豆、苦瓜、山藥和苦蕎等的提取物而言，醪糟發(fā)酵液制作方便、經濟實惠，且抑制效果較好，為70%左右。魯戰(zhàn)會等[5]曾對純米醪糟發(fā)酵液抑制α-葡萄糖苷酶的作用進行過研究，但未見南瓜醪糟發(fā)酵液對α-葡萄糖苷酶的抑制作用的相關報道。為提高醪糟發(fā)酵液對α-葡萄糖苷酶的抑制作用，本課題組大膽嘗試改變醪糟發(fā)酵原料，將具有降糖作用的南瓜作為醪糟發(fā)酵原料之一，研究南瓜醪糟發(fā)酵液對α-葡萄糖苷酶的抑制作用，提高其抑制率。南瓜作為主要原料制作醪糟不僅打破了傳統(tǒng)醪糟制作原料的單一性，同時可向醪糟中引入更多生物活性物質，如南瓜多糖、鈷、Vc、葫蘆巴堿[6]等，其中南瓜多糖、鈷均具有降糖作用[7]。鑒于此，本研究主要對南瓜醪糟降血糖特性做初步研究，比較南瓜醪糟與純米醪糟對α-葡萄糖苷酶的抑制作用及部分成分，旨在進一步證實醪糟發(fā)酵液可抑制α-葡萄糖苷酶這一理論，為醪糟發(fā)酵液抑制α-葡萄糖苷酶的相關理論研究向前邁步，同時為南瓜醪糟今后能成為輔助降血糖的功能性食品的開發(fā)與研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料、試劑與設備

1.1.1 原材料

南瓜：黃金二號，市售；

糯米：市售；

酒曲：安琪酵母股份有限公司。

1.1.2 試劑

α-葡萄糖苷酶(100 U)和p-NPG(對硝基苯酚α-葡萄糖糖苷)：美國Sigma公司；

牛血清蛋白：美國Roche公司；

Na2CO3、磷酸二氫鈉：分析純，天津市鼎盛鑫化工有限公司；

磷酸鹽緩沖液：準確稱取7.801 5 g磷酸二氫鈉，用蒸餾水溶解后定容至1 000 mL，所得溶液濃度為50 mmol/L；準確稱取8.955 g磷酸氫二鈉，用蒸餾水溶解后定容至500 mL，所得溶液濃度為50 mmol/L；取565 mL 50 mmol/L的磷酸二氫鈉和435 mL 50 mmol/L的磷酸氫二鈉充分混合，所得溶液為pH 6.7的磷酸鹽緩沖液；

α-葡萄糖苷酶溶液：取α-葡萄糖苷酶100 U，牛血清蛋白877.2 mg，溶于50 mmol/L pH 6.7磷酸鹽緩沖液中，用緩沖液定容至438 mL，所得酶濃度為22.8 U/100 mL；

對硝基苯酚α-葡萄糖苷溶液(p-NPG)：取p-NPG 0.150 7 g溶于磷酸鹽緩沖液中，用緩沖溶液定容至500 mL，得10 mmol/Lp-NPG溶液。

1.1.3 設備

pH計：PHS-3C型，上海精密科學儀器有限公司；

高速離心機：TGL16M型，湖南凱達科學儀器有限公司；

紫外分光光度計：UV5100B型，上海元析儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 醪糟發(fā)酵液的制備

(1) 南瓜醪糟發(fā)酵液：稱取糯米20 g于清水中浸泡8 h，取出，加入切碎的南瓜10 g同糯米一起蒸20 min(同時將浸泡糯米水煮沸晾涼后待用)，之后轉移到燒杯中迅速冷卻至30 ℃左右。稱取酒曲0.12 g溶于30 mL煮沸晾涼的泡米水中，緩緩加入盛有糯米和南瓜的燒杯中攪拌均勻，蓋好保鮮膜于30 ℃水浴中發(fā)酵48 h。取發(fā)酵液20 mL，煮沸15 min，6 000 r/min離心10 min，取上清液置于4 ℃冰箱中待用。

(2) 純米醪糟發(fā)酵液：不加南瓜，其它發(fā)酵工藝相同。

1.2.2 酶活抑制試驗 取50 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.7)100 μL，22.8 U/100 mLα-葡萄糖苷酶溶液150 μL，樣品40 μL，37 ℃保溫5 min后，加入10 mmol/Lp-NPG 750 μL，于37 ℃反應10 min后，最后加入2 mL 0.1 mol/L Na2CO3終止反應。測定400 nm處的吸光值。試驗結果記錄為B。以不加樣品作為空白組，結果記為A。其中試驗組的調零操作是將酶替換為滅活酶；而空白組是將酶和樣品都以緩沖液替代。抑制率按式(1)計算：

(1)

