張芹，蒲維婭，錢芳

江蘇省中醫(yī)院，江蘇 南京 210029

正交試驗(yàn)法優(yōu)選潛陽育陰顆粒水提醇沉工藝

張芹，蒲維婭，錢芳

江蘇省中醫(yī)院，江蘇 南京 210029

目的優(yōu)選潛陽育陰顆粒的水提醇沉工藝。方法以二苯乙烯苷含量和干膏率的綜合評(píng)分為指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)法，考察加水量、提取次數(shù)、提取時(shí)間對(duì)水提工藝的影響，考察水提液相對(duì)密度、醇沉濃度、靜置時(shí)間對(duì)醇沉工藝的影響。結(jié)果優(yōu)選的水提工藝為：加12倍量水，提取2次，每次1 h；優(yōu)選的醇沉工藝為：水提液濃縮至相對(duì)密度1.10（60 ℃），醇沉濃度60%，靜置48 h。結(jié)論優(yōu)選的工藝穩(wěn)定可行，可用于該制劑的工業(yè)化生產(chǎn)。

潛陽育陰顆粒；水提醇沉；正交試驗(yàn)；二苯乙烯苷

潛陽育陰顆粒為本院院內(nèi)制劑，由制何首烏、鬼針草、山萸肉、川牛膝等6味中藥組成，具有補(bǔ)益肝腎、活血通絡(luò)的功效。本試驗(yàn)綜合考慮與功能主治相關(guān)的主要有效成分理化性質(zhì)，并結(jié)合臨床用藥基礎(chǔ)、水溶性顆粒劑成型需要，以二苯乙烯苷含量和干膏率的綜合評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，優(yōu)選水提及醇沉工藝，為該制劑的規(guī)范化生產(chǎn)提供依據(jù)。

1　儀器與試藥

Agilent1100液相色譜儀，包括四元泵（G1311A）、柱溫箱（G1316A）、VWD檢測(cè)器（G1314A）、工作站（Chemstation）；BP-211D型十萬分之一電子分析天平，德國Sartorius；KQ-1000E醫(yī)用超聲波清洗器，昆山超聲儀器公司；101-1A電熱鼓風(fēng)干燥箱，南通滬通制藥設(shè)備廠；HH-4數(shù)顯型恒溫水浴鍋，金壇榮華儀器制造公司；Millipore-Q純水機(jī)，美國Millipore公司。

二苯乙烯苷對(duì)照品（批號(hào)110844-201006，含量測(cè)定用），中國食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純，水為超純水，乙醇為分析純。制何首烏、鬼針草等飲片購于江蘇省藥材公司，由江蘇省中醫(yī)院劉志輝主任藥師鑒定，符合2015年《中華人民共和國藥典》各藥材項(xiàng)下規(guī)定。

2　方法與結(jié)果

2.1二苯乙烯苷含量測(cè)定

2.1.1色譜條件色譜柱：Hedera C18柱（4.6 mm× 250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（19∶81）；檢測(cè)波長：320 nm；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL[1]。

2.1.2對(duì)照品溶液的制備精密稱取二苯乙烯苷對(duì)照品17.90 mg，加稀乙醇溶解，制成每1 mL含二苯乙烯苷0.179 mg的對(duì)照品溶液。

2.1.3供試品溶液及陰性對(duì)照溶液的制備精密吸取樣品2 mL，置25 mL棕色量瓶中，加稀乙醇，超聲（功率280 W，頻率50 Hz）20 min，放冷，再加稀乙醇至刻度。搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得。取不含制何首烏的陰性樣品，同法制得陰性對(duì)照溶液。

2.1.4系統(tǒng)適用性試驗(yàn)精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液10 μL，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，供試品與對(duì)照品在相同位置有較大吸收，陰性對(duì)照無干擾。二苯乙烯苷峰與相鄰峰的分離度＞1.5。色譜圖見圖1。

圖1　潛陽育陰顆粒中二苯乙烯苷HPLC圖

2.1.5線性關(guān)系考察取“2.1.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，用稀乙醇分別稀釋為89.5、44.75、22.375、11.187 5、5.593 8、2.796 9、1.398 4 μg/mL的對(duì)照品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，經(jīng)線性回歸，得二苯乙烯苷回歸方程Y＝4107.1X－37.689，r＝0.999 9，二苯乙烯苷進(jìn)樣量在0.013 98～1.79 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.1.6精密度試驗(yàn)精密吸取二苯乙烯苷對(duì)照品溶液，注入液相色譜儀，重復(fù)進(jìn)樣6次，以峰面積計(jì)算，RSD＝0.75%。

