， ， ， ， ， 林軒， 坤華(廣西壯族自治區(qū)藥用植物園，廣西藥用資源保護(hù)與遺傳改良重點(diǎn)實驗室， 南寧 530023)

劍葉龍血樹疏松愈傷組織誘導(dǎo)技術(shù)研究

韋瑩，黃寶優(yōu)，繆劍華，王一諾，李翠，李林軒，韋坤華
(廣西壯族自治區(qū)藥用植物園，廣西藥用資源保護(hù)與遺傳改良重點(diǎn)實驗室， 南寧 530023)

為了獲取質(zhì)地好且松散型的愈傷組織，為進(jìn)行劍葉龍血樹細(xì)胞懸浮培養(yǎng)提供材料。本試驗以劍葉龍血樹種子、芽為外植體，研究不同培養(yǎng)基、不同激素組合對劍葉龍血樹愈傷組織誘導(dǎo)和質(zhì)地的影響。結(jié)果表明：以MS為基本培養(yǎng)基，增加適當(dāng)濃度的2，4-D和6-BA能促進(jìn)劍葉龍血樹愈傷組織誘導(dǎo)率的提高，長勢良好，產(chǎn)生的疏松愈傷組織也最多，最佳疏松愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5 mg/L+2,4-D 1.5～2.0 mg/L。

劍葉龍血樹； 疏松愈傷組織； 誘導(dǎo)技術(shù)

劍葉龍血樹(Dracaenacochinchinensis(Lour) S.C.Chen) 又名千年木、血竭樹、交趾龍血樹，是漸危種，屬國家二級保護(hù)植物[1]。劍葉龍血樹具有很高的藥用價值，從其樹脂提取的血竭被稱為麒麟竭，為我國傳統(tǒng)名貴中藥材，在我國已有1 500年以上的使用歷史[2]。據(jù)《本草綱目》記載，龍血竭性溫、平，味甘、咸，無毒，入血分，歸肺、脾、腎三經(jīng)[3]，具有活血化瘀、消腫止痛、收斂止血，軟堅散結(jié)，生肌斂瘡等功效，有“活血圣藥”的美譽(yù)[4-5]，主要分布于云南、廣西、海南等地。

近年來，由于其需求量大再加上高昂的價格致使人們對劍葉龍血樹野生資源實施了掠奪性采伐，劍葉龍血樹野生資源日趨枯竭，瀕臨滅絕，已被列入國家二類中藥保護(hù)品種，中國珍稀瀕危植物品種之一[6]。因此利用生物技術(shù)對其進(jìn)行組培快繁尤為重要。對劍葉龍血樹的研究主要集中在藥物化學(xué)成分、組織培養(yǎng)[7-8]等方面的研究，目前尚未有細(xì)胞懸浮培養(yǎng)方面研究的報道。疏松愈傷組織容易散碎，增殖能力旺盛，有利于愈傷組織建立優(yōu)良的懸浮系，并且在需要時能從中分離出全能性的原生質(zhì)體。本實驗通過探究不同激素對劍葉龍血樹愈傷組織的影響，篩選出能促進(jìn)愈傷組織快速生長且質(zhì)地松散的最佳激素組合，為進(jìn)一步進(jìn)行劍葉龍血樹細(xì)胞懸浮培養(yǎng)提供試驗材料，為保護(hù)和合理開發(fā)劍葉龍血樹提供技術(shù)方法。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試材料種子采自廣西省靖西縣。經(jīng)廣西壯族自治區(qū)藥用植物園黃雪彥老師鑒定該品種為劍葉龍血樹(Dracaenacochinchinensis(Lour) S.C.Chen)，2011年4月11日于廣西藥用植物園離體庫進(jìn)行組織培養(yǎng)和種子發(fā)芽試驗，經(jīng)過誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得愈傷組織。

1.2 方 法

1.2.1 無菌苗的獲得

先用洗潔精水溶液清洗外植體(飽滿種子、種子播種于河沙里萌發(fā)的芽)表面臟物，再進(jìn)行流水沖洗5～8 min，移至超凈工作臺上，用75%酒精將種子和芽浸泡30 s，無菌水沖洗1遍，再用0.1% HgC12浸泡，時間分別為8，12，15 min，無菌水浸泡3次。分別接種于MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度為23～27 ℃，光照強(qiáng)度1 500 lx，光照時間為12～14 h/d，30 g/L蔗糖，5.0 g/L的瓊脂，培養(yǎng)基的pH值為5.8。培養(yǎng)8～15 d便開始出芽(圖1，圖2)，并逐漸長出無菌苗。

1.2.2 愈傷組織的誘導(dǎo)

將無菌苗剪切成0.8～1.2 cm的帶芽莖段，接種于MS基本培養(yǎng)上，培養(yǎng)基分別附加不同濃度配比的2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)和6-BA(6-芐氨基嘌吟)2種植物激素。通過設(shè)計10個處理試驗，篩選出誘導(dǎo)劍葉龍血樹疏松愈傷組織的最佳激素組合，經(jīng)培養(yǎng)40 d后統(tǒng)計誘導(dǎo)結(jié)果。

