武琳，楊光，杜菁，劉瑩

北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠，北京 100079

HPLC測(cè)定十全大補(bǔ)丸、補(bǔ)中益氣丸、銀翹解毒片中甘草酸含量

武琳，楊光，杜菁，劉瑩

北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠，北京 100079

目的建立十全大補(bǔ)丸、補(bǔ)中益氣丸、銀翹解毒片中甘草酸的含量測(cè)定方法。方法采用高效液相色譜法測(cè)定十全大補(bǔ)丸、補(bǔ)中益氣丸、銀翹解毒片中甘草酸的含量，采用Zorbax SB C18色譜柱（150 mm× 4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇-2.5%醋酸（65∶35)，流速為0.8 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。結(jié)果甘草酸在0.180 3～3.605 4 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系（r＝1），十全大補(bǔ)丸、補(bǔ)中益氣丸、銀翹解毒片中甘草酸平均回收率分別為99.85%（n＝6）、100.70%（n＝6）、100.81%（n＝6）。結(jié)論本試驗(yàn)所建立的方法專屬性強(qiáng)、簡(jiǎn)便，可用于含甘草成分的產(chǎn)品中甘草酸的檢測(cè)。

十全大補(bǔ)丸；補(bǔ)中益氣丸；銀翹解毒片；甘草酸；高效液相色譜法

十全大補(bǔ)丸、補(bǔ)中益氣丸、銀翹解毒片為北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司出口至歐洲某國(guó)家產(chǎn)品，處方中均含有甘草成分。進(jìn)口方衛(wèi)生署要求含甘草成分的產(chǎn)品應(yīng)做甘草酸檢測(cè)，并規(guī)定甘草酸每日服用量不應(yīng)超過(guò)100 mg。本試驗(yàn)采用HPLC對(duì)十全大補(bǔ)丸、補(bǔ)中益氣丸、銀翹解毒片中甘草酸進(jìn)行含量測(cè)定，對(duì)十全大補(bǔ)丸、補(bǔ)中益氣丸、銀翹解毒片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行提高完善，從而有效控制制劑質(zhì)量，保證出口產(chǎn)品質(zhì)量，保證臨床療效及用藥安全。

1　儀器與試藥

Agilent 1100高效液相色譜儀（二極管陣列檢測(cè)器）；METTLER TOLEDO AE240型電子分析天平（梅特勒-托利多國(guó)際股份有限公司），KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率250 W，頻率40 kHz）。

甘草酸銨對(duì)照品（供含量測(cè)定用，批號(hào)110731-200614），中國(guó)食品藥品檢定研究院；十全大補(bǔ)丸（批號(hào)8030953、0030631、4035575）、補(bǔ)中益氣丸（批號(hào)0081764、8081758、0081768）、銀翹解毒片（批號(hào)0121031、0121030、0121032），北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠；配制溶液所用試劑均為分析純，HPLC用試劑為高效液相級(jí)，水為超純水。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件

色譜柱為Zorbax SB C18（150 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇-2.5%醋酸（65∶35），流速0.8 mL/min，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，理論塔板數(shù)按甘草酸峰計(jì)算應(yīng)不低于2000。

2.2對(duì)照品溶液的制備

取甘草酸銨對(duì)照品適量，精密稱定，加70%乙醇制成每1 mL含0.2 mg的溶液，即得（甘草酸質(zhì)量＝甘草酸銨質(zhì)量/1.0207）[1]。

2.3供試品溶液的制備

分別取十全大補(bǔ)丸、補(bǔ)中益氣丸、銀翹解毒片適量，研細(xì)，分別取約3、0.5、0.6 g，精密稱定，分別置具塞錐形瓶中，分別精密加入70%乙醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，分別超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）40、50、40 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，離心，分別取上清液，即得。

2.4陰性對(duì)照溶液的制備

按十全大補(bǔ)丸、補(bǔ)中益氣丸和銀翹解毒片處方中藥味比例，分別自配不含甘草的其他藥材，按其制備工藝制成陰性制劑，按“2.3”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.5空白干擾試驗(yàn)

精密吸取供試品溶液、對(duì)照品溶液、陰性對(duì)照溶液各10 μL，在上述色譜條件下進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果甘草酸可與其他成分基線分離，陰性對(duì)照溶液在與甘草酸對(duì)照品相同保留時(shí)間處未顯色譜峰，故認(rèn)為空白無(wú)干擾。色譜圖見(jiàn)圖1。

