， ， ， ， 國(guó)彬(武昌理工學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院， 湖北 武漢 430223)

赤霉素及光照對(duì)白芨種子無(wú)菌萌發(fā)的影響

代建麗，張露，郭鮮蒲，周，張國(guó)彬
(武昌理工學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院， 湖北 武漢 430223)

以白芨蒴果為材料，采用涂布法接種白芨種子，研究植物激素和光照對(duì)白芨種子無(wú)菌萌發(fā)的影響。結(jié)果表明，種子分散良好，光照顯著促進(jìn)白芨種子的萌發(fā)，6-BA是影響種子萌發(fā)的主要因素，赤霉素對(duì)種子萌發(fā)作用不明顯。在1/2 MS+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA+0.5 mg/L GA3的培養(yǎng)基上，白芨種子萌發(fā)率達(dá)90%，萌發(fā)時(shí)間較短，形成的幼苗健壯。

白芨種子； 萌發(fā)； 植物激素； 光照

白芨(Bletillastriata(Thunb.)Reichb.f.)為蘭科白芨屬多年生草本植物，其干燥塊莖為中藥白芨。中藥白芨是《中國(guó)藥典》收載品種，具有收斂止血、清熱利濕、消腫生肌等功效，在我國(guó)已有上千年的藥用歷史。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，白芨還具有抗腫瘤作用和抑菌作用。臨床上白芨代血漿被用于治療失血性休克[1]。白芨應(yīng)用范圍的不斷擴(kuò)大導(dǎo)致藥材需求急劇擴(kuò)增。由于缺乏胚乳，需要共生菌共生萌發(fā)，白芨種子在自然條件下萌發(fā)率極低[2]，自然繁殖速度緩慢，野生資源瀕臨滅絕。分株繁殖等傳統(tǒng)種植方法難以滿足規(guī)模栽培的需要。利用組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行快速繁殖可為白芨的資源保護(hù)和可持續(xù)利用提供新的途徑。

目前已有較多白芨離體培養(yǎng)的報(bào)道，假鱗莖[3]、幼根[4]、花莖[5]、側(cè)芽[6]、蒴果[7-13]等都有用作外植體的研究。6-BA 、KT 、NAA、2，4-D是應(yīng)用較多的植物激素，以6-BA 和NAA的組合應(yīng)用最多，濃度范圍為0～3.0 mg/L，赤霉素的使用尚無(wú)報(bào)道。研究結(jié)果一致顯示，蒴果中的種子是最容易培養(yǎng)成功的材料。1/2 MS是最適的種子萌發(fā)基本培養(yǎng)基，效果優(yōu)于MS、KC、VW。白芨種子萌發(fā)存在萌發(fā)周期長(zhǎng)、萌發(fā)率相對(duì)其他種子低的現(xiàn)象。在種子萌發(fā)的環(huán)境條件比如光照方面已有不同研究，有些采用暗培養(yǎng)[7]，有些研究采用暗培養(yǎng)后光照培養(yǎng)[8]，而大部分研究采用光照培養(yǎng)[9-12]。為了提高白芨種子的萌發(fā)率，本試驗(yàn)采用赤霉素誘導(dǎo)白芨種子萌發(fā)，并探討光照對(duì)白芨種子萌發(fā)的影響。

1 材料與方法

1.1 材 料

當(dāng)年收獲的白芨蒴果，種子胚齡21周，產(chǎn)自湖北京山。

1.2 方 法

1.2.1 白芨種子萌發(fā)培養(yǎng)基

表1 白芨種子萌發(fā)培養(yǎng)基因素和水平

水平6?BA(mg/L)NAA(mg/L)GA3(mg/L)10．50．50．521．01，01．0

以1/2 MS為基本培養(yǎng)基，以不同濃度6-BA、NAA、GA3為考察因素，進(jìn)行3因素2水平正交試驗(yàn)，具體水平見(jiàn)表1。由于白芨種子細(xì)小，1個(gè)蒴果中含有數(shù)萬(wàn)粒種子，撒種容易導(dǎo)致種子堆疊，影響萌發(fā)并影響計(jì)數(shù)，為便于分散種子和后續(xù)實(shí)驗(yàn)觀察種子萌發(fā)，采用培養(yǎng)皿涂布法培養(yǎng)白芨種子。每處理3個(gè)重復(fù)。

