羅福祥，盧軍，張海英，

1.新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830000：2.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830000

新疆阿魏乙酸乙酯分離部位對HCT116細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響

羅福祥1，盧軍2，張海英1，2

1.新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830000：2.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830000

目的觀察新疆阿魏乙酸乙酯分離部位對人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116遷移和侵襲能力的影響，探討其相關(guān)作用機制。方法將體外不同濃度阿魏乙酸乙酯分離部位作用于人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞24 h，CCK-8法檢測細(xì)胞增殖，計算細(xì)胞生長抑制率和IC50，細(xì)胞劃痕實驗和Transwell小室實驗觀察HCT116細(xì)胞遷移和侵襲能力。結(jié)果新疆阿魏組與順鉑組隨著藥物濃度的增加，OD值逐漸變小，抑制率呈藥物濃度依賴性，新疆阿魏組IC50為43.98 μg/mL，順鉑組IC50為36.77 μg/mL。與空白組比較，經(jīng)新疆阿魏樹脂乙酸乙酯分離部位作用后，HCT116細(xì)胞遷移和侵襲能力明顯減弱（P＜0.01）。結(jié)論新疆阿魏樹脂乙酸乙酯分離部位對人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116的增殖、遷移和侵襲能力具有一定的抑制作用。

新疆阿魏；人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞；遷移；侵襲

結(jié)腸癌是胃腸道常見的惡性腫瘤，在我國死亡率較高。阿魏味苦、辛，性溫，具有殺蟲、散痞、消積的功效[1]。在維吾爾、哈薩克等民族民間常用于治療蟲積腹痛、腹中痞塊、肉食積滯等?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，阿魏提取物倍半萜香豆素類化合物具有抗病毒、抗血管新生、抗氧化、抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用[2-3]。前期研究顯示，新疆阿魏乙酸乙酯分離部位對人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞增殖具有較強的抑制作用及促進細(xì)胞凋亡的作用[4]。本實驗通過細(xì)胞劃痕實驗和Transwell小室實驗觀察新疆阿魏對結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響，探討其相關(guān)作用機制。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞株和藥物

人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞株，中國科學(xué)院上海細(xì)胞所。新疆阿魏，產(chǎn)地新疆伊犁，經(jīng)新疆自治區(qū)中醫(yī)院李永和主任藥師鑒定為傘形科植物新疆阿魏Ferula sinkiangensis K. M. Shen的樹脂，新疆伊犁阿薩克自治州藥檢所檢驗，批號2012001。

1.2主要試劑與儀器

DMEM高糖培養(yǎng)液（批號AZG190856）、胎牛血清（批號F120121）、青鏈霉素混合液（批號SV30010）、0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液（批號SH3004201）、PBS（批號AZE189217），美國Hyclone公司；DMSO（批號67685TT），美國Sigma公司；Cell Counting Kit-8（批號10A01A60），武漢博士德生物公司；Transwell小室（批號2500655），美國密理博公司。超凈工作臺（中國上海智誠ZHJH-C1112B），酶標(biāo)儀（美國Thermo公司），CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo公司），倒置熒光研究級三目顯微鏡（IX71-12FL/PH），移液器（德國Eppendorf公司）。

1.3新疆阿魏乙酸乙酯部位分離

新疆阿魏400 g，研碎成顆粒狀，用2000 mL石油醚（30～60 ℃）超聲提取40 min，溫度小于40 ℃，相同方法提取3次，過濾，濃縮。60 ℃干燥，至無氣泡產(chǎn)生，即得石油醚部位。上述殘渣再用95%乙醇2000 mL相同方法提取1次，過濾，合并提取液，減壓濃縮。濃縮的膏液用硅藻土拌樣分散均勻后，依次用乙酸乙酯、正丁醇、無水甲醇超聲萃取5 min，濾過，濾液濃縮干燥，即得乙酸乙酯、正丁醇、甲醇分離部位。

