閆悅，王崇文，楊磊，李文婷，時(shí)廣力，何傳宇，白靖平

(1新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，烏魯木齊830011；2新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院)

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放射治療對(duì)兔肢體軟組織腫瘤血液供應(yīng)及細(xì)胞增殖的影響

閆悅1，王崇文1，楊磊2，李文婷1，時(shí)廣力1，何傳宇1，白靖平1

(1新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，烏魯木齊830011；2新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院)

目的 探討放射治療對(duì)兔肢體軟組織腫瘤血液供應(yīng)及細(xì)胞增殖的影響。方法 建立30只兔VX2肢體軟組織腫瘤模型，隨機(jī)分為對(duì)照組10只、調(diào)強(qiáng)放療(IMRT)組10只及容積弧形調(diào)強(qiáng)放療(VMAT)組10只，IMRT組、VMAT組分別進(jìn)行IMRT、VMAT，放療后第7天行三維能量多普勒超聲血管成像(3D-PDA)檢查，記錄腫瘤血管分型及血管形成指數(shù)(VI)、血流指數(shù)(FI)、血管血流指數(shù)(VFI)。對(duì)照組不予處理，檢查方法及時(shí)間同VMAT組。3D-PDA檢查后處死動(dòng)物取腫瘤組織，采用免疫組化SP法檢測(cè)Ki-67陽(yáng)性表達(dá)率及微血管密度(MVD)。結(jié)果 IMRT組血管分型為Ⅰ型7例、Ⅱ型1例、Ⅲ型0例，VMAT組為10、0、0例，對(duì)照組為0、2、8例；IMRT組和VMAT組血管分型明顯優(yōu)于對(duì)照組(P均<0.01)。IMRT組和VMAT組VI、FI、VFI及Ki-67陽(yáng)性表達(dá)率、MVD均低于對(duì)照組(P均<0.05)，IMRT組和VMAT組上述指標(biāo)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。結(jié)論 IMRT、VMAT均可減少兔肢體軟組織腫瘤的血液供應(yīng)并抑制腫瘤細(xì)胞增殖。

軟組織肉瘤；放射治療；三維能量多普勒超聲血管成像；Ki-67；微血管密度

軟組織肉瘤(STS)來(lái)源于中胚層的機(jī)體間充質(zhì)組織，手術(shù)是其首選治療方式，而輔助應(yīng)用放射治療(放療)能夠顯著降低局部復(fù)發(fā)率[1,2]。新輔助放療可使原本不能切除的病灶縮小、臨床分期降低，從而提高根治性切除率[3]。腫瘤血供為其增殖、轉(zhuǎn)移提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，可作為評(píng)價(jià)放療療效的指標(biāo)。兔VX2腫瘤是通用的腫瘤模型，其發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為與STS極其相似，即在局部呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，突破間室[4]。2014年11月～2015年6月，我們建立兔VX2肢體軟組織腫瘤模型，并觀察了其血液供應(yīng)及細(xì)胞增殖情況，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 動(dòng)物：純種新西蘭雄性大白兔39只，體質(zhì)量3.5～4 kg，6～8月齡，由新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供(編號(hào): SYXK2010-0002)。試劑及儀器：冰凍VX2腫瘤細(xì)胞懸液由新疆維吾爾自治區(qū)醫(yī)學(xué)影像研究所提供；Ki-67免疫組化試劑盒(美國(guó)Pierce公司)，CD34血管內(nèi)皮標(biāo)志物免疫組化試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；三維超聲GE LOGIQ E9型超聲診斷儀(美國(guó)GE公司)，三維超聲探頭(探頭型號(hào)：RSP 6-16-D)，VARIAN IX直線加速器(RapidArcTM)，飛利浦MX800多層螺旋CT掃描機(jī)(荷蘭飛利浦公司)。

