， ， ， ， ， ， (貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 貴陽(yáng) 550025)

二倍體野燕麥染色體的C-帶分析

王亞，胡梅，朱良鵬，陳星灼，耿廣東，張素勤，張慶勤
(貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 貴陽(yáng) 550025)

采用C-帶技術(shù)對(duì)二倍體野燕麥根尖細(xì)胞染色體進(jìn)行了帶型分析，以研究該野燕麥染色體的C-帶特點(diǎn)。結(jié)果表明：二倍體野燕麥具有7對(duì)染色體，其上共有35條帶，其中長(zhǎng)臂具有帶紋19條，包括13條中間帶(I)，6條末端帶(T)；短臂具有8條帶紋，包括2條中間帶(I)，6條末端帶(T)，另外還有1條隨體帶(S)以及7條著絲點(diǎn)帶(C)，其帶型公式為2 n=14=2 CIT++2 CIT+8 CI+T+2 CI+T+S。二倍體野燕麥染色體組成為CC，核型為2 A，屬于較對(duì)稱核型，進(jìn)化指數(shù)為7。

二倍體野燕麥； 染色體； 核型； C-帶

燕麥(AvenasativaL.)屬于禾本科(Gramineae)燕麥屬(AvenaL.)植物，具有抗病、抗逆、耐貧瘠、高營(yíng)養(yǎng)、高蛋白等優(yōu)良特性[1]。普通燕麥?zhǔn)鞘澜鐝V泛種植的一種糧食飼料兼用型作物，在禾谷類(lèi)作物中,其總產(chǎn)量?jī)H次于小麥、水稻、玉米、大麥,位列第5位[2]。燕麥屬包含二倍體、四倍體和六倍體3種不同倍性，大約包括30個(gè)燕麥種。本試驗(yàn)材料二倍體野燕麥具有抗旱、耐冷、耐瘠等特點(diǎn)， 同時(shí)還具有高抗全蝕病、白粉病等優(yōu)良基因[3]。

Giemsa C-帶技術(shù)廣泛應(yīng)用于植物和動(dòng)物細(xì)胞學(xué)研究，可以顯示染色體中異染色質(zhì)的技術(shù)，根據(jù)異染色質(zhì)序列的密集程度和位置不同，而在染色體上不同位置顯示出深淺不同的帶紋，從而區(qū)分出不同染色體；該技術(shù)在同一物種中具有相對(duì)的一致性、穩(wěn)定性，而在不同的物種間又具有較大的多樣性，因此C-帶技術(shù)是鑒定物種和區(qū)分染色體的一種有效手段。本試驗(yàn)通過(guò)C-帶技術(shù)對(duì)二倍體野燕麥染色體進(jìn)行分析，旨在明確該二倍體野燕麥染色體的C-帶特點(diǎn)，為該野燕麥的基因組鑒定，及燕麥和其它禾本科作物的遺傳育種提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

二倍體野燕麥(2 n=2 x=14)由國(guó)家小麥改良中心貴州分中心實(shí)驗(yàn)室保存的純系材料。

表2 二倍體野燕麥的染色體組重要性狀及賦值

材料核型公式ABCD進(jìn)化指數(shù)類(lèi)型二倍體野燕麥2n=2x=14=10m+2sm+2st1．5111．79164．110．2862?1?3?1?72A

注：A、B、C、D分別表示染色體相對(duì)長(zhǎng)度比、平均臂比、不對(duì)稱系數(shù)、臂比大于1.7的比例；“*”為性狀狀態(tài)編碼數(shù)值。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 染色體制片

將二倍體野燕麥種子沖洗干凈后放入含消毒粉和赤霉素的蒸餾水中浸泡6 h，將種子撈出沖洗干凈后置于鋪有濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿中室溫(25 ℃)發(fā)芽，待根長(zhǎng)至2 cm左右時(shí)，剪取根尖用N2O處理2 h，在90%冰醋酸中固定10 min，用蒸餾水沖洗3遍后切取根尖分生區(qū)，酶解滴片，選取分裂相好的片子保存于-20 ℃冰箱。