1.4CCK-8法檢測HCT116細(xì)胞增殖抑制率

收集處于生長對數(shù)期的HCT116細(xì)胞，計數(shù)，調(diào)整其濃度為1×105個/mL。取96孔板，每孔加入細(xì)胞混懸液100 μL，150 μL無菌PBS填充邊緣孔，常規(guī)培養(yǎng)48 h。取新疆阿魏乙酸乙酯分離部位，無菌DMSO助溶后用培養(yǎng)液逐級稀釋成100、50、25、12.5、6.25 μg/mL 5個濃度。棄去孔中原有培養(yǎng)液，給藥組加入含不同藥物濃度的完全培養(yǎng)液200 μL。每組設(shè)6個復(fù)孔。陽性藥順鉑用培養(yǎng)液稀釋成100、50、25、12.5、6.25 μg/mL 5個濃度，每孔200 μL。將96孔板繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24 h，并在此前設(shè)置空白組、對照組。藥物作用24 h后觀察細(xì)胞生長情況并記錄。棄去96孔板中上清液，將CCK-8反應(yīng)溶液配成終濃度為10%DMEM培養(yǎng)液，每孔加入100 μL，置于CO2培養(yǎng)箱孵育1 h。于酶標(biāo)儀波長450 nm處測定OD值。實驗重復(fù)3次，取其平均值，計算細(xì)胞增殖抑制率[（OD值對照組－OD值給藥組）÷（OD值對照組－OD值空白組）×100%]。根據(jù)各濃度抑制率，采用Graphpad Prism5軟件計算IC50。求出3次實驗各濃度的抑制率與IC50，以平均值作為最終結(jié)果。

1.5細(xì)胞劃痕實驗

收集對數(shù)生長期HCT116細(xì)胞，常規(guī)消化，計數(shù)為1×105個/mL的細(xì)胞混懸液。6孔板中每孔加2 mL細(xì)胞混懸液常規(guī)培養(yǎng)，直至細(xì)胞鋪滿單層約80%，用10 μL無菌移液槍槍頭垂直于底面的培養(yǎng)板底部呈“一”字形輕輕劃痕，每孔3條。棄上清液，用培養(yǎng)液清洗劃下細(xì)胞。用完全培養(yǎng)液稀釋DMSO助溶的新疆阿魏乙酸乙酯分離部位至12.5、6.25 μg/mL 2個濃度，陽性對照藥順鉑稀釋至12.5、6.25 μg/mL 2個濃度，6孔板中分別每孔加2 mL，同時設(shè)空白組。常規(guī)培養(yǎng)，鏡下拍照，記錄0、24、48 h劃痕距離。實驗重復(fù)3次，記錄結(jié)果，計算細(xì)胞遷移率[（劃痕時兩側(cè)距離－檢測時距離）÷劃痕時兩側(cè)距離×100%]。

1.6Transwell小室實驗

遷移實驗分組、給藥同“1.5”項。Transwell小室24孔板上層加50 μL無血清DMEM高糖培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱中孵育30 min棄去上清液。藥物作用48 h后將6孔板中上清液棄去，常規(guī)消化、離心，分別以無血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋，計數(shù)，調(diào)整其濃度為3×105個/mL細(xì)胞混懸液，分別加至Transwell小室上層，每孔200 μL，小室下層加600 μL含10%FBS的DMEM高糖養(yǎng)液，常規(guī)培養(yǎng)。48 h后，棄去小室上、下層液，4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min后取出小室，PBS清洗2次后染色。30 min后取出小室，PBS再次清洗，用棉簽拭去小室上層細(xì)胞，鏡下觀察小室上層細(xì)胞是否全部拭去，小室晾干后進行拍照。顯微鏡每孔選取5個視野200目拍照后統(tǒng)計穿膜細(xì)胞數(shù)，計算細(xì)胞遷移抑制率[（空白組穿膜細(xì)胞數(shù)－給藥組穿膜細(xì)胞數(shù)）÷空白組穿膜細(xì)胞數(shù)×100%]。

侵襲實驗分組、給藥同“1.5”項。藥物作用48 h后，活化小室同Transwell小室遷移實驗。將6孔板中上清液棄去，常規(guī)消化、離心，分別以無血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋，細(xì)胞計數(shù)板分別計數(shù)制成1×106個/mL的細(xì)胞混懸液，分別加至Transwell小室上層。每孔200 μL，小室下層加600 μL完全培養(yǎng)液，常規(guī)培養(yǎng)72 h，染色，統(tǒng)計穿膜細(xì)胞數(shù)，計算侵襲抑制率[（空白組穿膜細(xì)胞數(shù)－給藥組穿膜細(xì)胞數(shù)）÷空白組穿膜細(xì)胞數(shù)×100%]。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法