圖1 種子消毒誘導(dǎo)

圖2 種子誘導(dǎo)出芽

1.2.3 繼代培養(yǎng)

將培養(yǎng)25～30 d的愈傷組織接種到MS+6-BA 0.5 mg/L+2,4-D 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)，每隔1個月轉(zhuǎn)接1次，接種時切除黑色、褐化或者已失去活力的愈傷組織，挑選長勢好的組織進(jìn)行培養(yǎng)，連續(xù)繼代5次。

1.2.4 統(tǒng)計方法

誘導(dǎo)率(%)=形成愈傷組織的外植體塊數(shù)/接種的外植體塊數(shù)×100%;

褐化率(%)=褐化的愈傷組織塊數(shù)/接種的愈傷組織總數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對劍葉龍血樹愈傷組織誘導(dǎo)的作用

以無菌芽為外植體，在添加NAA 0.2 mg/L+6-BA 0.5 mg/L激素的MS、B 5、N 6三種基本培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)。培養(yǎng)40 d后觀察發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)初期(15 d)各處理愈傷組織變化差異不大，培養(yǎng)30 d后3個處理的愈傷組織在生長速度、顏色等方面逐漸出現(xiàn)差異。由表1可見，MS培養(yǎng)基的愈傷組織誘導(dǎo)率最高，為62.9%，褐化率也相對最低，愈傷組織生長旺盛、結(jié)構(gòu)疏松；其次為B 5培養(yǎng)基，而以N 6為基本培養(yǎng)基的愈傷組織誘導(dǎo)效果最差，愈傷組織誘導(dǎo)率最低，顏色淺黃、愈傷組織質(zhì)地緊密，褐化率也最高。因此認(rèn)為，MS培養(yǎng)基較適合劍葉龍血樹疏松愈傷組織誘導(dǎo)。

表1 MS、B 5、N 6培養(yǎng)基對劍葉龍血樹愈傷組織誘導(dǎo)的影響

培養(yǎng)基愈傷組織誘導(dǎo)率(%)褐化率(%)顏 色長 勢MS62．917．1綠色，乳白色生長較快，疏松型愈傷組織較多B557．131．4綠色，少量淺黃色生長速度一般，愈傷組織較疏松N651．445．7少量綠色，淺黃色生長慢，愈傷組織質(zhì)地緊密

2.2 疏松愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基篩選

本實驗采用不同濃度6-BA和2，4-D相結(jié)合的方法對劍葉龍血樹愈傷組織進(jìn)行誘導(dǎo)，結(jié)果見表2。

表2 6-BA、2，4-D不同濃度及組合對劍葉龍血樹愈傷組織誘導(dǎo)的影響

激素及濃度(mg/L)6?BA2，4?D愈傷組織誘導(dǎo)率(%)疏松程度顏色0．10．568．6++綠色0．50．574．3++淡黃色，乳白色1．00．577．1++淺綠色，部分淡黃色1．50．571．4+嫩綠2．00．568．6+綠色0．50．165．7+淺綠色0．51．080．0++綠色0．51．588．6+++乳白色、嫩綠色0．52．085．7++++淺綠色、乳白色0．53．082．9++綠色，淡黃色

在上述10個處理的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，經(jīng)培養(yǎng)10 d后，外植體切口端開始膨大，培養(yǎng)半個月逐漸形成愈傷組織。經(jīng)過培養(yǎng)40 d后統(tǒng)計愈傷組織誘導(dǎo)率及長勢等各指標(biāo)。從表1可以看出，不同植物激素組合對愈傷組織的誘導(dǎo)率、質(zhì)地及色澤均有較大差異。在2個激素組合處理中，當(dāng)2，4-D濃度固定為0.5 mg/L時，隨著6-BA濃度的增長，劍葉龍血樹愈傷組織誘導(dǎo)率在很小幅度上逐漸上升，質(zhì)地變得更緊密、顏色也產(chǎn)生相應(yīng)的變化，在6-BA濃度為1.0 mg/L時，愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)最高，為77.1%，但質(zhì)地和顏色指標(biāo)效果不是最佳，從細(xì)胞懸浮培養(yǎng)材料需要來看，濃度在0.5 mg/L時較為適宜。而在同一6-BA濃度作用下，高濃度的2，4-D愈傷組織誘導(dǎo)率相對均較高，顏色變化不規(guī)律，愈傷組織質(zhì)地由緊密逐漸疏松(圖3，圖4)。這一結(jié)果說明,在誘導(dǎo)愈傷組織時，高濃度的2，4-D能促進(jìn)愈傷組織的生長，其中，以激素組合為MS+6-BA 0.5 mg/L+2,4-D 1.5～2.0 mg/L對愈傷組織誘導(dǎo)最好，愈傷組織誘導(dǎo)率可達(dá)85%以上，產(chǎn)生的愈傷組織生長旺盛，大部分為嫩綠色、顆粒狀的愈傷組織。

