， ， ， ， (甘肅出入境檢驗(yàn)檢疫局， 蘭州 730010)

·種子檢驗(yàn)·

利用DNA條形碼與形態(tài)學(xué)相結(jié)合快速鑒定哈麥篩下物

尤佳，黃璽，王溪橋，王軍平，文朝慧
(甘肅出入境檢驗(yàn)檢疫局， 蘭州 730010)

對(duì)哈麥篩下物中3種難辨認(rèn)的雜草種子DNA條形碼基因atp-F/atp-H和psbK/psbI進(jìn)行PCR擴(kuò)增并對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序，以近緣種植物為外類群建立系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)鑒定到屬，輔以形態(tài)學(xué)方法最終鑒定為反枝莧(Amaranthusretroflexus)、千穗谷(Amaranthushypochondriacus)、歐洲油菜(Brassicanapus)。DNA條形碼與傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定相結(jié)合，彌補(bǔ)了單一鑒定方法的局限性，提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性與時(shí)效性。

哈薩克斯坦小麥； 雜草； DNA條形碼

近年來(lái)，隨著國(guó)際貿(mào)易往來(lái)增長(zhǎng)，進(jìn)境種子糧谷攜帶入侵我國(guó)的雜草呈現(xiàn)數(shù)量增多、頻率加強(qiáng)、蔓延范圍擴(kuò)大的趨勢(shì)。2016年一季度質(zhì)檢總局植物疫情截獲通報(bào)顯示，雜草截獲種次占比均為第一，共截獲有害生物93 781種次，其中檢疫性有害生物達(dá)12 772種次。雜草不僅直接危害農(nóng)田、果、桑、林園各種作物，造成減產(chǎn)，使品質(zhì)變劣，而且傳播病蟲(chóng)害，誘發(fā)作物致病[1]。

目前，在出入境檢驗(yàn)檢疫工作中，雜草鑒定以傳統(tǒng)的形態(tài)鑒定為主。然而，形態(tài)鑒定具有一定的局限性，進(jìn)境雜草主要以果實(shí)或種子形態(tài)出現(xiàn)，通常不具備完整的分類鑒定信息，難以準(zhǔn)確鑒定；雜草果實(shí)或種子通常隨進(jìn)境糧谷、羊毛或運(yùn)輸工具等途徑進(jìn)入，在此過(guò)程中經(jīng)常發(fā)生磨損，導(dǎo)致果實(shí)或種子形態(tài)特征不完整，進(jìn)一步加大了鑒定難度；另外，形態(tài)學(xué)鑒定需要專業(yè)人員有豐富的經(jīng)驗(yàn)，甘肅局雜草分類鑒定研究基礎(chǔ)較為薄弱，缺乏相關(guān)方面的專家，在一定程度上影響了口岸檢驗(yàn)檢疫的效率和質(zhì)量。隨著經(jīng)濟(jì)一體化趨勢(shì)以及絲綢經(jīng)濟(jì)帶甘肅黃金段的建設(shè)，會(huì)有越來(lái)越多的境外植物產(chǎn)品進(jìn)入甘肅，外來(lái)入侵雜草的輸入更加直接和頻繁，如要在確保檢驗(yàn)檢疫質(zhì)量的同時(shí)，又能縮短檢驗(yàn)檢疫周期，加快通關(guān)速度，促進(jìn)外貿(mào)健康發(fā)展，就必須利用先進(jìn)的分子生物學(xué)技術(shù)提高檢驗(yàn)檢疫效率。DNA條形碼技術(shù)是利用一段或幾段標(biāo)準(zhǔn)的、易擴(kuò)增的、種間差異顯著大于種內(nèi)差異的 DNA片段來(lái)鑒別物種的新技術(shù)[2]。該技術(shù)有助于發(fā)現(xiàn)新物種，并為解決近似種和隱存種等傳統(tǒng)分類鑒定難題提供新的研究方法與思路。

1 材料與方法

1.1 材 料

哈薩克斯坦小麥篩下物(未知物種雜草)。

1.2 試 劑

植物DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司；DNA膠回收試劑盒購(gòu)自上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；引物由華大基因公司合成，用無(wú)菌去離子水溶解至終濃度為10μmol/L，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 方 法

