龍 海, 李芳榮, 程穎慧， 謝泳桂， 李一農(nóng)*

1深圳出入境檢驗檢疫局,廣東 深圳 518001；2深圳市檢驗檢疫科學(xué)研究院， 深圳市外來有害生物檢測技術(shù)研發(fā)重點實驗室，廣東 深圳 518045

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日本仙人掌中仙人掌孢囊線蟲形態(tài)和分子鑒定

龍 海1,2, 李芳榮1, 程穎慧1， 謝泳桂1， 李一農(nóng)1*

1深圳出入境檢驗檢疫局,廣東 深圳 518001；2深圳市檢驗檢疫科學(xué)研究院， 深圳市外來有害生物檢測技術(shù)研發(fā)重點實驗室，廣東 深圳 518045

【背景】近年來,種苗等植物通過郵寄包裹進(jìn)入我國的數(shù)量越來越多，有害生物隨之入侵的風(fēng)險與日俱增。深圳口岸曾多次從入境包裹中截獲孢囊線蟲、根結(jié)線蟲等?！痉椒ā?015年10月12日，深圳口岸在對日本郵寄來的仙人掌進(jìn)行檢疫時，從其根部發(fā)現(xiàn)了一種孢囊線蟲。對該線蟲進(jìn)行分離，結(jié)合形態(tài)學(xué)和28S rDNA序列擴(kuò)增并測序的方法，對截獲的線蟲進(jìn)行鑒定?！窘Y(jié)果】分離到了一種孢囊線蟲,其形態(tài)特征與仙人掌孢囊線蟲基本吻合，28S rDNA序列與GenBank 數(shù)據(jù)庫中登錄號為DQ328702的德國群體的同源性高達(dá)99%。因此，判定截獲的線蟲為仙人掌孢囊線蟲?！窘Y(jié)論與意義】入境包裹檢疫需要引起口岸檢疫部門的高度重視。采用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)相結(jié)合的方法對植物寄生線蟲進(jìn)行鑒定，可以得到更加準(zhǔn)確的結(jié)果。

仙人掌孢囊線蟲； 郵檢； 形態(tài)學(xué)； 分子鑒定

仙人掌孢囊屬線蟲Cactodera隸屬線蟲門Nematoda側(cè)尾腺綱Secernentea墊刃目Tylenchida異皮科Heteroderidae異皮亞科Heteroderinae，是植物根系的一類固定性內(nèi)寄生線蟲(謝輝,2000)，目前已報道14個種(羅諾德·佩里和莫里斯·莫恩斯,2011)，可通過種苗進(jìn)行遠(yuǎn)距離傳播。仙人掌孢囊線蟲最早在荷蘭的仙人掌中被發(fā)現(xiàn)，并被描述為甜菜孢囊線蟲Heteroderaschachtii，1941年Filipjev和Schuurmans Stekhoven把該種線蟲命名為Heteroderacacti,1978年又更名為Cactoderacacti(Esser,1992)。該線蟲在五大洲都有分布，我國曾在廈門(潘滄桑等,1997)和遼寧(Duanetal.,2012)發(fā)現(xiàn)該線蟲。

2015年10月12日，深圳口岸在對日本郵寄來的仙人掌進(jìn)行檢疫時，從其根部發(fā)現(xiàn)了一種孢囊線蟲，本試驗對其形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)特征進(jìn)行鑒定，以期為該線蟲的檢疫與防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與線蟲分離

取仙人掌的根和根際土壤約500 g，放入封口袋中，做好標(biāo)簽，送至實驗室。取約250 g樣品，用雙層紗布包好，置于漏斗中，加入清水至剛好沒過樣品，25 ℃放置12～24 h(毛小芳等，2004)。用凹面皿接取線蟲懸浮液10 mL,在體式顯微鏡下檢查，發(fā)現(xiàn)2齡幼蟲后，用直接過篩法分離其孢囊(Subbotinetal.,2010)。

1.2 形態(tài)學(xué)鑒定

挑取線蟲制成臨時玻片，在光學(xué)顯微鏡(Zeiss Zmager MI)下觀察，用Zeiss AxioCam HRC數(shù)碼相機(jī)對線蟲進(jìn)行拍照，并用AxioVision 4.8.2自帶的測量軟件和de Man公式法(de Man,1884)對雌蟲進(jìn)行測計。

1.3 分子生物學(xué)檢測

提取單條2齡幼蟲的DNA，方法參見Longetal.(2006)，28S rDNA 基因PCR擴(kuò)增參見顧建鋒等(2013)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送深圳華大基因有限公司測序，用BioEdit 7.0 (Hall,1999)對序列進(jìn)行編輯，在GenBank 數(shù)據(jù)庫 (www.ncbi.nlm.nih.gov)中進(jìn)行BLAST分析，用MEGA 4.0(Tamuraetal.,2007)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)描述

2齡幼蟲：蟲體蠕蟲狀，唇區(qū)輕微縊縮；口針基部球圓形，頭架明顯(圖1A)；側(cè)區(qū)有4條刻線，食道腺充滿體腔(圖1B)；尾呈細(xì)長圓錐形，末端鈍圓，具明顯的透明區(qū)(圖1C)。

雌蟲：蟲體呈檸檬形到近球形，珍珠白色、黃色或金色；頸部縊縮，陰門錐凸出。

孢囊：通常為檸檬形，有時圓形，頸和陰門凸出，淺褐色或中等褐色(圖1D)。陰門凸位于膜孔下面緊接膜孔的位置，有時不明顯；陰門錐無囊泡和下橋，有陰門小齒和環(huán)膜孔。