1.2 兔VX2肢體軟組織腫瘤模型制備 隨機(jī)選擇9只新西蘭雄性大白兔，用于VX2腫瘤細(xì)胞傳代。將冰凍VX2腫瘤細(xì)胞懸液按一般細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)復(fù)蘇，800 r/min離心5 min，去除上清液，加入PBS液后再離心5 min；棄上清液，加入PBS液并用玻璃棒攪勻；取懸液臺(tái)朌藍(lán)染色，計(jì)數(shù)活細(xì)胞和死細(xì)胞；將懸液調(diào)制成1×106活細(xì)胞密度。取0.5 mL細(xì)胞懸液接種于9只兔左后肢肌肉內(nèi)，待腫瘤生長(zhǎng)至直徑3.0～3.5 cm時(shí)切取腫瘤，切成大小約0.5 cm×0.5 cm的碎塊制備腫瘤細(xì)胞混懸液。剩余30只兔肌肉注射3%戊巴比妥鈉1.5 m/kg麻醉，B超引導(dǎo)下將0.5 mL腫瘤細(xì)胞混懸液注射入其左后肢毗鄰股骨約0.5 cm的肌肉內(nèi)。造模后2周B超檢查示左后肢腫瘤直徑為3.0～3.5cm，證實(shí)模型制備成功。

1.3 分組處理 采用隨機(jī)數(shù)字表法將30只VX2肢體軟組織腫瘤兔分為調(diào)強(qiáng)放療組(IMRT組)、容積弧形調(diào)強(qiáng)放療組(VMAT組)及對(duì)照組，每組10只。采用大孔徑增強(qiáng)CT掃描定位，將兔取俯臥位放置，熱塑體膜固定，并做體表擺位標(biāo)記。經(jīng)耳緣靜脈快速推入對(duì)比造影劑碘帕醇2 mL/kg，掃描范圍為骨盆至膝關(guān)節(jié)，掃描層厚為2.5 mm。CT影像通過(guò)Varis局域網(wǎng)傳輸?shù)絍arian Eclipse 10.0計(jì)算機(jī)平臺(tái)，由放療醫(yī)師勾畫(huà)靶區(qū)。VMAT組將腫瘤周邊毗鄰骨骼的區(qū)域作為腫瘤靶區(qū)推量(GTVboost)，整個(gè)腫瘤作為腫瘤靶區(qū)(GTV)；臨床靶區(qū)(CTV)在GTV基礎(chǔ)上X軸、Z軸外擴(kuò)0.3～0.5 cm，Y軸外擴(kuò)3 cm；計(jì)劃靶區(qū)(PTV)在CTV基礎(chǔ)上外擴(kuò)0.3～0.5 cm；采用同步推量計(jì)劃：GTVboost：3 Gy/次，GTV：2.5 Gy/次，CTV：2.5 Gy/次，PTV：2.5 Gy/次，每周5次，共3周。IMRT組將腫瘤定義為GTV，依次勾畫(huà)CTV、PTV；采用常規(guī)分割PTV：2Gy/次，5野，每周5次，共5周。計(jì)劃完成前校對(duì)放療中心，采用Varian IX醫(yī)用直線加速器6 MV射線完成放療。對(duì)照組不予處理。

1.4 相關(guān)指標(biāo)觀察

1.4.1 腫瘤組織血液供應(yīng) 放療后第7天三組均行三維能量多普勒超聲血管成像(3D-PDA)檢查。采用GE LOGIQ E9彩超診斷儀聯(lián)合三維探頭，頻率7～12 MHz。探頭標(biāo)記處與股骨長(zhǎng)軸平行，動(dòng)態(tài)三維容積探頭在儀器設(shè)置的muscle條件下，啟動(dòng)三維成像程序，顯示X、Y、Z三個(gè)不同方向切面的能量多普勒?qǐng)D像，進(jìn)行存儲(chǔ)。調(diào)出三維數(shù)據(jù)庫(kù)中的3D-PDA容積資料，選用Vocal手動(dòng)模式，旋轉(zhuǎn)角度15°。以A平面作為參考平面，緊貼骨面勾畫(huà)腫瘤邊緣顯示腫瘤立體血流，按照血管的分布與走行，參照Ohishi等[5]的方法將腫瘤血管分布分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型(Ⅰ型血供不豐富，Ⅲ型血供豐富，Ⅱ型血供介于二者之間)。通過(guò)計(jì)算機(jī)軟件自動(dòng)計(jì)算并顯示血流和血管參數(shù)，包括血管形成指數(shù)(Ⅵ)、血流指數(shù)(FI)、血管血流指數(shù)(VFI)。