1.3.1 PCR擴(kuò)增測(cè)序

本實(shí)驗(yàn)選用2對(duì)DNA條形碼atp-F(5’-ACTCGCAC ACACTCCCTTTCC-3’)和atp-H(5’-GCTTTTATGGAAGCT TTAACAAT-3’)，psbK(5’-TTAGCCTTTGTTTGGCAAG-3’)和psbI(5’-AGAGTTTGAGAGTAAGCAT-3’)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序：94 ℃ 4 min，94 ℃ 1 min，50 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min，4 ℃保存。用1.5%瓊脂糖進(jìn)行PCR產(chǎn)物凝膠電泳，用DNA快速純化回收試劑盒回收目的片段，送測(cè)序。

1.3.2 外類群選擇

選擇NCBI blast(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)親緣關(guān)系較近的屬做外類群，序列調(diào)自Genbank。

圖1 基于atpf-atph序列構(gòu)建未知物種及近緣物種部分序列的鄰位相連法分子系統(tǒng)樹(shù)NJ

圖2 基于atpf-atph序列的未知物種X 1、X 2及近緣物種部分序列的遺傳距離

圖3 基于atpf-atph序列構(gòu)建未知物種及近緣物種部分序列的鄰位相連法分子系統(tǒng)樹(shù)NJ

1.3.3 數(shù)據(jù)分析

采用BioEdit軟件進(jìn)行校對(duì)和排序，然后用MEGA6.0、Clustal X軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，采用Neighbor-Joining算法中的Kimura 2-Parameter模型構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，自展分析1 000次。

1.3.4 形態(tài)鑒定

形態(tài)學(xué)輔助鑒定確定物種。

2 結(jié)果與分析

2.1 外類群物種

根據(jù)測(cè)序公司反饋結(jié)果，結(jié)合序列圖譜，選擇序列質(zhì)量得分和有效讀長(zhǎng)最高的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行NCBI blast，得到系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)外類群，序列號(hào)見(jiàn)表1。

2.2 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)與遺傳距離

通過(guò)圖1系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)可以看出，X1、X2與莧屬植物(Amaranthus)聚類在一起，結(jié)合遺傳距離圖2，X1與反枝莧(Amaranthusretroflexus)遺傳距離最小(0.005 3)，刺莧(Amaranthusspinosus)其次(0.007 1)；X2與X1遺傳距離最近(0.007 1)，反枝莧(Amaranthusretroflexus)次之(0.036 2)。

通過(guò)圖3系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)可看出，X3與蕓薹屬(Brassica)聚類在一起，結(jié)合遺傳距離圖4，X3與歐洲油菜(Brassicanapus)、蕪菁(Brassicarapa)、芥菜(Brassicajuncea)遺傳距離最小(0.003 1)，與甘藍(lán)(Brassicaoleracea)較近(0.003 5)，需要形態(tài)學(xué)輔助鑒定。

2.3 形態(tài)學(xué)鑒定比對(duì)

解剖鏡下進(jìn)行進(jìn)一步比對(duì)(圖5)。X1種子近圓形；直徑1 mm，厚0.5 mm；黑色，兩面凸，呈凸透鏡狀，表面光滑有強(qiáng)光澤；周邊較薄，有細(xì)顆粒狀環(huán)帶，因此確認(rèn)為反枝莧(Amaranthusretroflexus)。X2種子近圓形；直徑1.3 mm，厚0.7 mm；紅褐色，兩面凸，呈凸透鏡狀，表面光滑有強(qiáng)光澤，具環(huán)狀邊；種臍黑色，明顯突出，鑒定為千穗谷(Amaranthushypochondriacus)。X 3種子球形，徑長(zhǎng)2 mm；種皮深褐色，表面具不規(guī)則網(wǎng)紋，網(wǎng)眼淺而小，不甚明顯；種臍小，凸起，表面覆蓋白色遺留物，鑒定為歐洲油菜(Brassicanapus)。

表1 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)外類群

序號(hào)種名編號(hào)1Amaranthusspinosus刺莧GQ247902．12Amaranthusretroflexus反枝莧HQ594560．13Betavulgaris甜菜KR230391．14Salicornia(brachiate)海蓬子KJ629115．15Haloxylonammodendron梭梭KF534478．16Haloxylonpersicum白梭梭KF534479．17Chenopodium(simplex)藜HQ594634．18Amaranthushybridus綠穗莧GQ247901．19Brassicanapus歐洲油菜KM454973．110Brassicarapa蕪菁DQ231548．111Brassicajuncea芥菜KT581449．112Brassicaoleraceavar．甘藍(lán)KR233156．113Raphanussativus蘿卜KJ716483．114Sinapisarvensis白芥HQ594867．115Raphanusraphanistrum野蘿卜GQ248045．116VellapseudocytisusGQ248064．117Eutremahalophilum山崳菜KT962846．1

