吳海洪，李曉娟，莫少偉，莊麗穎

(海南省人民醫(yī)院，?？?570311)

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吉非替尼對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞PC-9增殖的抑制作用及其機(jī)制

吳海洪，李曉娟，莫少偉，莊麗穎

(海南省人民醫(yī)院，?？?570311)

目的 探討吉非替尼對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞PC-9增殖的抑制作用及其機(jī)制。方法 將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的PC-9細(xì)胞隨機(jī)分為四組，低劑量組、中劑量組、高劑量組分別給予1、10、100 μmol/L吉非替尼干預(yù)8 h，對(duì)照組給予生理鹽水。采用MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖情況，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)因子Bax、Bcl2、Caspase3、Caspase9 mRNA及MEK/ERK信號(hào)傳導(dǎo)通路相關(guān)因子Ras、Raf、MEK、ERK1/2 mRNA表達(dá)，免疫印跡法檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl2、Caspase3和Caspase9及通路相關(guān)蛋白R(shí)as、Raf、MEK及ERK1/2表達(dá)。結(jié)果 吉非替尼能夠抑制PC-9細(xì)胞增殖，且其抑制率隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)和作用濃度升高而提高(P均<0.01)；與對(duì)照組比較，低、中、高劑量組Ras、Raf、MEK、ERK1/2、Bcl2 mRNA及蛋白表達(dá)明顯降低，Bax、Caspase3、Caspase9 mRNA及蛋白表達(dá)明顯升高，且低、中、高劑量組組間兩兩比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均<0.01)。結(jié)論 吉非替尼可抑制PC-9細(xì)胞增殖、促進(jìn)其凋亡；其作用機(jī)制可能與抑制MEK/ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活有關(guān)。

非小細(xì)胞肺癌；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡；吉非替尼；細(xì)胞外信號(hào)調(diào)控激酶

近年來肺癌的發(fā)生率和病死率有逐年升高的趨勢(shì)[1～5]。目前非小細(xì)胞肺癌的發(fā)病機(jī)制尚不明確，且臨床上無特效治療藥物。吉非替尼是選擇性的表皮生長(zhǎng)因子受體抑制劑，對(duì)來源于上皮的實(shí)體惡性腫瘤具有較好的療效[6]。2013年1月～2015年3月，我們觀察了吉非替尼對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞PC-9增殖的抑制作用，旨在為其臨床應(yīng)用與新藥研發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 PC-9細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone公司；胎牛血清購(gòu)自杭州四季青公司；引物由上海生工協(xié)助合成；細(xì)胞培養(yǎng)板購(gòu)自Gibico公司；胰蛋白酶購(gòu)自Sigma Aldrich公司；兔抗Bax及Bcl2單克隆抗體購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；兔抗Caspase3及Caspase9單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)R&D公司；兔抗Ras、Raf單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；兔抗MEK及ERK1/2單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；吉非替尼購(gòu)自美國(guó)Sigma Aldrich公司；其余試劑為市售分析純。儀器：熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Biotek公司；垂直蛋白電泳儀及轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)ABI公司；高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組及處理 PC-9細(xì)胞于5%CO2、飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至生長(zhǎng)狀態(tài)良好，將細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組，每組細(xì)胞數(shù)量1×106個(gè)。對(duì)照組給予生理鹽水，低劑量組給予1 μmol/L吉非替尼組培養(yǎng)8 h，中劑量組給予10 μmol/L吉非替尼培養(yǎng)8 h，高劑量組給予100 μmol/L吉非替尼培養(yǎng)8 h。

1.3 PC-9細(xì)胞增殖抑制率檢測(cè) 采用MTT法。將對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后用含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，并接種于細(xì)胞培養(yǎng)板于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。各組細(xì)胞恢復(fù)狀態(tài)后經(jīng)相應(yīng)濃度藥物處理后，棄去培養(yǎng)液并加入適量MTT繼續(xù)于適宜條件下培養(yǎng)。然后在細(xì)胞中加入二甲基亞砜并劇烈振蕩消化細(xì)胞，酶標(biāo)儀檢測(cè)培養(yǎng)后細(xì)胞培養(yǎng)板各孔的吸光度值(OD值)。細(xì)胞增殖抑制率=(對(duì)照組OD值-試驗(yàn)組OD值)/對(duì)照組OD值×100%。

