李丹丹，蔣立，王愛紅

(南京中醫(yī)藥大學(xué)，南京210000)

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肌肽對局灶性腦缺血損傷大鼠的腦保護作用及其機制

李丹丹，蔣立，王愛紅

(南京中醫(yī)藥大學(xué)，南京210000)

目的 觀察肌肽對局灶性腦缺血損傷大鼠的腦保護作用，探討其作用機制。方法 將72只雄性SD大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組和肌肽組，每組24只。模型組和肌肽組采用線栓法制作右側(cè)永久性大腦中動脈閉塞(pMCAO)模型，假手術(shù)組僅分離血管、不插入線栓。大鼠麻醉清醒2 h，肌肽組灌胃給予600 mg/(kg·d)肌肽水溶液，假手術(shù)組和模型組灌胃給予等量無菌生理鹽水，均2次/d、連續(xù)灌胃7天。三組分別于造模第1、3、7 天各取8只大鼠，檢測腦梗死體積分數(shù)，檢測血清IL-10、TNF-α水平及TNF-α/IL-10，測定脾臟指數(shù)。結(jié)果 造模第3、7天，肌肽組腦梗死體積分數(shù)均較模型組降低(P<0.05或<0.01)。造模第1、3、7天，模型組及肌肽組血清TNF-α、IL-10水平均較假手術(shù)組同時間點升高(P<0.05或<0.01)；造模第7天，肌肽組血清IL-10水平低于模型組(P<0.01)。造模第1、3天，模型組TNF-α/IL-10較假手術(shù)組同時間點增加(P均<0.05)；造模第7天，模型組TNF-α/IL-10均較假手術(shù)組及肌肽組同時間點降低(P均<0.05)。與假手術(shù)組比較，模型組造模第3天脾臟指數(shù)升高，造模第7天脾臟指數(shù)降低(P均<0.01)；與模型組比較，肌肽組造模第3天脾臟指數(shù)降低，造模第7天脾臟指數(shù)升高(P均<0.01)。模型組、肌肽組腦梗死體積與血清TNF-α水平及TNF-α/IL-10均呈負相關(guān)(r分別為-0.852、-0.884，P均<0.05)。結(jié)論 肌肽可減輕局灶性腦缺血大鼠腦損傷，抑制炎癥反應(yīng)、改善免疫失衡狀態(tài)可能是其作用機制。

局灶性腦缺血；肌肽；腫瘤壞死因子α；白介素10；大鼠

腦卒中是臨床主要致死性和致殘性疾病之一，其中缺血性腦卒中是最常見的類型，約占85%[1,2]。研究發(fā)現(xiàn)，免疫相關(guān)性炎癥反應(yīng)在腦缺血病理損傷過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，其中Th1類細胞分泌的促炎因子TNF-α與Th2類細胞分泌的抗炎因子IL-10比值失衡是促進腦缺血病情發(fā)展的重要因素[3,4]。肌肽為一種天然存在于脊椎動物骨骼肌中的生物活性肽，可通過調(diào)節(jié)機體免疫功能、清除氧自由基等，發(fā)揮腦保護作用[5]。2014年12月～2015年6月本研究探討肌肽對局麻性腦缺血損傷大鼠的腦保護作用及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性SPF級SD大鼠94只，體質(zhì)量(300±20)g，由南京中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(蘇)2013-0003。肌肽(美國Sigma公司)，大鼠血清IL-10及TNF-α ELISA試劑盒(南京建成生物工程研究所)，SQP電子天平(德國Sartorious)，UXF -80 ℃冰箱(美國Thermo Scientific)，VICTORTMX3多標記檢測系統(tǒng)(美國PerkinElmer公司)，2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC，美國Sigma公司)。

1.2 模型制作及處理 94只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7天，自由進食和飲水，造模前禁食12 h、不禁水。采用線栓法[6]復(fù)制右側(cè)永久性大腦中動脈閉塞(pMCAO)模型：10%水合氯醛(3.5 mL/kg)麻醉，暴露右側(cè)頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)、頸內(nèi)動脈(ICA)，結(jié)扎CCA和ECA的近端，用動脈夾夾閉ICA，在CCA游離段剪一小口并系一松結(jié)，將制備好的尼龍線栓經(jīng)CCA分支處順I(yè)CA走向緩慢推進入顱內(nèi)，自線栓標記處(18 mm)進入CCA與ICA分叉部位，系緊小口下松結(jié)。以大鼠蘇醒后提尾懸拉出現(xiàn)左上肢屈曲，爬行時向左側(cè)轉(zhuǎn)圈或跌倒為模型成功標志。若符合上述癥狀但有蛛網(wǎng)膜下腔出血，予以剔除并用同一批次造模成功的大鼠隨機補足，保證每組大鼠只數(shù)相等。最終72只大鼠進入本研究，按隨機數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組和肌肽組，每組24只。假手術(shù)組不插入線栓，僅分離右側(cè)CCA、ECA和ICA后縫合。大鼠麻醉清醒2 h，肌肽組灌胃給予600 mg/(kg·d)肌肽水溶液，假手術(shù)組和模型組給予等量無菌生理鹽水，均2次/d、連續(xù)灌胃7天。三組分別于造模第1、3、7 天各取8只大鼠，采用精密電子天平測量體質(zhì)量，10%水合氯醛(3.5 mL/kg)腹腔注射麻醉后迅速斷頭取腦，留取血液標本，取出完整脾臟。

