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        急性力竭運動對大鼠心肌PKCα、δ和ε表達的影響*

        2016-12-05 02:48:33馬治云
        關(guān)鍵詞:力竭磷酸化心肌細胞

        馬治云

        (九江學(xué)院體育學(xué)院, 江西 九江 332005)

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        急性力竭運動對大鼠心肌PKCα、δ和ε表達的影響*

        馬治云△

        (九江學(xué)院體育學(xué)院, 江西 九江 332005)

        目的:檢測分析急性力竭運動對大鼠心肌蛋白激酶C (PKC)α、δ和ε亞型總蛋白及其磷酸化蛋白表達的影響。方法:健康雄性SD大鼠50只,隨機分為對照組(C組)和急性力竭運動組(AEE組)(n=25),采用一次力竭跑臺運動建立急性力竭運動模型,Western blot法檢測PKCα、δ和ε總蛋白及其磷酸化蛋白的表達水平。結(jié)果:與C組比較,AEE組大鼠心肌PKCα、p-PKCαSer-657、 PKCδ、p-PKCδThr-507及PKCε水平均顯著升高(P<0.05)。結(jié)論:急性力竭運動導(dǎo)致PKCα、PKCδ、PKCε表達水平和PKCα、PKCδ活化水平上調(diào),可能是急性力竭運動導(dǎo)致大鼠心肌損傷的重要因素,三亞型之間的交互作用可能是更重要的因素。

        急性力竭運動;心??;PKCα;PKCδ;PKCε;大鼠

        acute exhaustive exercise(AEE); myocardium; PKCα; PKCδ; PKCε; rats

        【DOI】 10.13459/j.cnki.cjap.2016.04.012

        研究表明,急性力竭運動可造成心肌相對或絕對缺血,運動停止后血流再灌注,導(dǎo)致心肌發(fā)生缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)損傷。本課題組在這方面的研究同樣發(fā)現(xiàn)急性力竭運動會導(dǎo)致心肌損傷[1]。心肌I/R損傷涉及復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,其中心肌細胞中蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)是一類關(guān)鍵的信號分子。PKC亞型多達13種,目前研究的焦點集中在α、δ和ε三亞型上,三者之間可能存在交互作用(cross-talk)[2]。PKC亞型需要活化才能發(fā)揮其作用,磷酸化是其活化的重要標(biāo)志。本研究檢測分析急性力竭運動后大鼠心肌PKCα、δ和ε三亞型的總蛋白及其磷酸化蛋白表達的變化,并探討三者之間的cross-talk可能產(chǎn)生的影響,以期為揭示急性力竭運動導(dǎo)致的心肌I/R損傷的發(fā)生機制提供依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 實驗對象與分組

        健康雄性SD大鼠50只,體重為(256±13)g。常規(guī)分籠飼養(yǎng)(5只/籠),標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動物飼料飼養(yǎng),自由飲食。室溫維持在20℃~22℃,相對濕度為45%~50%,光照時間為12 h/d。大鼠先進行5 d適應(yīng)性飼養(yǎng),同時進行速度為15 m/min、坡度為0、時間為10~20 min跑臺適應(yīng)性訓(xùn)練,休息1 d后隨機分為兩組(n=25):對照組(Control,C)和急性力竭運動組(acute exhaustive exercise,AEE)。

        1.2 動物模型的建立與兩組運動方案

        參考Hao等[1]的文獻報道,采用一次性力竭跑臺運動建立急性力竭運動模型。C組大鼠置于靜止跑臺上;AEE組大鼠進行速度為30 m/min、坡度為0的跑臺運動,運動至力竭。大鼠腹部著地,四肢癱軟,翻正反射暫時消失,視為力竭。力竭運動開始前進行5 min熱身運動,速度從15 m/min 逐漸增加到30 m/min。

        1.3 取材

        C組置于靜止跑臺上2 h后取材,AEE組完成急性力竭運動30 min后取材。取材程序為:大鼠行腹腔注射10%水合氯醛(400 mg/100 g),麻醉后,以仰臥位于解剖臺上固定,開胸暴露心臟。取心臟,用滅菌生理鹽水漂洗干凈,放入Eppendorf管后投入液氮中,最后轉(zhuǎn)存進-80℃冰箱備用。

        1.4 大鼠心肌組織PKCα、δ和ε與p- PKCαSer-657、δThr-507和εSer-729蛋白的檢測

        每組隨機選取9個心臟的凍融心肌組織塊,按如下基本流程進行檢測:(1)心肌組織塊稱重、粉碎、勻漿、裂解;(2)采用Bradford比色法測定蛋白質(zhì)濃度;(3)制備SDS-PAGE電泳分離膠和積層膠;(4)上樣;(5)電泳;(6)電轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜;(7)加PKCα、δ和ε或p- PKCαSer-657、δThr-507和εSer-729一抗(1∶3 000),GADPH一抗(1∶10 000),4℃過夜,抗原抗體結(jié)合;(8)Western blot試劑盒顯色,X光曝光膠片,掃描膠片,Image J軟件分析特異性條帶的灰度值。

        1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

        2 結(jié)果

        2.1 大鼠心肌組織PKCα、δ和ε總蛋白水平變化

        與C組比較,AEE組PKCα、PKCδ、PKCε蛋白表達水平均顯著升高(P<0.05,表1)。

        GroupPKCα/GAPDHPKCδ/GAPDHPKCε/GAPDHC0.77±0.070.61±0.120.64±0.08AEE1.00±0.17?0.77±0.18?0.98±0.34?