1.4.2 腫瘤組織病理情況 3D-PDA檢查結(jié)束后處死三組動(dòng)物，完整切取其左后肢腫瘤標(biāo)本，選取腫瘤毗鄰股骨處的腫瘤組織進(jìn)行標(biāo)記、取材。中性甲醛溶液固定24 h，石蠟包埋、切片，行HE染色，100倍光鏡下觀察腫瘤組織病理情況。

1.4.3 腫瘤組織 Ki-67表達(dá)及微血管密度(MVD) Ki-67表達(dá)：采用免疫組化SP法，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。選取有代表性的5個(gè)高倍視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞(細(xì)胞核呈棕黃色)所占的比例，其平均數(shù)記為Ki-67表達(dá)，可反映細(xì)胞增殖情況。MVD：經(jīng)CD34多克隆抗體標(biāo)記微血管后，免疫組化染色顯示腫瘤血管呈棕黃色。先于40倍鏡下尋找切片MVD豐富區(qū)域，再于400倍視野下計(jì)數(shù)染成棕色并可與周圍血管、腫瘤及其他結(jié)締組織區(qū)分開(kāi)的內(nèi)皮細(xì)胞或細(xì)胞簇?cái)?shù)目。計(jì)數(shù)時(shí)將單一走行的血管記為1，如果血管走行中有分支則以最終的分支數(shù)為準(zhǔn)；單個(gè)散在或聚集成簇尚未形成管腔的內(nèi)皮細(xì)胞亦計(jì)數(shù)為1。管腔橫截面中內(nèi)皮細(xì)胞總數(shù)>8的血管不是新生血管，不作計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果

IMRT組放療過(guò)程中2只死亡(一只死于麻醉過(guò)量，一只腫瘤破潰至皮膚予安樂(lè)死)，最終存活8只；其余兩組均存活。

2.1 三組腫瘤組織血液供應(yīng)情況 IMRT組腫瘤內(nèi)部未見(jiàn)血管分布，僅周邊可見(jiàn)點(diǎn)狀、線狀血管。VMAT組可見(jiàn)整個(gè)腫瘤血管結(jié)構(gòu)明顯減少。對(duì)照組腫瘤實(shí)質(zhì)有部分樹(shù)枝狀血管存在，分支復(fù)雜，走行迂曲，周邊可見(jiàn)環(huán)繞的粗大血管。IMRT組血管分型為Ⅰ型7例、Ⅱ型1例、Ⅲ型0例，VMAT組為10、0、0例，對(duì)照組為0、2、8例；IMRT組和VMAT組血管分型明顯優(yōu)于對(duì)照組(P均<0.01)。IMRT組和VMAT組VI、FI、VFI均低于對(duì)照組(P均<0.05)，IMRT組與VMAT組VI、FI、VFI比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 三組VI、FI、VFI比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。

2.2 三組腫瘤組織病理情況 IMRT組鏡下可見(jiàn)腫瘤實(shí)質(zhì)及腫瘤邊緣組織大片壞死細(xì)胞，伴有炎細(xì)胞浸潤(rùn)及纖維組織增生；在其他視野仍可觀察到少許腫瘤細(xì)胞殘留。VMAT組GTVboost區(qū)域可見(jiàn)腫瘤細(xì)胞壞死明顯，纖維組織增生；纖維組織周圍有炎細(xì)胞浸潤(rùn)，表現(xiàn)出壞死細(xì)胞逐漸被纖維細(xì)胞替代的演化改變；在其他視野仍可觀察到少許腫瘤細(xì)胞殘留。對(duì)照組鏡下可見(jiàn)腫瘤細(xì)胞侵犯橫紋肌，正常的細(xì)胞結(jié)構(gòu)受到損害，細(xì)胞邊界與周圍組織不清。

2.3 三組腫瘤組織Ki-67陽(yáng)性表達(dá)及MVD比較 IMRT組和VMAT組Ki-67陽(yáng)性表達(dá)率、MVD均低于對(duì)照組(P均<0.05)，IMRT組和VMAT組Ki-67陽(yáng)性表達(dá)率、MVD比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)表2。Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，VI與MVD呈正相關(guān)(r=0.91，P<0.01)。