1.2.2 C-帶分析

將片子置于紫外線交聯(lián)儀(125 mJ/cm2)中交聯(lián)2次，接著在0.2 mol/L HCl(59 ℃)溶液中處理65 s，用蒸餾水沖洗干凈，氣干；轉(zhuǎn)移至Ba(OH)2飽和溶液(25 ℃)中處理7 min，用蒸餾水迅速?zèng)_洗干凈，氣干；放入2×SSC溶液(59 ℃)中處理45 min，取出后直接轉(zhuǎn)入2.5%的Giemsa染液(pH=6.8)中染色至適度，用蒸餾水洗片后氣干；在OLMPUS BX 60顯微鏡下鏡檢，選擇分裂相及染色較好的細(xì)胞用Cellsens Standard攝像系統(tǒng)照相。

選取50個(gè)染色體分散較好的中期細(xì)胞統(tǒng)計(jì)染色體數(shù)目，選取5個(gè)分裂相好且染色清晰的細(xì)胞用于C-帶分析，使用Micro Measure 3.3軟件對(duì)5個(gè)細(xì)胞染色體進(jìn)行測(cè)量后取平均值，按照喬永剛等[4]和李懋學(xué)等[5]的方法，使用Excel對(duì)染色體的相對(duì)長(zhǎng)度、臂比、核型和帶型公式進(jìn)行核型分析，按Stebbins G L[6]的方法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)核型分類(lèi)，按照喬永剛等[4]的方法繪制核型模式圖，按Arano H[7]的方法對(duì)染色體主要性狀進(jìn)行編碼賦值，按照林小虎等[8]方法計(jì)算進(jìn)化指數(shù)，按照J(rèn)ellen E N等[9]關(guān)于燕麥C組染色體命名方法進(jìn)行染色體鑒別和命名。

2 結(jié)果與分析

2.1 二倍體野燕麥的核型分析

通過(guò)對(duì)二倍體野燕麥根尖細(xì)胞的染色體進(jìn)行測(cè)量和統(tǒng)計(jì)分析可知(表1)，二倍體野燕麥的染色體數(shù)目2 n=14條，二倍體野燕麥的全套染色體相對(duì)長(zhǎng)度范圍為5.599%～8.461%，最長(zhǎng)與最短染色體的相對(duì)長(zhǎng)度之比(染色體相對(duì)長(zhǎng)度比)為1.511。7對(duì)染色體中，中部著絲粒染色體(m)有5對(duì)，近中部著絲粒染色體(sm)和近端部著絲粒染色體(st)各一對(duì)，其中第7對(duì)染色體為隨體染色體；二倍體野燕麥的核型公式為2 n=2 x=14=10 m+2 sm+2 st，其核型為2 A類(lèi)型(表2)，為對(duì)稱核型，屬于原始類(lèi)型。六倍體葡萄牙野燕麥為2 B核型[10]，所以該二倍體野燕麥的進(jìn)化程度較低；六倍體燕麥?zhǔn)怯啥扼w燕麥經(jīng)過(guò)多次遠(yuǎn)緣雜交和染色體自然加倍而逐漸進(jìn)化而來(lái)的，本試驗(yàn)研究結(jié)果與燕麥物種的進(jìn)化歷程是一致的。從表2可知，該野燕麥平均臂比為1.791、不對(duì)稱系數(shù)為64.11、臂比大于1.7的比例為0.286，其進(jìn)化指數(shù)為7。

表1 二倍體野燕麥染色體核型分析參數(shù)

染色體編號(hào)相對(duì)長(zhǎng)度(%)長(zhǎng)臂短臂總長(zhǎng)臂比類(lèi)型14．4614．0018．4611．115m25．4052．3137．7182．336sm34．6762．8227．4981．657m45．5971．5937．1903．513st54．2942．5546．8471．588m64．1042．5836．6871．681m73．5212．0785．5991．694m?