圖4 基于atpf-atph序列的未知物種X 3及近緣物種部分序列的遺傳距離

圖5 未知物種形態(tài)照片

3 討 論

與傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定物種相比，DNA條形碼有顯著的優(yōu)勢(shì)：1) 操作簡(jiǎn)單，只要會(huì)分子生物學(xué)操作的人員就可以對(duì)未知物種有個(gè)大方向的判斷，基本可以鑒定到屬。2) 大大縮短鑒定周期，一定程度上提高了口岸檢驗(yàn)檢疫的效率與準(zhǔn)確性。3) 不受未知物種生長(zhǎng)發(fā)育階段和形態(tài)特征的限制。但是，遺傳距離相近物種僅通過(guò)DNA條形碼技術(shù)是不能準(zhǔn)確鑒定的，主要原因：1) 植物非常容易發(fā)生自交、雜交或網(wǎng)狀式進(jìn)化，同一基因在不同植物類群中進(jìn)化速率不一致，導(dǎo)致植物DNA條形碼要比動(dòng)物DNA條形碼研究復(fù)雜得多，因此對(duì)于植物DNA條形碼來(lái)講，該技術(shù)還只是一個(gè)驗(yàn)證過(guò)程，并未完全成熟[3]。2) 常用的植物DNA條形碼片段或多或少都存在一定局限性。條形碼擴(kuò)增片段通常較短，就極容易出現(xiàn)重復(fù)序列/poly結(jié)構(gòu)，重復(fù)序列導(dǎo)致PCR測(cè)序反應(yīng)酶產(chǎn)生滑動(dòng)，產(chǎn)生非特異性信號(hào)。例如該實(shí)驗(yàn)所用的葉綠體psbK-psbI序列，在很多論文中都證明可以作為鑒定物種的DNA條形碼[4-6]，但是在本實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增莧屬和蕓薹屬植物種子DNA時(shí)，該條形碼擴(kuò)增片段存在poly-A，序列質(zhì)量得分很低。其它常用條形碼，例如trnH-psbA在很多屬植物中擴(kuò)增成功率和物種識(shí)別率方面表現(xiàn)很好[7-8]，但不足的是，該片段存在插入/缺失現(xiàn)象，致使不同植物間該片段長(zhǎng)度變異較大，導(dǎo)致非同屬物種間的比對(duì)較為困難[3]。因此從實(shí)用性和準(zhǔn)確率等角度考慮，以2～3個(gè)條形碼組合為宜。3) 受限于Genebank數(shù)據(jù)庫(kù)，因此必須與傳統(tǒng)分類鑒定相結(jié)合才能下結(jié)論。

單一通過(guò)分子生物學(xué)手段鑒定物種，是很難鑒定到種及種下分類階元的，而且一定程度上也取決于序列的選取。實(shí)驗(yàn)通過(guò)多條基因序列特征比較，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，利用軟件得出與近緣種的遺傳距離，快速將未知物種鎖定在屬的范圍，再通過(guò)形態(tài)分類鑒定佐以補(bǔ)充，確定到種的水平。2種方法相結(jié)合一定程度上彌補(bǔ)了甘肅口岸植物分類鑒定經(jīng)驗(yàn)的不足，同時(shí)提高了口岸截獲外來(lái)物種的鑒定準(zhǔn)確性與時(shí)效性。

[1]李慧.常見(jiàn)雜草識(shí)別與防除原色圖譜[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2009.

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(本欄目責(zé)任編輯：申 曉)

The Rapid Identification of Unknown Weed Seeds in Kazakhstan Wheats with DNA Barcoding and Traditional Morphological Identification

YOUJia,HUANGXi,WANGXiqiao,WANGJunping,WENChaohui

2016-07-07

甘肅出入境檢驗(yàn)檢疫局2015年度科技計(jì)劃項(xiàng)目。

尤 佳(1988—)，女，甘肅蘭州人，農(nóng)藝師，碩士，主要從事出入境植物檢疫相關(guān)工作；E-mail:abbyyj@126.com。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2016.11.121

S 512.1

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1001-4705(2016)11-0121-03