2.4 VI與MVD的關(guān)系 Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，VI與MVD呈正相關(guān)(r=0.91，P<0.01)。

3 討論

在臨床和實(shí)驗(yàn)研究中， 放療對(duì)實(shí)體腫瘤治療效果的評(píng)估一直存在爭(zhēng)議。Le Grange等[6]研究認(rèn)為，大多數(shù)STS患者新輔助放療后腫瘤體積會(huì)縮小，但仍有小部分的腫瘤體積會(huì)增大，并且進(jìn)一步證實(shí)腫瘤體積的變化與手術(shù)切除后的局部控制率無(wú)相關(guān)性。研究顯示，腫瘤組織的內(nèi)部代謝和血供變化可更好地評(píng)估治療效果[7]。在腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移中，血管生成起關(guān)鍵作用[8，9]。CT能夠通過(guò)病變區(qū)域的密度判斷腫瘤的存活或壞死，但對(duì)于表現(xiàn)為低密度且不能明顯增強(qiáng)的區(qū)域，可能還包括少量存在于纖維組織中的存活腫瘤細(xì)胞[10]。MRI在評(píng)價(jià)腫瘤治療效果方面有一定優(yōu)勢(shì)，壞死的組織表現(xiàn)為T1WI低信號(hào)和T2WI高信號(hào)，對(duì)比增強(qiáng)的T1WI無(wú)強(qiáng)化，同時(shí)殘留的腫瘤組織在增強(qiáng)MRI中表現(xiàn)為高信號(hào)，但在術(shù)后早期出現(xiàn)的炎癥區(qū)域也同樣表現(xiàn)為明顯強(qiáng)化[11]。

表2 三組Ki-67陽(yáng)性表達(dá)率及MVD比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。

3D-PDA為觀察腫瘤內(nèi)部及周邊的血管結(jié)構(gòu)提供了一種動(dòng)態(tài)、立體及直觀的方式，能夠客觀顯示腫瘤的血液供應(yīng)[12]。應(yīng)用Vocal軟件對(duì)靶器官內(nèi)的血流信號(hào)進(jìn)行自動(dòng)分析計(jì)算出總的血流振幅與彩色值，從而生成VI、FI、VFI。VI表示整個(gè)感興趣容積內(nèi)血流信號(hào)所占的比例，F(xiàn)I表示整個(gè)感興趣容積內(nèi)血流信號(hào)的平均強(qiáng)度，VFI是血管數(shù)量與血流信號(hào)強(qiáng)度的結(jié)合[13]。研究顯示，VI、FI、VFI可全面、客觀、量化評(píng)估活體組織內(nèi)的血管密度和灌注情況[14]。本研究結(jié)果顯示，對(duì)照組腫瘤周邊有豐富的血管網(wǎng)，而腫瘤實(shí)質(zhì)仍有部分樹(shù)枝狀的血管存在，但血管結(jié)構(gòu)不是很豐富，可能與兔肢體軟組織腫瘤的生長(zhǎng)速度以及發(fā)生凋亡、壞死的過(guò)程都明顯快于人體腫瘤有關(guān)；IMRT組和VMAT組血管分型明顯優(yōu)于對(duì)照組，VI、FI、VFI均低于對(duì)照組，而IMRT組和VMAT組之間無(wú)明顯差異，說(shuō)明IMRT、VMAT均可降低兔肢體軟組織腫瘤的血管形成及血液供應(yīng)。但因無(wú)法保證每次3D-PDA檢查是探頭的角度相同，且之后三維圖像生成的立體血流圖亦不相同，因此無(wú)法完全保證測(cè)量的真實(shí)性。