圖3 緊密愈傷組織

圖4 顆粒狀、疏松型愈傷組織

3 結(jié) 論

不同種類培養(yǎng)基對劍葉龍血樹愈傷組織誘導(dǎo)和生長有著重要的作用。本實驗分別采用MS、B 5和N 6三種培養(yǎng)基，這3種培養(yǎng)基均能誘導(dǎo)出愈傷組織，MS培養(yǎng)基中愈傷組織誘導(dǎo)率最高，且褐化率最低，可能是由于其具有較高的無機(jī)鹽濃度，能夠提供組織生長所需的礦質(zhì)營養(yǎng)，從而加速愈傷組織的生長。B 5培養(yǎng)基的主要特點(diǎn)是含有較低的銨，銨這一營養(yǎng)成分有可能對培養(yǎng)基有抑制生長的作用，因而愈傷組織誘導(dǎo)率相對較低。N 6培養(yǎng)基特點(diǎn)是KNO3和(NH4)2SO4含量高，褐化嚴(yán)重。未添加2,4-D的條件下，B 5和N 6培養(yǎng)基與6-BA和NAA相結(jié)合能誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，但生長緩慢，愈傷組織質(zhì)量差，因此不是最佳選擇。

生長速度快、疏松易碎的愈傷組織是進(jìn)行植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的關(guān)鍵[9]。一般選用顆粒細(xì)小、疏松易碎、外觀濕潤、鮮艷的白色或淡黃色的愈傷組織作為細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的材料[10]。本研究采用劍葉龍血樹種子和芽作為外植體，采用MS基本培養(yǎng)基附加不同濃度的2,4-D和6-BA激素組合誘導(dǎo)劍葉龍血樹愈傷組織，結(jié)果表明，激素種類和濃度對劍葉龍血樹愈傷組織的誘導(dǎo)效果有一定的影響，2，4-D不僅有利于促進(jìn)誘導(dǎo)外植體產(chǎn)生愈傷組織，而且濃度不同質(zhì)地也存在差異，經(jīng)試驗比較認(rèn)為激素組合MS+6-BA 0.5 mg/L+2，4-D 1.5～2.0 mg/L誘導(dǎo)效果最佳，在該培養(yǎng)基上產(chǎn)生的愈傷組織生長速度較快，質(zhì)地疏松。培養(yǎng)30 d后轉(zhuǎn)接到繼代培養(yǎng)基中培養(yǎng)，長勢良好。

[1]黃莉雅,陳國臣,馬錦林.劍葉龍血樹芽外植體誘導(dǎo)分化[J].廣西林業(yè)科學(xué),2010,39(3):144-146.

[2]高秀麗,張敏,蔣蓓,等.高效液相色譜法測定龍血竭滴丸中龍血素B的含量[J].貴陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2007,32(3):248.

[3]國家藥品監(jiān)督管理局.國家藥品標(biāo)準(zhǔn)[S].WS3-B-2541-2001.

[4]王錦亮,李興從,江東福,等.云南血竭的化學(xué)成分及抗真菌活性[J].云南植物研究,1995,1(3):336.

[5]江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典(上冊)[M].上海:上?？萍汲霭嫔?1986:1 340.

[6]楊春燕,李志宇.劍葉龍血樹葉源血竭及其誘導(dǎo)研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2011(23):90-93,105.

[7]李成,宋啟示.劍葉龍血樹葉化學(xué)成分研究[J].中草藥,2008,39(10):1 456-1 458.

[8]楊曉虹,侯思名,和鳳美,等.劍葉龍血樹愈傷組織的誘導(dǎo)及其增殖培養(yǎng)研究[J].昆明學(xué)院學(xué)報,2009,31(6):64-66.

[9]尹作鴻,朱蔚華.雷公藤愈傷組織懸浮培養(yǎng)的研究[J].生物工程學(xué)報,1992,8(1):95-98.

[10]章偉標(biāo),王姿云,張瑩瑩,等.半夏疏松愈傷組織誘導(dǎo)及高產(chǎn)半夏蛋白懸浮株系篩選[J].浙江理工大學(xué)學(xué)報,2011,28(5):800-803.

Study on the Loose Callus Induction Technology ofDracaenacochinchinensis(Lour) S.C.Chen

WEIYing,HUANGBaoyou,MIAOJianhua,WANGYinuo,LICui,LILinxuan,WEIKunhua

2016-03-28

廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳中醫(yī)藥科技專項(編號：GZPT 1234)；廣西科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計劃項目(編號：桂科合14125008-2-21)。

韋 瑩(1980—)，女(壯族)，廣西都安人；碩士，助理研究員，主要從事藥用植物生物技術(shù)研究；E-mail:wendy371@sohu.com。

韋坤華，女，廣西平南人；博士，主要從事中藥生物技術(shù)研究；E-mail:divinekh@163.com。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2016.08.080

S 567.1+9

A

1001-4705(2016)08-0080-03