1.3 相關(guān)指標觀察

1.3.1 腦梗死體積分數(shù)測定 取模型組和肌肽組各時間點大鼠腦組織，置于-20 ℃冰箱速凍20 min，自動切片機切片，自額極后間隔2 mm連續(xù)取冠狀切片5片，并將切片置于TTC溶液中，置于37 ℃恒溫避光孵育30 min。待孵育結(jié)束后，將腦片放入4%多聚甲醛溶液固定24 h，拍照，紅色區(qū)域為正常腦組織，蒼白區(qū)域為梗死區(qū)。采用Image Pro-Plus6.0圖像處理軟件，測量梗死灶體積和對側(cè)正常腦半球的體積，計算腦梗死體積分數(shù)。腦梗死體積分數(shù)(%)=梗死灶體積/對側(cè)半球體積×100%。

1.3.2 血清IL-10和TNF-α水平檢測 取三組各時間點大鼠血液標本，離心取血清，采用ELISA法檢測IL-10、TNF-α。采用VICTORTMX3多標記檢測系統(tǒng)測量OD值，計算各標本IL-10、TNF-α濃度，及TNF-α/IL-10比值。

1.3.3 脾臟指數(shù)測定 取三組各時間點大鼠完整脾臟，剔除周邊結(jié)締組織及脂肪組織，生理鹽水洗凈，濾紙擦干，用精密電子天平測定脾臟質(zhì)量，計算脾臟指數(shù)。脾臟指數(shù)=脾臟質(zhì)量(mg)/大鼠體質(zhì)量(g)。1.4 相關(guān)性分析 采用Pearson相關(guān)分析法分析腦梗死體積與血清TNF-α、IL-10水平及TNF-α/IL-10的關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 三組腦梗死體積分數(shù)比較 造模第1、3 和7 天，假手術(shù)組腦組織未見灰白色梗死灶，模型組和肌肽組右側(cè)腦組織皮質(zhì)區(qū)及紋狀體均有體梗死灶。造模第3、7天，肌肽組腦梗死體積分數(shù)低于模型組(P<0.05或<0.01)。

2.2 三組血清TNF-α、IL-10水平及TNF-α/IL-10比較 造模后第1、3、7天，模型組及肌肽組血清TNF-α、IL-10水平高于假手術(shù)組(P<0.05或<0.01)；造模第7天，肌肽組血清IL-10水平低于模型組(P<0.01)。造模第1、3天，模型組TNF-α/IL-10高于假手術(shù)組(P均<0.05)；造模第7天，模型組TNF-α/IL-10低于假手術(shù)組及肌肽組(P均<0.05)。見表1。

2.3 三組脾臟指數(shù)比較 造模第3天，模型組高于假手術(shù)組，造模第7天低于假手術(shù)組(P均<0.01)；造模第3天，肌肽組低于模型組，造模第7天高于模型組(P均<0.01)。見表1。

表1 三組各時間點相關(guān)指標比較±s)

注：與假手術(shù)組同時間點比較，*P<0.05，#P<0.01；與模型組同時間點比較，△P<0.05，▲P<0.01。

2.4 腦梗死體積與血清TNF-α、IL-10水平及TNF-α/IL-10的關(guān)系 模型組、肌肽組腦梗死體積與血清TNF-α水平及TNF-α/IL-10均呈負相關(guān)(r分別為-0.852、-0.884，P均<0.05)，與血清IL-10水平無相關(guān)性(r=0.194，P>0.05)。