2.6線性關(guān)系考察

分別精密吸取0.184 mg/mL甘草酸銨對(duì)照品溶液（折合甘草酸濃度為0.180 3 mg/mL）1、4、7、10、13、16、20 μL，注入液相色譜儀，測(cè)得峰面積，以對(duì)照品進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y＝942.3X－4.955（r＝1），結(jié)果表明，甘草酸在0.180 3～3.605 4 μg范圍內(nèi)，進(jìn)樣量與峰面積呈良好的線性關(guān)系，可用外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算。

2.7精密度試驗(yàn)

分別取十全大補(bǔ)丸、補(bǔ)中益氣丸和銀翹解毒片同一供試品溶液，分別連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算得甘草酸峰面積的RSD分別為0.69%、1.03%和0.46%，表明儀器精密度良好。

2.8穩(wěn)定性試驗(yàn)

分別精密吸取十全大補(bǔ)丸、補(bǔ)中益氣丸和銀翹解毒片同一供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果十全大補(bǔ)丸中甘草酸平均含量為0.75 mg/g，RSD＝1.48%；補(bǔ)中益氣丸中甘草酸平均含量為3.35 mg/g，RSD＝0.72%；銀翹解毒片中甘草酸平均含量為3.20 mg/g，RSD＝1.20%。表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

圖1　十全大補(bǔ)丸、補(bǔ)中益氣丸、銀翹解毒片中甘草酸HPLC圖

2.9重復(fù)性試驗(yàn)

分別精密稱取十全大補(bǔ)丸同一批號(hào)（8030953）樣品6份、補(bǔ)中益氣丸同一批號(hào)（0081764）樣品6份、銀翹解毒片同一批號(hào)（0121031）樣品6份，分別按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。結(jié)果十全大補(bǔ)丸中甘草酸平均含量為0.74 mg/g，RSD＝1.01%；補(bǔ)中益氣丸中甘草酸平均含量為3.34 mg/g，RSD＝0.98%；銀翹解毒片中甘草酸平均含量為3.17 mg/g，RSD＝0.56%。表明本方法重復(fù)性良好。

2.10加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的十全大補(bǔ)丸同一批號(hào)供試品（批號(hào)8030983，甘草酸含量為0.74 mg/g）約1.5 g，精密加入0.020 6 mg/mL甘草酸銨對(duì)照品溶液50 mL；精密稱取已知含量的補(bǔ)中益氣丸同一批號(hào)供試品（批號(hào)0081764，甘草酸含量為3.34 mg/g）約0.25 g，精密加入0.018 4 mg/mL甘草酸銨對(duì)照品溶液50 mL；精密稱取已知含量的銀翹解毒片同一批號(hào)供試品（批號(hào)0121031，甘草酸含量為3.17 mg/g）約0.3 g，精密加入0.019 2 mg/mL甘草酸銨對(duì)照品溶液50 mL。按“2.3”項(xiàng)下方法分別制備供試品溶液，并按上述色譜條件測(cè)定甘草酸含量。結(jié)果十全大補(bǔ)丸平均回收率為99.85%（n＝6），RSD＝2.49%；補(bǔ)中益氣丸平均回收率為100.70%（n＝6），RSD＝1.72%；銀翹解毒片平均回收率為100.81%（n＝6），RSD＝1.19%。結(jié)果見(jiàn)表1～表3。

表1　十全大補(bǔ)丸中甘草酸加樣回收率試驗(yàn)

表2　補(bǔ)中益氣丸中甘草酸加樣回收率試驗(yàn)

表3　銀翹解毒片中甘草酸加樣回收率試驗(yàn)

2.11樣品含量測(cè)定

分別取十全大補(bǔ)丸、補(bǔ)中益氣丸、銀翹解毒片各3批樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，每批測(cè)定3次，用外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)表4～表6。

表4　十全大補(bǔ)丸樣品中甘草酸含量測(cè)定結(jié)果（n＝3）

表5　補(bǔ)中益氣丸樣品中甘草酸含量測(cè)定結(jié)果（n＝3）

表6　銀翹解毒片樣品中甘草酸含量測(cè)定結(jié)果（n＝3）

3　討論

甘草中甘草酸的測(cè)定方法較多[2-3]，經(jīng)過(guò)比較，選擇HPLC對(duì)甘草酸進(jìn)行測(cè)定。本試驗(yàn)參考2005年版《中國(guó)華人民共和國(guó)藥典》（一部）甘草項(xiàng)下收載方法[4]，同時(shí)對(duì)流動(dòng)相系統(tǒng)進(jìn)行了摸索，對(duì)乙腈-醋酸系統(tǒng)及甲醇-醋酸系統(tǒng)分別考察，發(fā)現(xiàn)甲醇-醋酸系統(tǒng)更有利于甘草酸與其他成分的分離。

