， ， ， ， (.貴州省旱糧研究所， 貴陽 550006； .貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院， 貴陽 550006)

抗條銹病小麥-中間偃麥草-華山新麥草雜種后代的分子細(xì)胞遺傳學(xué)鑒定

王艷麗1，王偉1，陳天青1，隋建樞1，何慶才2
(1.貴州省旱糧研究所， 貴陽 550006； 2.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院， 貴陽 550006)

小麥近緣物種中蘊(yùn)藏著許多優(yōu)良基因，創(chuàng)制三屬雜種是小麥遺傳改良的重要途徑。對(duì) 4個(gè)F6代株系采用農(nóng)藝性狀調(diào)查、PMC染色體配對(duì)觀察、GISH和SDS-PAGE等方法分析。結(jié)果表明，4個(gè)株系的染色體數(shù)目均為42條，K-13-649-3、K-13-663-2在細(xì)胞遺傳學(xué)上相對(duì)穩(wěn)定；且均確證為小麥-中間偃麥草易位系；K-13-649-3、 K-13-728-4與親本中3的特異條帶一致，K-13-656-3、K-13-663-2只有3條條帶，缺失了親本中3的1條特異條帶，4個(gè)株系表現(xiàn)為高抗條銹病。

中間偃麥草； 華山新麥草； 基因組原位雜交； 易位系

小麥近緣屬種是小麥遺傳改良的重要基因資源，將優(yōu)良基因引入小麥，對(duì)提高小麥的品質(zhì)、抗性及遺傳多樣性具有重要意義。華山新麥草(PsathyrostachyshuashanicaKeng ex Guo)和中間偃麥草(Thinopyrumintermedium)均屬于小麥的三級(jí)基因源，蘊(yùn)藏著豐富的遺傳變異，是改良普通小麥產(chǎn)量、品質(zhì)、抗病性和抗逆性的重要基因資源[1-2]。通過雙二倍體間雜交來創(chuàng)制三屬雜種是小麥遺傳改良的重要途徑[3-4]。

2005年，四川農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得了小麥-華山新麥草雙二倍體(2 n=8 x=56,AABBDDNsNs)，PHW-SA具有高抗小麥條銹病，細(xì)胞遺傳穩(wěn)定等優(yōu)良特點(diǎn)[3]。PHW-SA與小偃麥中3雜交合成三屬雜種，所獲F1連續(xù)自交至F5，得到大量衍生株系[4-5]。 GISH鑒定表明，F(xiàn)5代存在大量的小麥-中間偃麥草羅伯遜易位和小片段易位染色體[6]。在此基礎(chǔ)之上，本研究以F6代4個(gè)株系為材料進(jìn)行分子細(xì)胞遺傳學(xué)鑒定，以期篩選出抗條銹病新材料，為培育抗病、優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)小麥新品種奠定基礎(chǔ)。

注：a為幼苗期；b為成株期；c為籽粒。圖1 K-656-3田間植株及籽粒性狀

表1 F6代株系與親本主要農(nóng)藝性狀比較

品種及親本株高(cm)旗葉長(zhǎng)(cm)旗葉寬(cm)分蘗數(shù)(個(gè))穗長(zhǎng)(cm)小穗數(shù)(個(gè))穗粒數(shù)(個(gè))芒長(zhǎng)(cm)千粒重(g)K?13?649?3121．02±3．4116．03±1．111．22±0．015．01±0．637．11±1．3121．01±0．5253．70±1．872．91±0．3335．44±2．42K?13?656?3153．34±3．8526．06±1．751．16±0．0911．04±1．6410．63±1．4419．77±0．9853．48±1．755．84±1．2136．31±1．97K?13?663?2106．04±3．1622．05±1．171．23±0．084．07±1．756．20±0．3017．79±1．6035．06±3．08—35．42±1．17K?13?728?4136．36±2．3514．02±1．721．14±0．0511．87±0．9810．13±0．7523．03±0．5558．04±3．40—29．14±1．72PHW?SA(a)137．09±11．5027．34±7．951．56±0．357．59±5．5015．12±3．2024．87±5．0031．25±8．253．90±1．1024．05±7．25中3103．84±6．7520．52±5．421．46±0．467．37±4．6212．50±2．8323．0±4．6856．37±5．043．15±0．9629．90±4．78

注：— 表示不存在；(a)表示數(shù)據(jù)引自康厚揚(yáng)，2008[13]。

1 材料與方法

1.1 材 料

小麥-華山新麥草雙二倍體PHW-SA與部分雙二倍體小偃麥中3雜交后連續(xù)自交獲得的4個(gè)F6株系。

1.2 農(nóng)藝性狀調(diào)查

調(diào)查株高、旗葉長(zhǎng)和寬、分蘗數(shù)、小穗數(shù)、穗粒數(shù)、穗長(zhǎng)、芒長(zhǎng)、千粒重，每個(gè)株系3個(gè)重復(fù)。

