趙子星，李宏宇，席立成，郁少林，劉搏宇

(廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院，南寧530021)

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體外沖擊波療法聯(lián)合仙桃草口服用于兔橈骨骨不連臨床效果觀察

趙子星，李宏宇，席立成，郁少林，劉搏宇

(廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院，南寧530021)

目的 探討體外沖擊波療法(ESW)聯(lián)合中草藥仙桃草口服對(duì)橈骨骨不連的治療效果。方法 將120只橈骨骨不連兔按隨機(jī)數(shù)字表法分為聯(lián)合組、仙桃草組、ESW組和對(duì)照組，各30只。各組均予標(biāo)準(zhǔn)飼喂養(yǎng)1周。ESW組進(jìn)行ESW治療1次；仙桃草組將1 g仙桃草磨成粉劑加入到60 g精飼料中，制成仙桃草混合飼料100 g，2次/d，共12周。聯(lián)合組行ESW聯(lián)合仙桃草混合飼料喂養(yǎng)，對(duì)照組不予特殊處理。各組于分組處理后48 h(T0)、1周(T1)、2周(T2)、4周(T3)、6周(T4)、12周(T5)，分別取5只大白兔行X線檢查，觀察其骨折愈合情況；處死動(dòng)物，取骨痂組織，采用免疫組化法檢測骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP-2)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)。結(jié)果 隨時(shí)間延長，聯(lián)合組和ESW組骨痂逐漸增多，骨痂密度升高，骨不連處逐漸愈合，聯(lián)合組T2～T5時(shí)間點(diǎn)骨折愈合情況均優(yōu)于ESW組；仙桃草組和對(duì)照組骨折間隙仍存在，骨折端仍為硬化骨，各時(shí)間點(diǎn)骨折愈合情況無明顯變化。與T0時(shí)間點(diǎn)比較，各組T1～T5時(shí)間點(diǎn)骨痂組織BMP-2、VEGF表達(dá)均升高(P均<0.05)。聯(lián)合組T1～T5時(shí)間點(diǎn)骨痂組織BMP-2、VEGF表達(dá)均高于其余各組，ESW組均高于仙桃草組、對(duì)照組(P均<0.05)。仙桃草組T1～T5時(shí)間點(diǎn)骨痂組織VEGF表達(dá)均高于對(duì)照組(P均<0.05)，BMP-2表達(dá)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。結(jié)論 ESW聯(lián)合仙桃草口服對(duì)兔橈骨骨不連的愈合具有促進(jìn)作用，其機(jī)制可能與上調(diào)骨痂組織BMP-2、VEGF表達(dá)有關(guān)。

骨不連，兔；體外沖擊波；仙桃草；骨形態(tài)發(fā)生蛋白2；血管內(nèi)皮生長因子

骨組織具有強(qiáng)大的自身修復(fù)能力，但部分患者骨折后8個(gè)月仍不能愈合，而3個(gè)月無愈合傾向即稱為骨不連。目前臨床對(duì)骨不連多采用手術(shù)治療，但具有損傷大、費(fèi)用高和需多次手術(shù)等缺點(diǎn)[1]。研究發(fā)現(xiàn)，體外沖擊波療法(ESW)能夠活躍成骨細(xì)胞，促進(jìn)骨痂生成，特別是對(duì)于長骨骨不連的治療效果較好；中藥仙桃草亦具有一定的成骨作用[2]。2012年12月～2015年5月，本研究對(duì)大白兔橈骨骨不連模型采用ESW聯(lián)合仙桃草治療，取得較好效果?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性新西蘭大白兔120只，兔齡5～6個(gè)月，體質(zhì)量3.0～3.5 kg，由廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。試劑與儀器：SABC試劑盒、DAB顯色試劑盒(武漢博士物生物工程有限公司)；體外沖擊波碎石機(jī)(德國多尼爾醫(yī)療技術(shù)公司)，小型臺(tái)式離心機(jī)(I-13，美國Sigma公司)，數(shù)碼成像X線機(jī)(德國西門子公司)，光學(xué)顯微鏡(BX40，日本Olympus公司)，脫水機(jī)、石蠟切片機(jī)、包埋機(jī)、攤片機(jī)(德國Leica公司)。