采用Statistics17.0統(tǒng)計軟件進行分析。實驗數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1新疆阿魏乙酸乙酯分離部位對HCT116細(xì)胞增殖的影響

新疆阿魏組與順鉑組隨著藥物濃度的增加，OD值逐漸變小，抑制率呈藥物濃度依賴性。新疆阿魏組IC50為43.98 μg/mL。順鉑組IC50為36.77 μg/mL。結(jié)果見表1。

表1　不同藥物濃度2組細(xì)胞增殖和抑制率比較（±s）

表1　不同藥物濃度2組細(xì)胞增殖和抑制率比較（±s）

注：與0 μg/mL濃度比較，**P＜0.01

（μg/mL） n 新疆阿魏組　順鉑組濃度/ OD值 抑制率/%　OD值 抑制率/% 100 6　0.77±0.16**82.36　0.79±0.01**81.20 50 6　1.12±0.01**55.21　1.02±0.03**63.12 25 6　1.46±0.02**28.09　1.35±0.02**36.96 12.5 6　1.72±0.11**　7.79　1.62±0.02**15.14 6.25 6　1.74±0.10**　6.00　1.74±0.02**5.66 0 6　1.82±0.02　1.82±0.02

2.2新疆阿魏乙酸乙酯分離部位對結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞愈合的影響

細(xì)胞劃痕實驗顯示，一定濃度新疆阿魏乙酸乙酯分離部位能降低人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116的劃痕愈合速度。與空白組比較，各給藥組HCT116細(xì)胞遷移率明顯降低，除24 h順鉑6.25 μg/mL組外，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)果見表2、圖1。

表2　各組結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞遷移率比較（±s，%）

表2　各組結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞遷移率比較（±s，%）

注：與空白組比較，**P＜0.01

組別 n 24 h 48 h新疆阿魏12.5 μg/mL組 5 23.68± 6.02**28.77±8.52**新疆阿魏6.25 μg/mL組 5 34.16±10.56**54.03±4.75**順鉑12.5 μg/mL組 5 30.46± 6.94**35.75±5.89**順鉑6.25 μg/mL組 5 42.03± 7.87 43.33±3.97**空白組 5 51.13± 6.13 72.00±2.03

圖1　藥物對HCT116細(xì)胞愈合的影響

2.3新疆阿魏乙酸乙酯分離部位對HCT116細(xì)胞遷移能力的影響

藥物作用48 h后，進行Transwell小室遷移實驗。與空白組比較，各給藥組HCT116細(xì)胞穿膜數(shù)明顯降低（P＜0.01）。結(jié)果見表3、圖2。

表3　各組結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞遷移能力比較（±s）

表3　各組結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞遷移能力比較（±s）

注：與空白組比較，**P＜0.01

組別 n　穿膜細(xì)胞數(shù)/個　抑制率/%新疆阿魏12.5 μg/mL組 5　61.00±1.23**　70.67±1.08新疆阿魏6.25 μg/mL組 5　123.00±2.24**　40.86±0.59順鉑12.5 μg/mL組 5　6.00±1.00**　97.12±0.43順鉑6.25 μg/mL組 5　8.40±0.89**　95.96±0.48空白組 5　208.00±7.87

圖2　藥物對HCT116細(xì)胞遷移能力的影響

2.4新疆阿魏乙酸乙酯分離部位對HCT116細(xì)胞侵襲能力的影響

藥物作用48 h后，進行Transwell小室侵襲實驗。與空白組比較，各給藥組HCT116細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)明顯降低（P＜0.01）。結(jié)果見表4、圖3。

表4　各組結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞侵襲能力比較（±s）

表4　各組結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞侵襲能力比較（±s）

注：與空白組比較，**P＜0.01

組別 n　穿膜細(xì)胞數(shù)/個　抑制率/%新疆阿魏12.5 μg/mL組 5　44.34±3.54**　55.10±3.61新疆阿魏6.25 μg/mL組 5　72.60±6.04**　26.53±6.17順鉑12.5 μg/mL組 5　13.28±1.58**　86.73±1.61順鉑6.25 μg/mL組 5　20.42±1.58**　79.59±1.61空白組 5　98.36±2.92