1.3 小麥條銹病鑒定

母本PHW-SA、父本小偃麥及其后代衍生系采用混合菌種接種。誘發(fā)材料為高感小麥品系SY 95-71，種植于四周。發(fā)病程度采用3個(gè)指標(biāo)，即普遍率、嚴(yán)重度和反應(yīng)型[7-8]。

1.4 花粉母細(xì)胞染色體配對(duì)觀察

取樣固定：取不同單株幼穗，室溫固定1 d，4 ℃保存。制片：取花藥用苯酚品紅壓片。鏡檢：記錄PMC染色體配對(duì)構(gòu)型。

1.5 高分子量谷蛋白亞基分析

種子高分子量谷蛋白(HMW-GS)的提取參考Marchylo et al.和Sutton的方法[9-10]。SDS-PAGE電泳分析參照Gupta et al.的方法[11]。

1.6 基因組原位雜交

以地高辛標(biāo)記的中間偃麥草總基因組DNA作為探針，J-11基因組DNA為封阻，對(duì)F6代材料進(jìn)行根尖體細(xì)胞有絲分裂中期染色體GISH鑒定。中間偃麥草和J-11葉片DNA提取采用CTAB法[12]，基因組原位雜交具體步驟參照文獻(xiàn)[6]。

2 結(jié)果與分析

2.1 農(nóng)藝性狀調(diào)查與條銹病抗性鑒定

2.1.1 農(nóng)藝性狀調(diào)查

F6代4個(gè)株系及其親本農(nóng)藝性狀結(jié)果見表1。株系K-656-3的幼苗期、成株期及籽粒性狀如圖1所示。

2.1.2 條銹病抗性鑒定

PHW-SA表現(xiàn)為高抗條銹病，反應(yīng)型為0-1，嚴(yán)重度為t，普遍率為t，葉片偶爾顯示壞死或萎黃色的斑點(diǎn)，但沒有孢子形成(圖2 g)。中3表現(xiàn)出高感條銹病，產(chǎn)生大量的孢子，反應(yīng)型為8，嚴(yán)重度為80%～100%，普遍率為100%(圖2 b)。4個(gè)株系表現(xiàn)為高抗條銹病，反應(yīng)型為0-1，嚴(yán)重度為t，普遍率為t，葉片偶爾顯示壞死或萎黃色的斑點(diǎn)，但沒有孢子形成(圖2 c-f)。

注：A為K-13-649-3;B為K-13-656-3;C為K-13-663-2;D為K-13-728-4。圖4 F6代株系減數(shù)分裂中期I花粉母細(xì)胞染色體配對(duì)

表2 F6代株系花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂中期I染色體配對(duì)情況統(tǒng)計(jì)

株系染色體數(shù)目2n觀察細(xì)胞數(shù)單價(jià)體環(huán)狀二價(jià)體棒狀二價(jià)體二價(jià)體總數(shù)三價(jià)體K?13?649?342500．54(0?2)18．30(14?21)2．43(0?6)20．73(20?21)K?13?656?342500．90(0?4)16．72(13?19)3．83(0?7)20．55(18?21)K?13?663?242500．24(0?2)17．65(14?20)3．23(1?6)20．88(20?21)K?13?728?442501．65(0?6)17．88(13?19)2．22(1?6)20．10(18?21)0．05(0?1)

注：a為SY 95-71；b為中3；c為K-13-649-3；d為 K-13-656-3；e為K-13-663-2；f為K-13-728-4；g為PHW-SA。圖2 F6代株系及親本抗條銹病鑒定

2.2高分子量谷蛋白亞基分析

4個(gè)株系及其親本的SDS-PAGE結(jié)果如圖3。K-13-649-3和K-13-728-4具有與中3一致的特異條帶(圖3，第5泳道和第8泳道)。K-13-656-3與K-13-663-2只有3條條帶，缺失了親本中3的一條特異條帶(第6泳道和第7泳道箭頭所示)。

2.3花粉母細(xì)胞染色體配對(duì)分析

花粉母細(xì)胞染色體配對(duì)情況見圖4和表2。 4個(gè)株系的染色體數(shù)目為42條，配對(duì)平均構(gòu)型為0.83個(gè)單價(jià)體，20.57個(gè)二價(jià)體，0.01個(gè)三價(jià)體，其中K-13-649-3和K-13-663-2平均單價(jià)體為0.54和0.24個(gè)(表2)，染色體配對(duì)情況良好，表明在細(xì)胞遺傳學(xué)上相對(duì)穩(wěn)定。而K-13-656-3 和K-13-728-4的平均單價(jià)體分別為0.90和1.65個(gè)(表2)，且K-13-728-4存在三價(jià)體，表明在細(xì)胞遺傳學(xué)上不穩(wěn)定，有待于進(jìn)一步的自交從而達(dá)到穩(wěn)定。