1.4 細(xì)胞凋亡相關(guān)因子及MEK/ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)因子mRNA檢測(cè) 采用熒光定量PCR法檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)因子Bax、Bcl2、Caspase3、Caspase9 mRNA及MEK/ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)因子Ras、Raf、MEK、ERK1/2 mRNA表達(dá)。mRNA提取制備及cDNA的逆轉(zhuǎn)錄合成過程均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。熒光定量PCR的擴(kuò)增條件為：95 ℃變性10 min；94 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，共擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)。熒光定量PCR的反應(yīng)體系為20 μL，其中cDNA模板2 μL、上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL、2.5×SYBR Green(TianGen)8 μL、超純水9 μL。引物由上海生工合成。mRNA相對(duì)表達(dá)量以2-ΔΔCt表示，ΔCt=目的基因Ct-內(nèi)參基因Ct。

1.5 細(xì)胞凋亡相關(guān)因子及MEK/ERK通路相關(guān)蛋白檢測(cè) 采用Western blottino法檢測(cè)細(xì)胞凋亡蛋白Bax、Bcl2、Caspase3、Caspase9及MEK/ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)蛋白R(shí)as、Raf、MEK及ERK1/2表達(dá)。將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的PC-9細(xì)胞經(jīng)藥物處理后用冰冷的無菌PBS沖洗3次，每次10 min，按照試劑盒說明書提取總蛋白。各組細(xì)胞總蛋白提取后與5×SDS混合，并在沸水中煮沸5 min，作為樣品制備液。將等量的樣品制備液進(jìn)行垂直的SDS-PAGE蛋白電泳(電泳條件：濃縮膠電壓維持70 V，分離膠電壓維持80～120 V)，電泳至溴酚藍(lán)移動(dòng)到PAGE膠底部后停止。小心剝離PAGE膠后采用半干法轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)至PVDF膜上(轉(zhuǎn)膜條件：電流300 mA，轉(zhuǎn)膜120 min)，用5%脫脂奶粉制備液在4 ℃條件下封閉1 h。將封閉過的纖維素膜與一抗(稀釋度為1∶200)在20 ℃條件下充分雜交240 min，PBS沖液漂洗(漂洗3次，每次10 min)；將與一抗雜交后的纖維素膜與二抗(1∶250)雜交，雜交時(shí)間為240 min。PVDF膜用無菌PBS漂洗3次后進(jìn)行顯色、定影和拍照。蛋白相對(duì)表達(dá)量=靶蛋白表達(dá)量/內(nèi)參β-actin表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組不同時(shí)間點(diǎn)PC-9細(xì)胞增殖抑制率比較 見表1。

表1 各組不同時(shí)間點(diǎn)PC-9細(xì)胞增殖抑制率比較±s)

注：與低劑量組比較，*P<0.05，△P<0.01；與中劑量組比較，#P<0.01。

2.2 各組細(xì)胞凋亡相關(guān)因子及MEK/ERK通路相關(guān)因子mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 見表2。

表2 各組細(xì)胞凋亡相關(guān)因子及MEK/ERK通路相關(guān)因子mRNA相對(duì)表達(dá)量比較±s)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05，△P<0.01；與低劑量組比較，#P<0.05，▲P<0.01；與中劑量組比較，●P<0.01。

2.3 各組細(xì)胞凋亡相關(guān)因子及MEK/ERK通路相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 見表3。

表3 各組細(xì)胞凋亡相關(guān)因子及MEK/ERK通路相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量比較±s)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05，△P<0.01；與低劑量組比較，#P<0.05，▲P<0.01；與中劑量組比較，●P<0.01。