2.1.7重復(fù)性試驗(yàn)精密吸取同一樣品2 mL，共6份，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定，以二苯乙烯苷含量計(jì)算，RSD＝1.82%（n＝6）。

2.1.8穩(wěn)定性試驗(yàn)取樣品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件，放置0、2、4、6、8、12 h，進(jìn)樣，記錄色譜峰面積，RSD＝1.13%（n＝6），表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.9加樣回收率試驗(yàn)精密吸取已知含量的同一樣品6份，加入二苯乙烯苷對(duì)照品，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定并計(jì)算二苯乙烯苷含量，結(jié)果平均回收率為98.48%，RSD＝1.04%。

2.2水提工藝優(yōu)選

2.2.1水提工藝因素水平的確定根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，以影響水提的主要因素提取時(shí)間（A）、提取次數(shù)（B）、加水量（C）為考察因素[2]，采用L9（34）進(jìn)行正交試驗(yàn)，因素水平見表1。

表1　水提工藝正交試驗(yàn)因素水平表

2.2.2水提工藝干膏得率精密吸取樣品2 mL，水浴蒸干，置105 ℃烘箱3 h，取出，再置干燥器冷卻30 min，立即稱重。

2.2.3水提工藝正交試驗(yàn)稱取處方量飲片96 g，采用L9（34）正交試驗(yàn)，測(cè)定提取液中二苯乙烯苷量和干膏得率。二苯乙烯苷量為主要指標(biāo)，干膏得率為次要指標(biāo)，權(quán)重系數(shù)分別定為0.7、0.3。綜合評(píng)分＝二苯乙烯苷量÷最大二苯乙烯苷量×100×0.7＋干膏得率÷最大干膏得率×100×0.3，以綜合評(píng)分作為篩選指標(biāo)。試驗(yàn)結(jié)果見表2、表3。

由正交試驗(yàn)及方差分析結(jié)果可知，因素B對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有顯著影響，因素A、C對(duì)試驗(yàn)結(jié)果無顯著影響，各因素的影響次序?yàn)锽＞C＞A，各因素不同水平影響次序?yàn)锳2＞A3＞A1、B3＞B2＞B1、C3＞C1＞C2，因此最佳提取工藝為A2B3C3，即加12倍量水，提取3次，每次1 h。考慮到工業(yè)生產(chǎn)的實(shí)際，優(yōu)選提取工藝為A2B2C3，即加12倍量水，提取2次，每次1 h。

表2　水提工藝正交試驗(yàn)安排與結(jié)果

表3　水提工藝正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析

2.2.4水提工藝驗(yàn)證試驗(yàn)稱取處方量飲片96 g，共3份，按優(yōu)選的工藝提取，結(jié)果見表4，表明優(yōu)選的水提工藝穩(wěn)定可行。

表4　水提工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

2.3醇沉工藝優(yōu)選

2.3.1醇沉工藝因素水平的確定根據(jù)文獻(xiàn)[3]和預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，以影響醇沉的主要因素醇沉濃度（A）、水提液相對(duì)密度（B）、醇沉?xí)r間（C）為考察因素，選用L9（34）進(jìn)行正交試驗(yàn)，因素水平見表5。

表5　醇沉正交試驗(yàn)因素水平表

2.3.2醇沉工藝正交試驗(yàn)稱取處方量飲片96 g，按優(yōu)選水提取工藝制備水煎液。采用L9（34）正交試驗(yàn)，按“2.2.3”項(xiàng)下方法計(jì)算綜合評(píng)分，以綜合評(píng)分作為篩選指標(biāo)，試驗(yàn)結(jié)果見表6、表7。

表6　醇沉工藝正交試驗(yàn)安排與結(jié)果

表7　醇沉工藝正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析

由醇沉工藝正交試驗(yàn)和方差分析結(jié)果可以看出，因素A、B、C對(duì)試驗(yàn)結(jié)果均無顯著影響，各因素影響次序?yàn)锽＞C＞A，各因素不同水平的影響次序?yàn)?/p>

A1＞A3＞A2、B1＞B2＞B3、C3＞C2＞C1，最佳醇沉工藝為A1B1C3，即水提液濃縮至相對(duì)密度1.10（60 ℃），醇沉濃度60%，放置48 h。