1.2 模型制備與分組處理 120只大白兔標(biāo)準(zhǔn)飼料飼養(yǎng)1周后，制作兔橈骨骨不連模型：10%水合氯醛耳緣靜脈麻醉，截除右側(cè)橈骨中段1 cm，沖洗后填塞明膠海綿，逐層縫合。3個(gè)月后X線片檢查顯示骨折端硬化，骨折間隙清晰可見，表明骨不連模型制備成功。將120只橈骨骨折兔按隨機(jī)數(shù)字表法分為ESW組、仙桃草組、聯(lián)合組和對(duì)照組，各30只。分組后第1天ESW組行1次ESW治療：耳緣靜脈麻醉后，采用體外沖擊波碎石機(jī)分別于體外骨折遠(yuǎn)、近端邊緣處行沖擊治療。設(shè)置參數(shù)：焦點(diǎn)能量0.5 mJ/mm2、頻率70～80次/min、沖擊量800次、焦點(diǎn)聚焦范圍1.5 cm2。仙桃草組行仙桃草混合飼料喂養(yǎng)：將1 g仙桃草磨成粉劑加入到60 g精飼料中，制成仙桃草混合飼料100 g，2次/d，共12周。聯(lián)合組參照上法給予ESW治療聯(lián)合仙桃草混合飼料喂養(yǎng)。對(duì)照組給予精飼料喂養(yǎng)，不予特殊處理。

1.3 相關(guān)指標(biāo)觀察

1.3.1 骨折愈合情況 各組處理48 h(T0)、1周(T1)、2周(T2)、4周(T3)、6周(T4)、12周(T5)分別取5只大白兔行X線檢查，觀察骨折愈合情況。

1.3.2 骨痂組織骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP-2)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)檢測 采用免疫組化法。各組觀察骨折愈合情況后以空氣栓塞法處死。取骨不連處長1.5～2.0 cm的骨痂組織，4%多聚甲醛溶液固定，10% EDTA脫鈣液脫鈣；乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，HE染色處理，4 μm連續(xù)切片。石蠟切片脫蠟水化，3% H2O2抗原修復(fù)，正常羊血清封閉，滴加BMP-2或VEGF單克隆抗體一抗和生物素標(biāo)記的二抗；加入SABC液，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固。Olympus光學(xué)顯微鏡下采用盲法觀察免疫組化切片，應(yīng)用Imagepro Plus6.0圖像軟件對(duì)陽性反應(yīng)細(xì)胞的平均光密度值(MOD)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 各組骨折愈合情況比較 各組T0、T1時(shí)間點(diǎn)骨折愈合未見明顯變化。聯(lián)合組T2時(shí)間點(diǎn)骨折端有模糊骨痂影出現(xiàn)；T3時(shí)間點(diǎn)可見骨折間隙縮小，骨痂密度增高，呈云霧狀；T4時(shí)間點(diǎn)骨痂逐漸增多，骨痂密度較高，但骨紋理較亂；T5時(shí)間點(diǎn)骨痂較致密，外形趨于正常，骨紋理有規(guī)律的縱向排列，髓腔已通。ESW組T3時(shí)間點(diǎn)可見骨痂影，骨不連區(qū)間隙縮小；T4時(shí)間點(diǎn)骨痂明顯增多，骨痂密度高，骨痂影呈梭形，可見骨小梁；T5時(shí)間點(diǎn)骨痂密度進(jìn)一步增高，骨小梁增多，排列較規(guī)律。聯(lián)合組各時(shí)間點(diǎn)骨折愈合情況均優(yōu)于ESW組，而仙桃草組和對(duì)照組骨折間隙仍存在，骨折端仍為硬化骨，各時(shí)間點(diǎn)骨折愈合情況無明顯變化。

2.2 各組骨痂組織BMP-2、VEGF表達(dá)比較 與T0時(shí)間點(diǎn)比較，各組T1～T5時(shí)間點(diǎn)骨痂組織BMP-2、VEGF表達(dá)均升高(P均<0.05)。聯(lián)合組BMP-2、VEGF表達(dá)均高于其余各組，ESW組均高于仙桃草組、對(duì)照組(P均<0.05)。仙桃草組T1～T5時(shí)間點(diǎn)骨痂組織VEGF表達(dá)均高于對(duì)照組(P均<0.05)，骨痂組織BMP-2表達(dá)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表1。

表1 各組骨痂組織BMP-2、VEGF表達(dá)比較

注：與同組T0時(shí)間點(diǎn)比較，*P<0.05；與聯(lián)合組同時(shí)間點(diǎn)比較，△P<0.05；與桃仙草組同時(shí)間點(diǎn)比較，#P<0.05；與ESW組同時(shí)間點(diǎn)比較，▲P<0.05。