3 討論

ERK是目前最早發(fā)現(xiàn)的絲裂原活化蛋白激酶，該信號(hào)通路參與了幾乎所有細(xì)胞內(nèi)的生理性及病理性過程，如生長(zhǎng)、增殖、轉(zhuǎn)移、分化、發(fā)育及凋亡等[9]。MEK/ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是由一系列關(guān)鍵蛋白參與的，主要包括Ras、Raf、MEK及ERK等[10]。當(dāng)細(xì)胞受到外部刺激后或外部細(xì)胞結(jié)合到細(xì)胞表面受體后，ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被激活或抑制，并調(diào)控細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)，進(jìn)一步影響細(xì)胞的生理狀態(tài)。以往的研究證實(shí)，ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與了腫瘤細(xì)胞的各種生理學(xué)過程，如增殖、分化、轉(zhuǎn)移、血管生成以及凋亡過程，并可作為腫瘤治療的靶點(diǎn)[11]。蔡巧等[12]研究發(fā)現(xiàn)，絲裂原活化蛋白激酶的激酶抑制劑CQN能夠在體外明顯抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549的增殖，且能夠濃度依賴性地抑制ERK1/2的磷酸化和促進(jìn)細(xì)胞凋亡過程，表現(xiàn)出較強(qiáng)的體外抗腫瘤活性。以往的研究也發(fā)現(xiàn)抑制PI3K/AKT和MEK/ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路均能抑制惡性腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的水平、垂直和定向遷移，且其抑制作用具有濃度依賴性，同時(shí)，PI3K/AKT信號(hào)通路對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞遷移的影響比MEK/ERK信號(hào)通路明顯。在MEK抑制劑AZD8330對(duì)多發(fā)性骨髓瘤抗腫瘤作用的初步研究中也證實(shí)MEK抑制劑AZD8330可抑制骨髓瘤細(xì)胞NCI-H929和IM9增殖，使細(xì)胞周期阻滯于G1期，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[13]。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的程序化的死亡過程，是維系細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要過程，由一系列的細(xì)胞凋亡蛋白所介導(dǎo)，如Bax/Bcl2蛋白及Caspase蛋白家族[14,15]。上述細(xì)胞凋亡蛋白在多種抗腫瘤藥物抑制腫瘤的過程中均表現(xiàn)為激活或表達(dá)增強(qiáng)的狀態(tài)。正常生理狀態(tài)下的細(xì)胞中很少發(fā)生細(xì)胞凋亡過程，尤其是處于增殖過程的惡性腫瘤細(xì)胞的凋亡率較低。因此，促進(jìn)細(xì)胞凋亡是抗腫瘤藥物發(fā)揮作用的重要機(jī)制。

吉非替尼是一種選擇性的表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑[16]，臨床主要用于不適合化療的局部晚期或已經(jīng)轉(zhuǎn)移的非小細(xì)胞肺癌患者。在EGFR基因突變及HER2/HER3蛋白表達(dá)水平與吉非替尼治療晚期非小細(xì)胞肺癌療效關(guān)系的研究中發(fā)現(xiàn)，對(duì)于中國(guó)人群，聯(lián)合檢測(cè)腫瘤組織中EGFR基因突變及HER2/HER3蛋白表達(dá)水平可預(yù)測(cè)吉非替尼對(duì)晚期非小細(xì)胞肺癌的療效[17]。在分析阿法替尼聯(lián)合西妥昔單抗治療非小細(xì)胞肺癌EGFR T790M突變所致的吉非替尼耐藥性的研究中也發(fā)現(xiàn)阿法替尼聯(lián)合西妥昔單抗對(duì)EGFRT790M突變所致耐藥的非小細(xì)胞肺癌原代細(xì)胞有效[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，吉非替尼能夠抑制PC-9細(xì)胞增殖，且其抑制率隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)和作用濃度升高而提高；熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)吉非替尼能夠明顯增高細(xì)胞凋亡因子Bax、Caspase3和Caspase9 mRNA表達(dá)，降低Bcl2及MEK/ERK通路MEK及ERK1/2 mRNA表達(dá)；免疫印跡法檢測(cè)顯示吉非替尼能明顯增高細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax、Caspase3和Caspase9，降低Bcl2及MEK/ERK通路Ras、Raf、MEK及ERK1/2蛋白表達(dá)。

綜上所述，吉非替尼可抑制非小細(xì)胞肺癌PC-9增殖，促進(jìn)其凋亡；其作用機(jī)制可能是抑制MEK/ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活。

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