2.3.3醇沉工藝驗(yàn)證試驗(yàn)稱取處方量飲片96 g，共3份，按優(yōu)選水提工藝制備水煎液，測(cè)得二苯乙烯苷量為82.04 mg，轉(zhuǎn)移率為59.71%，再按優(yōu)選的醇沉工藝試驗(yàn)，結(jié)果見表8，表明此醇沉工藝穩(wěn)定可行。

表8　醇沉工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

3　討論

為了便于服用和保持原方療效，選擇將潛陽育陰顆粒采用水提醇沉工藝提取。以二苯乙烯苷含量和干膏率的綜合評(píng)分為指標(biāo)，通過L9（34）正交試驗(yàn)法優(yōu)選水提和醇沉工藝參數(shù)。

中藥水提液雜質(zhì)較多，如淀粉、樹脂、果膠、黏液質(zhì)等。目前常用除雜方法有：乙醇沉淀法、板框壓濾法、高速離心法、吸附澄清法等[4-10]。吸附澄清法近年使用比較多，主要除去蛋白質(zhì)、淀粉等膠體不穩(wěn)定成分，對(duì)多糖、氨基酸、維生素、多肽等無影響，此法實(shí)際操作中工序多，加入澄清劑攪拌后，仍需離心，故成本較高。高速離心為物理分離方法，大生產(chǎn)中藥液產(chǎn)量大，用高速離心除雜必然增加資產(chǎn)投資。乙醇沉淀法為中藥口服制劑精制的最常用方法，能獲得較好的除雜效果。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，液體狀態(tài)的二苯乙烯苷在高溫條件下不穩(wěn)定，隨著溫度的升高，二苯乙烯苷質(zhì)量濃度減小的速率增快，60 ℃及以下溫度對(duì)二苯乙烯苷質(zhì)量濃度影響較小[11]。潛陽育陰顆粒醇沉前處方量飲片中二苯乙烯苷量為82.04 mg，轉(zhuǎn)移率為59.71%；醇沉后處方量飲片中二苯乙烯苷量為44.68 mg，轉(zhuǎn)移率為32.52%。為減少由醇沉引起的二苯乙烯苷損失，醇沉液采用減壓回收乙醇并減壓濃縮以控制溫度。本結(jié)論也提示，含二苯乙烯苷的制劑在制備過程中應(yīng)盡量避免高溫，尤其是在濃縮、干燥過程中應(yīng)盡量保持溫度在60 ℃以下。

本試驗(yàn)參考藥典[1]，以乙腈-水（25∶75）為流動(dòng)相，結(jié)果二苯乙烯苷未能有效分離，通過調(diào)整流動(dòng)相比例，以乙腈-水（19∶81）為流動(dòng)相，結(jié)果分離效果佳，保留時(shí)間適度。因此，確定其為二苯乙烯苷含量測(cè)定的流動(dòng)相。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果及生產(chǎn)實(shí)際，確定了潛陽育陰顆粒水提醇沉最佳工藝。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明，優(yōu)選的水提醇沉工藝穩(wěn)定、合理、可行。

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Optimization of Water Extraction and Alcohol Precipitation Technology for Qianyang Yuyin Granules by Orthogonal Test

ZHANG Qin, PU Wei-ya, QIAN Fang
(Jiangsu Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine, Nanjing 210029, China)

Objective To optimize water extraction and alcohol precipitation technology for Qianyang Yuyin Granules. Methods With composite score of the content of stilbeneglycoside and dry extract yield as indexes, effects of the amount of water, extraction times and time on extraction technology were investigated by orthogonal test; the effects of relative density of concentrated liquid, the concentration of alcohol precipitation and standing time on alcohol precipitation technology were also investigated. Results Optimum extraction process was as following: extracting 2 times with 12 times the amount of water, 1 hour each time; Optimum alcohol precipitation technology was as following: the relative density of concentrated liquid 1.10 (60 ℃), the concentration of alcohol precipitation 60%, standing time 48 hours. Conclusion The optimum method is stable and feasible, which is suitable for industrial production of the preparation.

Qianyang Yuyin Granules; water extraction and alcohol precipitation; orthogonal test; stilbeneglycoside

10.3969/j.issn.1005-5304.2016.12.025

R283.5

A

1005-5304(2016)12-0103-04

蒲維婭，E-mail：pwy1974@126.com

（2015-12-23）

（2016-01-06；編輯：陳靜）