注：“*”隨體染色體的隨體不計(jì)長(zhǎng)度。

2.2 二倍體野燕麥的C-帶分析

由二倍體野燕麥根尖細(xì)胞有絲分裂中期細(xì)胞的C-帶核型圖及帶型模式圖(圖1)，以及二倍體野燕麥的染色體帶型分組(圖2)所示，二倍體野燕麥包括7對(duì)染色體，共有35條深淺不同的帶紋，其中長(zhǎng)臂具有帶紋19條，包括13條中間帶(I)，6條末端帶(T)；短臂具有帶紋8條，包括2條中間帶(I)，6條末端帶(T)；另外還有著絲點(diǎn)帶(C)7條，短臂有隨體帶(S)1條。該二倍體野燕麥的染色體帶型公式為：2 n=14=2 CIT++2 CIT+8 CI+T+2 CI+T+S。

根據(jù)二倍體野燕麥C-帶核型分析，該二倍體野燕麥染色體的帶紋深且多，而且都有著絲點(diǎn)帶，該二倍體野燕麥應(yīng)該是C基因組。1 C染色體長(zhǎng)臂和短臂上各有1條端帶，長(zhǎng)臂上還有1條中間帶。2 C染色體的長(zhǎng)臂和短臂各有1條端帶，長(zhǎng)臂上有4條中間帶，短臂上有1條中間帶，中間帶較多。3 C染色體長(zhǎng)臂和短臂上均有1條很深的中間帶，此外長(zhǎng)臂上還有1條淺的端帶。4 C染色體長(zhǎng)臂上有1條帶紋較淺的端帶，還有一強(qiáng)一弱2條中間帶，短臂上有1條帶紋很深的端帶。5 C染色體長(zhǎng)臂和短臂上都有端帶，短臂上的端帶較深，長(zhǎng)臂上另有1條較深的中間帶和1條較淺的中間帶。6 C染色體長(zhǎng)臂上具有2條中間帶，短臂上有1條帶紋很深的端帶和一段隨體帶。7 C染色體長(zhǎng)臂、短臂上都有1條端帶，長(zhǎng)臂上還有1條中間帶，長(zhǎng)臂和短臂上的帶紋均較淺。

圖1 二倍體野燕麥根尖細(xì)胞染色體C-帶核型(A)及其模式圖(B)

注：染色體名稱后括號(hào)內(nèi)數(shù)字：表1中染色體編號(hào)。圖2 二倍體野燕麥的染色體分組

3 討 論

利用C-帶技術(shù)對(duì)植物染色體異染色質(zhì)區(qū)域進(jìn)行顯色是染色體區(qū)分的一種有效手段，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，二倍體野燕麥的帶紋具有較高的穩(wěn)定性。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)合適的分裂時(shí)期對(duì)C-帶的顯色效果有較大影響，前期染色體不夠濃縮，染色體細(xì)長(zhǎng)不易分開(kāi)，從而影響分裂相，進(jìn)而導(dǎo)致不同染色體間帶紋重疊而不利于分析；染色體濃縮過(guò)度時(shí)，導(dǎo)致染色體過(guò)于濃縮，過(guò)于短小，從而導(dǎo)致同一條染色體上相鄰帶紋的間隔太小，帶紋較密，也不利于區(qū)分和分析。因此選擇合適的分裂相顯得尤為重要，對(duì)于二倍體野燕麥來(lái)說(shuō)，選取處于早中期分裂相較好的細(xì)胞進(jìn)行C-帶分析的效果最好。

Fominaya A等[11]對(duì)二倍體和四倍體燕麥，Singh R J等[12-14]對(duì)六倍體燕麥的C-帶研究均顯示，燕麥C組染色體C-帶帶紋較A組多且深，A組染色體多為端點(diǎn)帶，端點(diǎn)帶較強(qiáng)，而中間帶帶紋少而淺，C組染色體則多為中間帶和著絲點(diǎn)帶，且?guī)Ъy較深；Linares C等[15]以此為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)A染色體組和C染色體組進(jìn)行了區(qū)分。二倍體燕麥通常由A或C基因組組成。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)二倍體野燕麥的C-帶分析發(fā)現(xiàn)，該二倍體野燕麥的C-帶帶紋多而且深，所以該野燕麥應(yīng)該為C基因組。劉偉等[2]對(duì)二倍體燕麥的研究結(jié)果表明，二倍體西班牙燕麥第7對(duì)染色體的短臂上有一對(duì)隨體，本試驗(yàn)研究結(jié)果與其一致；二倍體短燕麥的1對(duì)隨體位于第6對(duì)染色體短臂上，不對(duì)稱系數(shù)是63.91，核型為2 A，為比較對(duì)稱的核型，將本試驗(yàn)二倍體野燕麥的C-帶核型和不對(duì)稱系數(shù)與之相比，發(fā)現(xiàn)與其研究結(jié)果基本相似。根據(jù)Stebbins G L[6]關(guān)于核型進(jìn)化趨勢(shì)是由對(duì)稱向不對(duì)稱方向發(fā)展的觀點(diǎn)，該二倍體野燕麥在進(jìn)化程度上較為原始。