3 討論

缺血性腦卒中患者影像學(xué)檢查均顯示腦缺血側(cè)存在梗死灶，腦梗死體積是判斷缺血性腦卒中的金標準。但腦缺血后缺血側(cè)腦組織水腫對腦梗死體積計算有一定影響。本研究選用腦梗死體積分數(shù)評價腦梗死體積，可減少誤差。肌肽是由β-丙氨酸和L-組氨酸組成的內(nèi)源性二肽，是目前發(fā)現(xiàn)的結(jié)構(gòu)最簡單的生物活性肽之一，具有調(diào)節(jié)pH值、清除氧自由基、抗糖基化等生物學(xué)作用[7,8]。本研究結(jié)果顯示，假手術(shù)組未見梗死灶，模型組和肌肽組右側(cè)腦組織皮質(zhì)區(qū)及紋狀體均有不同程度大小的梗死灶；造模第3、7天，肌肽組腦梗死體積分數(shù)均較模型組降低，提示肌肽可抑制腦梗死的發(fā)生、發(fā)展，且具有一定的時間依賴性。

促炎和抗炎機制的失衡即致炎細胞因子(如TNF-α等)與抗炎細胞因子(如IL-10等)比例失調(diào)在腦缺血等心腦血管疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。TNF-α是炎性細胞因子網(wǎng)絡(luò)的中心環(huán)節(jié)，其合成、分泌增加是腦缺血早期損傷加重的主要原因。IL-10是免疫調(diào)節(jié)及抗炎細胞因子之一，通過抑制樹突狀細胞發(fā)育成熟的早期階段，阻斷其向T細胞遞呈抗原，使T細胞活化能力受損，導(dǎo)致TNF-α、IFN-γ、IL-2等炎性因子分泌顯著減少，抑制腦缺血后炎性反應(yīng)介導(dǎo)的腦組織損傷[9]。在腦缺血病理生理過程中，促炎/抗炎機制動態(tài)失衡，炎性反應(yīng)失控，釋放大量促炎細胞因子，加重神經(jīng)元缺血性損傷[10,11]；亦可出現(xiàn)繼發(fā)抗炎反應(yīng)過度亢進，抑制促炎因子分泌，影響免疫細胞的成熟、增殖和分化，發(fā)揮強大的免疫抑制作用。因此，保持TNF-α/IL-10平衡可抑制卒中后炎癥反應(yīng)，避免繼發(fā)性損傷腦組織。本研究結(jié)果顯示，腦缺血后第1、3天，模型組血清TNF-α水平顯著升高，IL-10小幅升高，TNF-α/IL-10顯著升高，提示此時促炎反應(yīng)占主導(dǎo)地位；隨著病程延長至腦缺血后第7天，血清IL-10水平上升幅度明顯高于TNF-α上升幅度，TNF-α/IL-10明顯低于假手術(shù)組，提示抗炎反應(yīng)占主導(dǎo)地位；進一步研究發(fā)現(xiàn)，腦梗死體積與血清TNF-α水平及TNF-α/IL-10存在顯著負相關(guān)；上述結(jié)果與Su等[12]研究結(jié)果一致，提示檢測血清TNF-α和TNF-α/IL-10可早期診斷和預(yù)測腦梗死的發(fā)生、發(fā)展。造模第7天，肌肽組血清IL-10水平低于模型組；TNF-α/IL-10高于模型組，且與對照組接近，推測肌肽腦保護作用可能是通過調(diào)節(jié)促炎/抗炎細胞因子分泌，制約炎癥反應(yīng)和抗炎免疫應(yīng)答實現(xiàn)的。

脾臟是機體最大的外周免疫器官，亦是免疫應(yīng)答的主要場所，機體發(fā)生超敏反應(yīng)時，脾臟質(zhì)量會增加，因此脾臟指數(shù)常作為評估藥物對免疫器官抑制作用的基礎(chǔ)指標[13～15]。本研究模型組與假手術(shù)組比較，脾臟指數(shù)造模第3天升高，造模第7降低，提示腦缺血刺激丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸和交感神經(jīng)系統(tǒng)，激活免疫抑制反應(yīng)，造成代償性抗炎反應(yīng)綜合癥；與模型組比較，肌肽組造模后第3天脾臟指數(shù)降低，造模后第7天升高，提示肌肽可通過調(diào)節(jié)脾臟指數(shù)，改善免疫功能紊亂，發(fā)揮腦神經(jīng)保護作用。

綜上所述，肌肽可減輕局灶性腦缺血大鼠腦損傷；抑制炎癥反應(yīng)、改善免疫失衡狀態(tài)可能是其作用機制。

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江蘇省高效優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程項目(YSHL0201-26)；江蘇省教育廳高效“青藍工程”項目。

王愛紅(E-mail： wah710630@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.36.010

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A

1002-266X(2016)36-0034-03

2015-12-16)