3　討論

阿魏屬植物含有許多生物活性物質(zhì)，如單糖、含硫衍生物、香豆素、香豆素類、倍半萜、倍半萜內(nèi)酯和胡蘿卜烷酯等[5-7]。本課題組前期體內(nèi)外實驗顯示，阿魏屬植物提取物在抗腫瘤、降脂、抗氧化等方面均取得有益的研究成果[8-10]，其具有較大的開發(fā)價值。

細(xì)胞遷移是細(xì)胞接收到遷移信號或感受到趨化物質(zhì)后產(chǎn)生的移動，由偽足的形成和延伸、新的黏附位點建立、細(xì)胞收縮和尾部退縮4個循環(huán)步驟組成，通過重復(fù)4個過程向前遷移[11]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞遷移中引領(lǐng)細(xì)胞的出現(xiàn)往往預(yù)示著腫瘤細(xì)胞遷移浸潤的開始。引領(lǐng)細(xì)胞具有特殊的分子表型，相較于跟進細(xì)胞具有更活躍的遷移表型和更強的遷移動力[11-12]。

本研究觀察了新疆阿魏乙酸乙酯部位對人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞增殖的影響，篩選藥物最適濃度，以細(xì)胞劃痕實驗對細(xì)胞遷移實驗做出初步探討，確定合適的藥物濃度、正常的細(xì)胞形態(tài)。以Transwell小室實驗檢測細(xì)胞遷移及侵襲作用，排除劃痕實驗中細(xì)胞增殖對遷移結(jié)果的影響。結(jié)果新疆阿魏乙酸乙酯部位各濃度均對結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲具有一定的抑制作用，且隨著濃度的增高，劃痕痕距愈合減慢，腫瘤細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)減少，呈現(xiàn)一定的濃度依賴性，與空白組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。新疆阿魏雖不及同濃度順鉑對HCT116細(xì)胞的遷移和侵襲抑制作用強，但與空白組比較，新疆阿魏能有效抑制HCT116細(xì)胞的遷移及侵襲，為后期有效成分的提取提供了一定的實驗依據(jù)。

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Effects of Separation Parts of Ethyl Acetate from Ferula Sinkiangensis Resin on Migration and Invasion of HCT116 Cells

LUO Fu-xiang1, LU Jun2, ZHANG Hai-ying1,2
(1. School of Traditional Chinese Medicine, Xinjiang Medical University, Urumqi 830000, China; 2. Affiliated Chinese Medicine Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830000, China)

Objective To investigate the effects of separation parts of ethyl acetate from Ferula sinkiangensis resin on migration and invasion of HCT116 cells. Methods In vitro separation parts of ethyl acetate from Ferula sinkiangensis resin with different concentrations were acted on human colon cancer HCT116 cells for 24 h. CCK-8 method was used to detect cell proliferation, calculate the cell growth inhibition rate and IC50. Method of scratches the legitimacy and Transwell room were used to observe HCT116 cell migration ability. Results With the increase of medicine concentration, OD value in Ferula sinkiangensis resin group and cisplatin group decreased gradually; inhibition ratio and medicine concentration were dependent; IC50was 43.98 μg/mL in Ferula sinkiangensis resin group and 36.77 μg/mL in cisplatin group. Compared with control group, affected by separation parts of ethyl acetate from Ferula sinkiangensis resin, migration and invasion abilities of HCT116 cells were weakened significantly (P＜0.01). Conclusion Separation parts of ethyl acetate from Ferula sinkiangensis resin can reduce proliferation, migration and invasion abilities of HCT116 cells to some extent.

Ferula sinkiangensis resin; human colon cancer HCT116 cells; migration; invasion

10.3969/j.issn.1005-5304.2016.12.017

R285.5

A

1005-5304(2016)12-0069-04

國家自然科學(xué)基金（81260625）

張海英，E-mail：1030737878@qq.com

（2016-01-05）

（2016-01-31；編輯：華強）