2.4 基因組原位雜交鑒定

4個(gè)株系染色體端部都呈現(xiàn)明顯的點(diǎn)狀黃綠色雜交信號(hào)，染色體其余部分為紅色無信號(hào)，易位多數(shù)發(fā)生在染色體端部，證明這4個(gè)株系是小麥-中間偃麥草易位系(圖5 A-D)。

注：1為中國(guó)春；2為PHW-SA；3為中間偃麥草；4為中3；5為K-13-649-3；6為K-13-656-3；7為K-13-663-2；8為K-13-728-4。圖3 F6代株系及親本谷蛋白電泳圖譜

3 討 論

根尖GISH結(jié)果表明，三屬雜種后代在自交過程中，中間偃麥草比華山新麥草染色體能更好更穩(wěn)定地傳遞給后代，和陶珊[6]的研究結(jié)論一致。小麥遠(yuǎn)緣雜交的諸多實(shí)踐也表明，普通小麥與中間偃麥草的雜交親和性比華山新麥草好，說明中間偃麥草的染色體與小麥染色體之間關(guān)系較近，同源性較強(qiáng)[14]。易位發(fā)生在染色體端部，可能是端部易位只需要1次交換或2次斷裂和1次重融，并且在染色體端部存在著重組熱點(diǎn)區(qū)域[15]。易位系的形成有利于將外源有益基因?qū)氲狡胀ㄐ←溨?。本研究所確證的4個(gè)易位系均為雜合，為創(chuàng)制純合易位系提供了堅(jiān)實(shí)的理論和物質(zhì)基礎(chǔ)，也為深入研究染色體結(jié)構(gòu)及易位機(jī)制提供了理論依據(jù) 。研究表明，在PHW-SA中，親本的條帶消失以及產(chǎn)生了一些新的帶紋，第1或第6同源群染色體上的相應(yīng)DNA序列發(fā)生了變化，原因可能是某些位點(diǎn)發(fā)生突變引起的[16]。SDE-PAGE的結(jié)果符合前人的研究，在遠(yuǎn)緣雜交后代中新的亞基的出現(xiàn)或者原有亞基的丟失現(xiàn)象較為普遍[13,17]，這為研究遠(yuǎn)緣雜交后代中基因沖擊或沉默提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。

注：A為K-13-649-3;B為K-13-656-3;C為K-13-663-2;D為K-13-728-4。圖5 PHW-SA×中3三屬雜種F6代根尖染色體GISH檢測(cè)

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Molecular Cytogenetic Characterization of the Derivatives from Wheat-Thinopyrumintermedium-PsathyrostachyshuashanicaHybrids with Resistance to Stripe Rust

WANGYanli1，WANGWei1，CHENTianqing1，SUIJianshu1，HEQingcai2
(1.Guizhou Research Institute of Arid Crops,Guiyang 550006,China;2.Guizhou Academy of Agricultural Sciences,Guiyang 550006,China)

The relatives of wheat possess a large number of useful genes,Creating trigeneric hybrids is an important way for inherited improvement.In this study,Four F6lines derived from the cross of PHW-SA×Zhong 3 were identified using agronomic traits investigation,cytogenetics,GISH and SDS-PAGE.The results showed that all lines had 42 chromosomes,Lines K-13-649-3 and K-13-663-2 were stable on the cytogenetics.These 4 lines were wheat-Th.intermediumtranslocation lines.K-13-649-3 and K-13-728-4 expressed specific glutenin bands consistent with their parent Zhong 3.K-13-656-3 and K-13-663-2 only expressed three bands,one specific glutenin band was disappeared in these two lines.All lines showed high resistance to stripe rust.

Thinopyrumintermedium;Psathyrostachyshuashanica; genomic in situ hybridization;translocation lines

2016-05-17

國(guó)家小麥產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系經(jīng)費(fèi)資助(編號(hào):CARS-2-43)。

王艷麗(1987—)，女，研究實(shí)習(xí)員，主要從事小麥遺傳育種工作；E-mail：yanliwang1987@163.com。

何慶才(1963—)，男，研究員，主要從事作物遺傳育種工作；E-mail：gznkykqc@yeah.ne。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2016.10.006

S 512.1

A

1001-4705(2016)10-0006-04