1.2.2 白芨種子的消毒和接種

將白芨蒴果用自來(lái)水清洗干凈，再用去離子水沖洗3次，瀝干。轉(zhuǎn)入超凈臺(tái)用75%乙醇浸泡20 s，無(wú)菌水洗滌1次，再用0.1%氯化汞消毒10 min，無(wú)菌水洗滌5次，無(wú)菌濾紙吸干表面水分。用手術(shù)刀剖開蒴果，將白芨種子轉(zhuǎn)入無(wú)菌的培養(yǎng)皿中，取出適量用于解剖觀察幼胚，其余加入稀瓊脂攪拌均勻，用移液槍吸取1 mL含種子的稀瓊脂，加入到種子萌發(fā)培養(yǎng)基上，用涂布棒涂布均勻，晾干后封口。

1.2.3 培 養(yǎng)

將每個(gè)處理分成2組，一組放入光照培養(yǎng)箱，1 000 lx培養(yǎng)5 d后2 500 lx培養(yǎng)至種子萌發(fā)；另一組持續(xù)暗培養(yǎng)，待光照培養(yǎng)組全部萌發(fā)后，將一半種子轉(zhuǎn)移到光下培養(yǎng)，另一半繼續(xù)暗培養(yǎng)。培養(yǎng)后每隔2 d觀察記錄種子的萌發(fā)情況，30 d后統(tǒng)計(jì)種子萌發(fā)結(jié)果。每個(gè)培養(yǎng)皿中的種子數(shù)以有胚率種子計(jì)算，即培養(yǎng)皿中的種子數(shù)以培養(yǎng)皿中的實(shí)際種子數(shù)乘以90%為標(biāo)準(zhǔn)。萌發(fā)率(%)=萌發(fā)種子數(shù)/接種種子數(shù)×100%。

1.2.4 幼苗的培養(yǎng)

1個(gè)月后，將萌發(fā)生長(zhǎng)良好的白芨幼苗轉(zhuǎn)接到MS培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)，待幼苗長(zhǎng)到2 cm以上進(jìn)行移栽。同時(shí)觀察由暗培養(yǎng)轉(zhuǎn)到光照培養(yǎng)的白芨種子的萌發(fā)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 光照對(duì)白芨種子萌發(fā)的影響

將培養(yǎng)皿分別放入光照培養(yǎng)箱和暗培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，5 d后觀察發(fā)現(xiàn)，2種白芨種子顏色變深，體積增大。1周后，光照培養(yǎng)的白芨種子顏色轉(zhuǎn)綠，暗培養(yǎng)的白芨種子沒(méi)有轉(zhuǎn)綠(圖2，圖3)。2周后，光照培養(yǎng)的種子變大，開始萌發(fā)，而暗培養(yǎng)的種子變成淺黃色，未萌發(fā)(圖4，圖5)。3周后，光照培養(yǎng)的種子大部分已經(jīng)萌發(fā)，暗培養(yǎng)的種子顏色變?yōu)楹稚?，未萌發(fā)。4周后，光培養(yǎng)種子長(zhǎng)大，長(zhǎng)出第2片葉(圖6)，基部根毛突起明顯(圖7)，暗培養(yǎng)種子無(wú)變化(圖8)。將暗培養(yǎng)的種子一半轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)，另一半繼續(xù)暗培養(yǎng)，2周后，轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)的種子有48%左右開始萌發(fā)，暗培養(yǎng)的種子一直沒(méi)有萌發(fā)，慢慢變成褐色。實(shí)驗(yàn)表明，光照促進(jìn)白芨種子的萌發(fā)。

圖9 5周白及幼苗繼代培養(yǎng)

圖10 5周白芨幼苗(局部)

圖11 2個(gè)月的白芨幼苗

圖12 2個(gè)月的白芨幼苗(局部)

2.2 激素對(duì)白芨種子萌發(fā)的影響

將培養(yǎng)皿放入光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，1周后光照培養(yǎng)的白芨種子顏色轉(zhuǎn)綠，2周后種子開始萌發(fā)，3周后白芨種子大部分萌發(fā)，4周后形成2片葉子，基部出現(xiàn)根毛。5周后將白芨幼苗轉(zhuǎn)入MS培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)(圖9，圖10)，4周后白芨幼苗長(zhǎng)到2 cm左右，有4片左右幼葉，具根，可以移栽(圖11，圖12)。不同培養(yǎng)基上白芨種子的萌發(fā)情況見(jiàn)表2。