        C: Control; AEE: Acute exhaustive exercise group; PKC: Protein kinase C

        *P<0.05vscontrol group

        2.2 大鼠心肌組織PKCαSer-657、δThr-507和εSer-729磷酸化蛋白水平變化

        與C組比較,AEE組p-PKCαSer-657蛋白、p-PKCδThr-507蛋白水平顯著升高(P<0.05),p-PKCεSer-729蛋白水平輕微下降,無統(tǒng)計學(xué)差異(表2)。

        Groupp?PKCα/GAPDHp?PKCδ/GAPDHp?PKCε/GAPDHC0.88±0.070.72±0.081.18±0.24AEE1.17±0.26?0.92±0.22?1.14±0.25

        PKC: Protein kinase C

        *P<0.05vscontrol group

        3 討論

        PKCα與心肌肥大、擴張性心肌病和心肌缺血損傷等有關(guān)[3]。研究發(fā)現(xiàn),PKCα表達或活化水平的變化對心肌收縮力產(chǎn)生重要調(diào)節(jié)作用。PKCα活化后定位在多種亞細胞結(jié)構(gòu)上,可通過多種方式下調(diào)心肌細胞的收縮力。本研究發(fā)現(xiàn)提示急性力竭運動導(dǎo)致心肌細胞內(nèi)PKCα在活化水平上調(diào)后,可能定位在各種亞細胞結(jié)構(gòu)上,發(fā)揮多種調(diào)節(jié)心肌細胞功能的作用,尤其是下調(diào)心肌收縮力,導(dǎo)致心臟泵血功能下降,從而引發(fā)疲勞直至力竭。

        PKCδ 主要作為一種促凋亡蛋白起作用[4]。Inagaki等[5]使用豬心AMI模型,在再灌注前在體冠狀動脈內(nèi)施加PKCδ特異性活性抑制肽δV1-1干預(yù),僅需1 min,就能明顯減小心肌梗塞面積、改善心臟功能、抑制cTnT釋放和減少心肌細胞的凋亡。這提示抑制PKCδ的活性,有利于減輕心肌細胞的損傷和提高心肌細胞的存活率。Murriel等[6]發(fā)現(xiàn)I/R后心肌細胞中PKCδ的活化產(chǎn)生關(guān)鍵性的促凋亡作用。本研究中,與C組比較,AEE組大鼠心肌組織PKCδ和 p-PKCδThr-507蛋白水平都顯著升高,提示AEE組大鼠心肌PKCδ活化水平上調(diào),這可能導(dǎo)致心肌細胞凋亡的發(fā)生。

        研究表明,PKCε在對抗心肌I/R損傷中起關(guān)鍵作用。使用特異性激活劑活化PKCε,可以保護心臟[7]。該現(xiàn)象在小鼠、大鼠和豬等物種的離體心肌細胞、離體灌注心臟和在體實驗中都得到了驗證。研究表明,在心肌細胞中PKCε參與調(diào)節(jié)sarcoKATPchannel、mitoKATPchannel、MPTP和Cx43(connexin43,連接蛋白43)等的結(jié)構(gòu)和功能。以上提示,PKCε可以調(diào)節(jié)心肌細胞的多種亞細胞結(jié)構(gòu)的功能。在本研究中,與C組比較,AEE組大鼠心肌組織PKCε蛋白水平顯著上升,但 p-PKCεSer-729蛋白水平無明顯變化,提示急性力竭運動不會引起PKCε的活化水平上調(diào)。從前述分析可知,PKCε的活化水平上調(diào)有利心肌的存活。

        PKC亞型之間存在cross-talk,使得各亞型的功能表現(xiàn)出時空協(xié)調(diào)的特征,可能對信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)在功能上統(tǒng)一是至關(guān)重要的。PKCδ和PKCε在心肌細胞中存在cross-talk,對執(zhí)行不同的功能而言,既可能是相互拮抗,也可能是相互協(xié)調(diào)。就對抗缺血誘導(dǎo)的心肌損傷而言,兩者的cross-talk表現(xiàn)為相互拮抗[8]。目前,有關(guān)心肌細胞中PKCα與PKCδ、PKCα與PKCε之間cross-talk的文獻報道尚未出現(xiàn),但是出現(xiàn)了非心肌細胞中PKCα與PKCδ、PKCα與PKCε之間cross-talk的報道[9,10]。本研究中,急性力竭運動導(dǎo)致AEE組大鼠心肌細胞中PKCα的表達水平和活化水平均上調(diào);PKCδ表達和活化水平都上調(diào);PKCε蛋白表達水平上調(diào),但活化水平未上調(diào),上述這些變化可能產(chǎn)生復(fù)雜的cross-talk,綜合起來對急性力竭運動作用下的心肌產(chǎn)生影響。

        綜上所述,急性力竭運動導(dǎo)致PKCα、PKCδ表達和活化水平上調(diào)、PKCε表達水平上調(diào),可能是急性力竭運動導(dǎo)致大鼠心肌損傷的重要因素,三亞型之間的cross-talk可能是更重要的因素。

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        國家自然科學(xué)基金資助項目(31071031)

        2015-05-21

        2016-02-01

        G804.23

        A

        1000-6834(2016)04-333-03

        △【通訊作者】Tel: 15979955718; E-mail: longhorse1971@163.com

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