本試驗(yàn)與李浩兵等[16]的六倍體通北野燕麥的C-帶核型研究結(jié)果相比，其C組染色體與本試驗(yàn)的C組染色體的帶紋都相對(duì)較深，其帶紋具有相似性，但其C組染色體由1對(duì)中著絲粒染色體和6對(duì)近中著絲粒染色體組成，而本試驗(yàn)的C組染色體則是由5對(duì)中部、1對(duì)近中部和1對(duì)近端部著絲粒染色體組成，表明其C基因組存在差異。將該二倍體野燕麥的C-帶核型與Jellen E N等[9]的“Sun Ⅱ”的C組染色體研究結(jié)果對(duì)比，該二倍體野燕麥1 C染色體長(zhǎng)臂上的端帶較深，而Jellen E N等的1 C染色體長(zhǎng)臂上的端帶帶紋較淺，二倍體野燕麥2 C染色體帶紋多呈點(diǎn)狀，而Jellen E N等的2 C染色體帶紋多集中在著絲點(diǎn)區(qū)域，二倍體野燕麥的3 C、4 C、5 C、6 C和7 C染色體的帶型與“Sun Ⅱ”較為相似，但仍然有一定差異，其差異可能是由于試驗(yàn)材料不同，不同燕麥材料間C基因組C-帶具有多樣性。在植物進(jìn)化過(guò)程中，染色體發(fā)生重復(fù)、倒位、易位、缺失等現(xiàn)象都可能導(dǎo)致染色體C-帶帶紋的變化，從而形成帶型的多態(tài)性[17]。

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C-banding Analysis of Chromosomes in Diploid Wild Oat

WANGYa,HUMei,ZHULiangpeng,CHENXingzhuo,GENGGuangdong,ZHANGSuqin,ZHANGQingqin
(College of Agronomy, Guizhou University, Guiyang 550025, China)

The C-banding analysis of root-tip chromosomes was carried out in diplo-id wild oat in the present study.The result showed that the genome of the diploid wild oat possessed 7 pairs of chromosomes.35 bands were found in the diploid wild oat.19 bands (13 interstitial bands and 6 terminal bands) were located in the long arms，and 8 bands (2 interstitial bands and 6 terminal bands ) were in the short arms.In addition,there were 1 satellite band and 7 centromeric bands.Its C-banding formula was 2 n=14=2 CIT++2 CIT+8 CI+T+2 CI+T+S.The karyotype belonged to the type 2 A,which was relatively symmetrical.The evolution index of the diploid wild oat was 7.The results would provide the reference for the genetics and breeding in oats and other related crops.

diploid wild oat; chromosome; karyotype; C-banding

2016-05-13

國(guó)家自然科學(xué)基金(編號(hào)：31160224)；農(nóng)業(yè)部計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：2011-A 2521-520111-A 0105-013)；貴州省農(nóng)業(yè)攻關(guān)項(xiàng)目(編號(hào)：黔科合NY字[2008]3017，黔科合帶帽字[2009]5002)；貴州大學(xué)自然科學(xué)專(zhuān)項(xiàng)科研基金(編號(hào)：貴大專(zhuān)基合字(2013)01號(hào))；貴州大學(xué)研究生創(chuàng)新基金(編號(hào)：研農(nóng)2016030)。

王 亞(1992—)，男，河南省息縣人；研究生，研究方向：作物遺傳育種；E-mail:1530026291@qq.com。

張素勤(1974—)，女，教授，主要從事麥類(lèi)作物遺傳育種教研工作；E-mail:zsqin2002@163.com。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2016.11.027

S 512.6

A

1001-4705(2016)11-0027-04