十全大補(bǔ)丸、補(bǔ)中益氣丸、銀翹解毒片供試品溶液制備中，比較了超聲提取和回流提取不同的提取方式，結(jié)果超聲提取效果較好。根據(jù)甘草酸的性質(zhì)，比較了70%乙醇、50%乙醇、甲醇超聲提取對(duì)甘草酸提取率的影響，結(jié)果表明70%乙醇超聲提取所得甘草酸的提取率最高。比較了超聲提取30、40、50、60 min對(duì)甘草酸提取率的影響，結(jié)果表明十全大補(bǔ)丸和銀翹解毒片提取40 min已基本提取完全，補(bǔ)中益氣丸提取50 min已基本提取完全，故確定十全大補(bǔ)丸、補(bǔ)中益氣丸、銀翹解毒片提取時(shí)間分別為40、50、40 min。比較了以70%乙醇為提取溶劑、用量為25、50、75 mL對(duì)甘草提取率的影響，結(jié)果表明，溶劑用量為50 mL時(shí)已經(jīng)提取完全。

取甘草酸銨對(duì)照品，加70%乙醇溶解，注入液相色譜儀，用二極管陣列檢測(cè)器進(jìn)行紫外全波長(zhǎng)掃描（200～400 nm）。結(jié)果表明，甘草酸在254 nm附近有最大吸收峰，且樣品空白無(wú)干擾，故選擇254 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

按進(jìn)口方衛(wèi)生署要求，含甘草成分的產(chǎn)品甘草酸每日服用量不應(yīng)超過(guò)100 mg，按日服劑量折算每1 g供試品中含甘草酸的限量。十全大補(bǔ)丸和補(bǔ)中益氣丸每1 g含炙甘草以甘草酸計(jì)不得多于5.5 mg，銀翹解毒片每1 g含甘草以甘草酸計(jì)不得多于15 mg。十全大補(bǔ)丸、補(bǔ)中益氣丸、銀翹解毒片經(jīng)多批次檢測(cè)所含甘草酸均未超出規(guī)定的日服用限量。

本試驗(yàn)建立的十全大補(bǔ)丸、補(bǔ)中益氣丸、銀翹解毒片中甘草酸含量測(cè)定方法準(zhǔn)確、靈敏、快速、專屬性強(qiáng)，所建立的甘草酸含量測(cè)定方法中供試品溶液制備方法操作簡(jiǎn)便，色譜條件相同，便于今后的生產(chǎn)檢驗(yàn)，提高工作效率，降低檢驗(yàn)成本。該方法可有效控制本品質(zhì)量，提高該品種的可控性，保證產(chǎn)品療效，提高藥品的安全性。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010：80.

[2] 王玉巧,王健斌,趙一玫,等.復(fù)方止咳顆粒中甘草酸含量測(cè)定方法學(xué)研究[J].中國(guó)藥事,2001,25(2)：169-170.

[3] 吳迪,李艷,曾憲儀,等.高效液相色譜法測(cè)定安嗽膠囊中甘草酸的含量[J].中藥新藥與臨床藥理,2011,22(1)：94-96.

[4] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社,2005：59.

Content Determination of Glycyrrhizic Acid in Shiquan Dabu Pills, Buzhong Yiqi Pills,Yinqiao Jiedu Tablets by HPLC

WU Lin, YANG Guang, DU Jing, LIU Ying
(Beijing Tongrentang Technologies Co. Ltd. Pharmaceutical Factory, Beijing 100079, China)

Objective To establish content determination method of glycyrrhizic acid in Shiquan Ddabu Pills, Buzhong Yiqi Pills and Yinqiao Jiedu Tablets. Methods HPLC method was used to determine the content of glycyrrhizic acid in the three preparations. Zorbax SB C18column (150 mm×4.6 mm, 5 μm) was used; Methanol-2.5% Acetic acid (65∶35) was set as the mobile phase at flow rate of 0.8 mL/min; the detection wavelength was 254 nm. Results The linear range of glycyrrhizic acid was in the range of 0.180 3–3.605 4 μg (r=1). The average recovery was 99.85% (n=6) in Shiquan Dabu Pills, 100.70% (n=6) in Buzhong Yiqi Pills, and 100.81% (n=6) in Yinqiao Jiedu Tablets. Conclusion The method is specific, simple and can be used to determine glycyrrhizic acid in the products containting glycyrrhizae.

Shiquan Dabu Pills; Buzhong Yiqi Pills; Yinqiao Jiedu Tablets; glycyrrhizic acid; HPLC

10.3969/j.issn.1005-5304.2016.12.024

R284.1

A

1005-5304(2016)12-0099-04

（2015-10-09）

（2015-10-30；編輯：陳靜）