式中：

W——抑制率，%；

A0——不加樣品空白組的吸光值；

A1——加樣品試驗組的吸光值。

1.2.3 不同稀釋倍數(shù)的醪糟發(fā)酵液對α-葡萄糖苷酶的抑制效果 為了研究不同稀釋倍數(shù)發(fā)酵液對α-葡萄糖苷酶的抑制效果，以及比較南瓜醪糟與純米醪糟發(fā)酵液對α-葡萄糖苷酶的抑制效果，對南瓜醪糟發(fā)酵與純米醪糟發(fā)酵液均進行了0，20，40，60，80，100倍稀釋，并測定各處理樣對α-葡萄糖苷酶的抑制效果。

1.2.4 不同發(fā)酵時間的醪糟發(fā)酵液對α-葡萄糖苷酶的抑制效果 分別取發(fā)酵了24，30，36，42，48，54 h的南瓜醪糟發(fā)酵液，測定其對α-葡萄糖苷酶的抑制效果。

1.2.5 不同南瓜加入量的醪糟發(fā)酵液對α-葡萄糖苷酶的抑制效果 為了確定南瓜加入量是否對α-葡萄糖苷酶的抑制效果具有顯著影響，設計了糯米∶南瓜(g/g)梯度分別為：1∶0，4∶1，3∶1，2∶1，1∶1，并分別測定了對α-葡萄糖苷酶的抑制效果。

1.2.6 成分測定

(1) 多糖的測定：采用苯酚—硫酸法[8]。

(2) 還原糖的測定：采用3,5-二硝基水楊酸法[9]。

(3) 蛋白質的測定：采用考馬斯亮藍法[9]。

(4) VC的測定：采用2,4-二硝基苯肼法[10]203-204。

(5) 酒精含量的測定：密度瓶法[10]30-31。

(6) 酸度的測定：采用pH計[10]211-212。

每次測定重復3次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS軟件處理。

2 結果與分析

2.1 不同稀釋倍數(shù)的南瓜醪糟發(fā)酵液對α-葡萄糖苷酶的抑制效果

由圖1可知，南瓜醪糟發(fā)酵液和純米醪糟發(fā)酵液對α-葡萄糖苷酶活性均具有較好的抑制作用，南瓜醪糟發(fā)酵液抑制率達80%以上，純米醪糟發(fā)酵液抑制率約為70%，前者比后者抑制率高出了10%。經方差分析表明稀釋度對兩種發(fā)酵液抑制率均具有極顯著的影響，隨著稀釋度增加，兩種醪糟發(fā)酵液對酶活抑制率均呈下降趨勢，然而南瓜醪糟發(fā)酵液的抑制效果顯著大于純米醪糟，且其抑制率約以10%的速率下降，而純米醪糟約以13%的速率下降，南瓜醪糟發(fā)酵液中抑制劑活性成分受稀釋倍數(shù)的影響較純米醪糟小，進一步說明南瓜作為醪糟原料可顯著提高其發(fā)酵液抑制α-葡萄糖苷酶活性的效果。

不同字母表示差異極顯著，P<0.01

Figure 1 The inhibition effect of the different dilute concentration of Laozao onα-glucosidase

2.2 不同發(fā)酵時間的醪糟發(fā)酵液對α-葡萄糖苷酶的抑制效果

由圖2得知，在其他條件不變的情況下，隨著發(fā)酵時間的延長，南瓜醪糟和純米醪糟發(fā)酵液對α-葡萄糖苷酶的抑制作用均呈上升趨勢，南瓜醪糟發(fā)酵液抑制率從40.712%增大到81.396%，而純米醪糟的從20.523%增大到70.176%，進一步說明南瓜醪糟發(fā)酵液對α-葡萄糖苷酶的抑制效果更好，同時表明抑制α-葡萄糖苷酶的活性成分在醪糟發(fā)酵過程中也會產生。為了確定南瓜醪糟發(fā)酵液最佳發(fā)酵時間，對結果進行了方差分析和多重比較，結果表明發(fā)酵時間對南瓜醪糟發(fā)酵液抑制α-葡萄糖苷酶的活性有極顯著影響，圖2表明發(fā)酵48 h和54 h的抑制作用無顯著差異，故抑制效果最好的發(fā)酵時間可選擇48 h，這一結果與南瓜醪糟發(fā)酵最佳發(fā)酵時間相吻合。

不同字母表示差異極顯著，P<0.01

Figure 2 The inhibition effect of the different fermented time of pumpkin Laozao onα-glucosidase