表2 不同培養(yǎng)基中白芨種子的萌發(fā)率

序號(hào)NAA(mg/L)6?BA(mg/L)GA3(mg/L)萌發(fā)率(100%)第1次第2次第3次平均值11(0．5)1(0．5)1(0．5)74．279．076．876．7212(1．0)2(1．0)86．78287．585．432(1．0)1286．381．184．083．8422188968991Ⅰ1162．1160．5167．7Ⅱ2174．8176．4169．2k222R6．357．950．75

從表2可知，試驗(yàn)條件下，NAA、6-BA、GA3對(duì)白芨種子萌發(fā)率的影響由大到小依次為6-BAgt;NAAgt;GA3，GA3對(duì)白芨種子萌發(fā)無(wú)顯著促進(jìn)作用。在3種激素的濃度水平中，以NAA 1.0 mg/L、6-BA 1.0 mg/L、GA30.5 mg/L為最適濃度。方差分析結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，原因可能是實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)較少和白芨種子的生理狀態(tài)不盡相同。

3 結(jié)論與討論

白芨種子眾多，但受各種條件限制難以萌發(fā)，白芨種子萌發(fā)技術(shù)將極大的促進(jìn)白芨的種質(zhì)保存和資源利用。張建霞較早開始了白芨胚發(fā)育和種子萌發(fā)關(guān)系的研究，發(fā)現(xiàn)白芨種子的有胚率和萌發(fā)率隨胚齡增大而增大，胚齡20周左右的種子最適合培養(yǎng)[13]。趙漫麗等研究了激素和添加劑對(duì)白芨種子萌發(fā)的影響，發(fā)現(xiàn)6-BA對(duì)種子萌發(fā)和原球莖增殖有較明顯的促進(jìn)作用[8-11]，一些添加劑如椰子汁、活性炭也具有促進(jìn)作用；種子萌發(fā)一般需要20～30 d；種子萌發(fā)率較低，已報(bào)道資料中90%都在80%以下。本試驗(yàn)首次嘗試用涂布法接種白芨種子，結(jié)果白芨種子分散良好，比播種法便于統(tǒng)計(jì)和觀察。在種子萌發(fā)培養(yǎng)基中，結(jié)合6-BA和NAA首次加入了赤霉素，結(jié)果顯示，6-BA是白芨種子萌發(fā)的主要影響因素，與已有研究結(jié)論相同，赤霉素對(duì)種子萌發(fā)無(wú)明顯的促進(jìn)作用，具體原因有待進(jìn)一步研究。光照作為種子萌發(fā)的環(huán)境條件，已有的研究結(jié)果不盡相同，本試驗(yàn)表明，光照顯著地促進(jìn)白芨種子的萌發(fā)，暗培養(yǎng)的種子不能萌發(fā)，轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)后萌發(fā)率降低，萌發(fā)時(shí)間延長(zhǎng)。本試驗(yàn)中，白芨種子的萌發(fā)率較高，4個(gè)處理中一個(gè)低于80%，另外3個(gè)處理都在80%以上，可能與涂布法接種的種子數(shù)量較少、分散均勻、便于統(tǒng)計(jì)有關(guān)。本試驗(yàn)建立的方法適合白芨種子的無(wú)菌萌發(fā)。

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Effect of GA3and Light on the Seed Germination ofBletillastriata

DAIJianli,ZHANGLu,GUOXianpu,ZHOUZhou,ZHANGGuobin
(College of Life Science,Wuchang University of Technology,Wuhan Hubei 430223,China)

The mature capsule ofBletillastriatawas used to study the effect of GA3and light on the germination of seed.Spread-plate method was adopted to inoculate the seeds and the seeds were separated to culture under light or in darkness.Results showed that seeds were evenly distributed in the medium and had good germination rate at 90% with the medium 1/2 MS+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/LNAA+0.5 mg/L GA3.6-BA was the most important factor in seed germination while GA3had small effect.the germination time was short and the seedlings were strong.

Bletillastriataseed; germination; GA3; light

2016-02-22

湖北省教育廳科研項(xiàng)目“組培白芨及其有效成分抗腫瘤作用研究”(編號(hào)：B 2014129)。

代建麗(1978—)，女，湖北隨州人；碩士，講師，主要從事植物細(xì)胞工程方面的研究；E-mail:lilydaijl@126.com。

張國(guó)彬(1973—)，男，河南周口人；碩士，講師，主要從事植物細(xì)胞工程方面的研究；E-mail:zhgbin_1973@qq.com。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2016.07.018

S 567.23+9

A

1001-4705(2016)07-0018-04