3 討論

研究證實(shí)，ESW可以誘導(dǎo)血管生成，上調(diào)成骨相關(guān)生長因子，從而促進(jìn)細(xì)胞的增殖和分化，有助于組織再生[3～5]。仙桃草具有化瘀止血、清熱消腫、止痛等功效，主治跌打損傷[6～7]?，F(xiàn)代藥理研究表明，仙桃草的主要化學(xué)成分為β-谷甾醇、胡蘿卜苷、綠原酸等[8]。綠原酸是仙桃草的成骨活性成分之一，能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖分化[9]。本研究結(jié)果表明，隨時(shí)間延長，聯(lián)合組和ESW組骨痂逐漸增多，骨痂密度升高，骨不連處逐漸愈合；聯(lián)合組T2～T5時(shí)間點(diǎn)骨折愈合情況均優(yōu)于ESW組；仙桃草組和對(duì)照組骨折間隙仍存在，骨折端仍為硬化骨，各時(shí)間點(diǎn)骨折愈合情況無明顯變化。說明ESW聯(lián)合仙桃草可促進(jìn)兔橈骨骨不連的愈合。

骨組織的愈合受多種細(xì)胞生長因子的調(diào)控。BMP-2和VEGF的成骨作用比較突出[10，11]。BMP-2是促進(jìn)骨愈合的重要生物因子[12]，其表達(dá)上調(diào)能增強(qiáng)組織細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的潛能，促進(jìn)成骨；其表達(dá)下降則可導(dǎo)致間質(zhì)細(xì)胞向成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，抑制成骨。Shibasaki等[13]研究認(rèn)為，BMP-2主要是通過阻斷c-Met通路實(shí)現(xiàn)其成骨作用。VEGF為一種有效的血管生成因子，能夠促進(jìn)骨痂內(nèi)毛細(xì)血管生成，新生毛細(xì)血管長入后可帶來大量骨生長所需的細(xì)胞因子和生長因子，從而促進(jìn)骨不連的愈合[14]。本研究各組T0時(shí)間點(diǎn)骨痂組織BMP-2、VEGF表達(dá)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與觀察時(shí)間短有關(guān)；仙桃草組T1～T5時(shí)間點(diǎn)骨痂組織VEGF表達(dá)均高于對(duì)照組，而兩組骨痂組織BMP-2表達(dá)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明仙桃草的主要作用在于上調(diào)VEGF表達(dá)，加速骨不連斷端毛細(xì)血管生成，為骨痂生長帶來必須的營養(yǎng)成分，間接促進(jìn)骨不連愈合[15～17]。聯(lián)合組T1～T5時(shí)間點(diǎn)骨痂組織BMP-2、VEGF表達(dá)均高于其余各組，ESW組均高于仙桃草組、對(duì)照組，說明ESW聯(lián)合仙桃草口服促進(jìn)兔橈骨骨不連愈合的作用機(jī)制可能與其上調(diào)骨痂組織BMP-2、VEGF表達(dá)有關(guān)。分析原因，可能是沖擊波產(chǎn)生的微震動(dòng)使本來硬化的骨端產(chǎn)生微小新鮮骨折，隨之發(fā)生無菌性炎癥，炎性反應(yīng)導(dǎo)致機(jī)體釋放大量炎性物質(zhì)，從而刺激局部BMP-2和VEGF表達(dá)上調(diào)[6,7]。BMP-2上調(diào)能夠促進(jìn)骨痂生長，逐漸縮小骨斷端間隙，促進(jìn)骨不連愈合； VEGF表達(dá)上調(diào)能激發(fā)骨斷端發(fā)生血管反應(yīng)，使得大量新生毛細(xì)血管長入，帶來大量的營養(yǎng)物質(zhì)及生長因子；二者相互協(xié)作，最終達(dá)到促進(jìn)骨折愈合的目的。

綜上所述，ESW聯(lián)合仙桃草口服對(duì)兔橈骨骨不連的愈合具有促進(jìn)作用，其機(jī)制可能與上調(diào)骨痂組織BMP-2、VEGF表達(dá)有關(guān)。但其具體作用機(jī)制及作用靶點(diǎn)尚不明了，且BMP-2和VEGF的表達(dá)是否存在相互作用也需要進(jìn)一步探討。

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廣西醫(yī)療衛(wèi)生重點(diǎn)科研課題(桂衛(wèi)重2011120)；廣西中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥科技專項(xiàng)面上課題(GZPT1242)；廣西適宜衛(wèi)生技術(shù)研發(fā)推廣人才小高地項(xiàng)目(006011)。

李宏宇(E-mail: lihongyu36@sohu.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.36.009

R683

A

1002-266X(2016)36-0031-03

2015-12-10)