卵：橢圓形,長度約為寬度的2倍，卵殼刻點明顯(圖1D)。

雄蟲：未見。

圖1 孢囊線蟲形態(tài)

2.2 形態(tài)測量值

2齡幼蟲形態(tài)測量值如表1所示。

依據(jù)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《仙人掌孢囊屬線蟲檢疫鑒定方法》(國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局，2015)，本試驗分離到的孢囊線蟲日本群體形態(tài)特征及2齡幼蟲測量值與文獻(xiàn)記述的仙人掌孢囊線蟲基本一致。

2.3 分子生物學(xué)特征分析

用引物D2A/D3Br對單條2齡幼蟲進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果見圖2，擴(kuò)增產(chǎn)物長750 bp左右(GenBank登錄號分別為KX230467-KX230473)。BLAST分析結(jié)果表明，孢囊線蟲日本群體的28S rDNA基因序列與GenBank登錄號為DQ328702的德國群體的同源性高達(dá)99%?；?8S rDNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)表明，孢囊線蟲日本群體和德國群體位于一個進(jìn)化枝上，親緣關(guān)系最近。

綜合形態(tài)學(xué)比較和分子生物學(xué)分析得出，從日本郵寄的仙人掌中截獲的孢囊線蟲為仙人掌孢囊線蟲Cactoderacacti。

圖2 2齡幼蟲PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

圖3 28S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

通過形態(tài)描述和測量值比較，初步判斷從日本郵寄的仙人掌中截獲的線蟲為仙人掌孢囊線蟲。與其他地區(qū)群體(潘滄桑等,1997； Adam,1932; Golden & Raski,1977)相比，日本群體2齡幼蟲的b值、口針長和DGO的變化較大，其余測量值的變化相對較小。為了對形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果進(jìn)行驗證，本試驗分析了2齡幼蟲的28S-D2/D3區(qū)的序列和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，結(jié)果表明該日本群體與仙人掌孢囊線蟲的親緣關(guān)系最近，因此將其鑒定為仙人掌孢囊線蟲。

寄主植物被仙人掌孢囊線蟲侵染后，地上部分表現(xiàn)出生長緩慢、矮化、萎蔫、葉片褪綠等癥狀，地下根組織出現(xiàn)短小、稀疏、分叉等癥狀，但不會形成根瘤。仙人掌孢囊線蟲的寄主包括仙人掌科Cactaceae、傘形科Umbelliferae、大戟科Euphorbiaceae、景天科Crassulaceae、?？芃oraceae、夾竹桃科Apocynaceae、蘿藦科Asclepiadaceae、菊科Asteraceae和木犀科Oleaceae的部分種、屬(國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局，2015)。目前，有關(guān)該線蟲對寄主植物的危害程度還不清楚，暫未被列入我國進(jìn)境植物檢疫性有害生物名錄。

隨著我國生態(tài)文明建設(shè)的推進(jìn)，大量的種苗和觀賞植物通過貨物進(jìn)口、旅客攜帶和包裹郵寄等途徑進(jìn)入我國。2014年，我國進(jìn)境郵檢截獲檢疫性線蟲4種7批次(張靜秋等,2015)，也多次從德國和意大利的郵件中截獲仙人掌孢囊線蟲。植物線蟲通過郵寄渠道入侵我國的風(fēng)險日益嚴(yán)峻。因此，口岸除了做好進(jìn)境種苗貨檢和旅客攜帶物的檢疫外，還需加強(qiáng)對郵寄包裹的檢疫。

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(責(zé)任編輯:楊郁霞)

Morphological and molecular identification of the plant-parasitic nematodeCactoderacacti, intercepted in shipments ofOpuntiastrictafrom Japan

Hai LONG1,2， Fang-rong LI1, Ying-hui CHENG1, Yong-gui XIE1, Yi-nong LI1*

1ShenzhenEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau,Shenzhen,Guangdong518001,China;2ShenzhenKeyLaboratoryofInspectionResearch&DevelopmentofAlienPests,ShenzhenAcademyofInspectionandQuarantine,Shenzhen,Guangdong518045,China

【Background】 In recent years, the number of seedlings imported by parcel post increased sharply， increasing the potential risk of entry of new pests. Shenzhen port has repeatedly intercepted cyst and root knot nematodes from such shipments. 【Method】 In October 12, 2015, Shenzhen port found a kind of cyst nematode in the cactus shipments from Japan. Then the nematodes were identified with morphological methods and 28S rDNA sequence amplification and sequencing. 【Result】 Extracted nematode life forms included females, cysts, juveniles and eggs. Morphological characteristics of the intercepted cyst nematode were basically consistent withCactoderacacti, and the 28S rDNA of which matched well (99% similarity) with those of theC.cactideposited in GenBank (accession number DQ328702). According to the morphological and molecular data, the intercepted cyst nematode was confirmed to be the cactus cyst nematode,C.cacti, so far not known to occure in China. 【Conclusion and significance】 Inspection and quarantine departments need to pay more attention to the parcel post shipments containing plant material. Plant parasitic nematodes identified with the combination of morphological and molecular methods, will yield more accuracy.

Cactoderacacti; quarantine of imported parcel post; morphology; molecular identification

2016-03-04 接受日期(Accepted)： 2016-06-03

龍海， 男， 高級農(nóng)藝師。 研究方向： 植物線蟲檢疫。 E-mail: longsi1979@163.com

*通訊作者(Author for correspondence), E-mail: li_yinong@126.com

10. 3969/j.issn.2095-1787.2016.04.011