Ki-67陽(yáng)性表達(dá)率與惡性腫瘤的發(fā)展、轉(zhuǎn)移、預(yù)后相關(guān)，可反映惡性腫瘤增殖率，是判斷腫瘤生物學(xué)行為的良好指標(biāo)[15]。亦逐漸成為腫瘤放療療效的評(píng)價(jià)指標(biāo)[16]。子宮頸鱗狀上皮細(xì)胞癌患者Ki-67陽(yáng)性表達(dá)率從放療前的49.7%降低至放療后的24%，細(xì)胞增殖活性顯著降低[17]。經(jīng)CD34多克隆抗體標(biāo)記微血管后，可以間接反映MVD，為腫物組織內(nèi)微血管進(jìn)行定量研究提供依據(jù)[18]。本研究結(jié)果顯示，IMRT組和VMAT組Ki-67陽(yáng)性表達(dá)率、MVD均明顯低于對(duì)照組，IMRT組和VMAT組Ki-67陽(yáng)性表達(dá)率、MVD比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明放療可明顯抑制兔肢體軟組織腫瘤的血液供應(yīng)及細(xì)胞增殖。本研究Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，VI與MVD呈正相關(guān)。Hui等[19]應(yīng)用3D-CPA檢測(cè)宮頸癌上皮內(nèi)瘤變的研究，也得到了與VI與MVD呈正相關(guān)的結(jié)果。

綜上所述，IMRT、VMAT均可減少兔肢體軟組織腫瘤的血液供應(yīng)并抑制其細(xì)胞增殖。3D-PDA能夠從立體血供角度評(píng)價(jià)腫瘤的放療效果，可作為臨床評(píng)價(jià)軟組織肉瘤放療效果的新方法。但是本研究存在一定的局限性，由于動(dòng)物存在腫瘤負(fù)荷，盡管加強(qiáng)護(hù)理，但每天接受放療及麻醉后已相當(dāng)虛弱。因此放療后觀察時(shí)間較短，只能參照文獻(xiàn)[20]在放療后第7天記錄3D-PDA相關(guān)參數(shù)，而對(duì)照組也選擇在周期較短的VMAT組放療完成后第7天采集資料，故缺少長(zhǎng)期觀察的相關(guān)數(shù)據(jù)。

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Effect of radiotherapy on blood supply and cell proliferation of rabbit limb soft-tissue tumor

YANYue1,WANGChongwen,YANGLei,LIWenting,SHIGuangli,HEChuanyu,BAIJingping

(1TheAffiliatedTumorHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China)

Objective To investigate the effect of radiotherapy on blood supply and cell proliferation of rabbit limb soft-tissue tumor. Methods Thirty VX2 limb soft-tissue tumor models were established and were randomly divided into three groups: the control group (n=10), intensity modulated radiotherapy (IMRT) group (n=10) and volumetric modulated arc therapy (VMAT) group (n=10). IMRT group received IMRT and VMAT group received VMAT. Three-dimensional power Doppler angiography (3D-PDA) was performed on the first week after radiation. Types of tumor blood vessels were recorded. Vascularization index (VI), flow index (FI) and vascularization flow index (VFI) were calculated. The control group received the same examination at same time without any treatment. Animals were sacrificed and tumor tissues were sectioned after 3D-PDA, then the positive expression rate of Ki-67 and micro vessel density (MVD) was assessed by immunohistochemical SP method. Results Types of tumor blood vessels: in the IMRT group, there were 7 cases of typeⅠ, 1 case of type Ⅱ and 0 case of type Ⅲ; all were 0 in the VMAT group; and 0, 2 and 8 cases in the control group. The types of tumor blood vessels in the IMRT group and VMAT group were better than that of the control group (allP<0.01). VI, FI, VFI, positive expression rate of Ki-67 and MVD in the IMRT group and VMAT group were lower than those of the control group (allP<0.05). No significant difference was found in the above index between the IMRT group and VMAT group (allP>0.05). Conclusion IMRT and VMAT can reduce blood supply and inhibit tumor cell proliferation of rabbit limb soft-tissue tumor.

soft tissue sarcoma; radiotherapy; three-dimensional power Doppler angiography; Ki-67; microvessel density

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2015211C114)。

閆悅(1988-)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)楣桥c軟組織腫瘤。E-mail: xjyanyue1988@163.com

簡(jiǎn)介：白靖平(1958-)，男，主任醫(yī)師，研究方向?yàn)楣桥c軟組織腫瘤。E-mail: xjbaijingping@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.36.006

R738.6

A

1002-266X(2016)36-0020-04

2015-12-03)