2.3 不同南瓜量的醪糟發(fā)酵液對α-葡萄糖苷酶的抑制效果

經方差分析表明醪糟中南瓜加入量對α-葡萄糖苷酶的抑制作用具有極顯著影響，再次證實了南瓜的加入量可增強醪糟發(fā)酵液對α-葡萄糖苷酶的抑制作用。圖3表明，隨著南瓜加入量的增加，醪糟發(fā)酵液對α-葡萄糖苷酶的抑制作用呈先上升后下降趨勢，當南瓜加入量為糯米∶南瓜2∶1(g/g)時，發(fā)酵液抑制率達到最大。這一結果與南瓜醪糟發(fā)酵南瓜最佳加入量相吻合，由于醪糟的發(fā)酵主要靠糯米完成，若南瓜加入量太多，產品發(fā)酵品質較差，至于其抑制率會下降具體原因需后期進一步研究。

2.4 成分測定

由表1可知，醪糟中南瓜的加入豐富了其營養(yǎng)成分，例如南瓜多糖和維生素，其中南瓜醪糟多糖含量明顯高于純米醪糟，這主要是南瓜多糖的含量，由于南瓜多糖具有很好的降血糖作用，所以在對α-葡萄糖苷酶的抑制作用方面南瓜醪糟比純米醪糟更穩(wěn)定，抑制劑活性更高。從兩者所含還原糖的量來看，南瓜醪糟為3.88%，純米醪糟為8.67%，前者比后者低4.79%，有利于高血糖患者使用。其中酒精和pH值兩者無較大差異，說明南瓜的加入對二者影響較小。

不同字母表示差異極顯著，P<0.01

樣品多糖/(mg·g-1)還原糖/%VC/(10-2mg·g-1)蛋白質/(mg·g-1)酒精/(mL·g-1)pH值南瓜醪糟2.87±0.063.88±0.070.02±0.000.07±0.002.09±0.003.81±0.14純米醪糟2.25±0.018.67±0.20-0.04±0.002.00±0.003.75±0.14南瓜 6.08±0.081.24±0.029.79±0.040.14±0.00--

3 結論

研究結果表明南瓜醪糟發(fā)酵液對α-葡萄糖苷酶具有極強的抑制作用，抑制率達80%以上，且其抑制率較純米醪糟發(fā)酵液高約10%。南瓜醪糟部分成分的測定再次證實了南瓜作為醪糟的原料之一不僅可豐富醪糟的營養(yǎng)成分和顏色，降低原糖含量，還進一步增強了抑制α-葡萄糖苷酶的穩(wěn)定性和活性，此研究結果可為南瓜醪糟今后能成為輔助降血糖功能性食品的開發(fā)與研究提供理論支撐。然而，對南瓜醪糟中降糖活性物質定性、定量以及理化性質和降糖的機理卻需更深入研究，為南瓜醪糟發(fā)酵液抑制α-葡萄糖苷酶的機理提供更有力的理論依據(jù)。

[1] BOW LIN T L, MCKOWN B J, KANG M S, et al. Potentiation of human lymphokine -activated killer cell activity by swainsonine, an inhibitor of glycoprotein processing[J]. Cancer Research, 1989, 49: 4 109-4 115.[2] 全吉淑, 尹學哲, 金明, 等. 大豆皂苷對α-葡萄糖苷酶抑制作用的研究[J]. 中藥材, 2003, 26(9): 654-656.

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The inhibition effect onα-glucosidase from fermented supernatant of pumpkin laozao

XIAOBi-liangYANGZhuan-pingLUOLi-yuanSNUJing

(CollegeofTechnologyandEngineering,LanzhouUnivercityofTechnology,Gansu,Lanzhou730050,China)

Pumpkin with glutinous rice as raw material, lao-zao was made by semi solid fermentation. The inhibition of pumpkin lao-zao and pure rice lao-zao was compared, and the inhibition effect of fermented supernatant of the different concentrations and different fermented time and different adding amount of pumpkin were studied. Then, some physical and chemical indexes were determined. The result showed that pumpkin Lao-zao had significant inhibition effect on α-glucosidase, the inhibition rate of primal was higher than 75 percent, and the active of inhibitor of pumpkin Lao-zao was higher than pure rice Lao-zao. The fermented supernatant of the different concentrations and different fermented time and different adding amount of pumpkin had extremely significant effect on the inhibition effect ofα-glucosidase. Moreover, in the forty-eight hour，the inhibition effect was highest, the ratio of glutinous rice and pumpkin was appropriate as 2∶1(g/g). In pumpkin Lao-zao, polysaccharide is 2.87 mg/g, reducing sugar is 3.88%,VCis 0.024 mg/100 g, protein is 0.071 2 mg/g, alcohol is 2 mL/g, pH is 3.75.

the pumpkin Lao-zao;α-glucosidase; inhibition; composition content

甘肅省教育廳項目(編號：2015B-218)

效碧亮(1984—)，女，蘭州理工大學技術工程學院講師，碩士。E-mail: xiaobiliang840824@126.com

2016—08—08

10.13652/j.issn.1003-5788.2016.10.002