■黃勇剛

（四川省眉山市東坡區(qū)環(huán)境監(jiān)測(cè)站　四川　眉山　620000）

研究微生物細(xì)胞傳感器在環(huán)境監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用進(jìn)展

■黃勇剛

（四川省眉山市東坡區(qū)環(huán)境監(jiān)測(cè)站四川眉山620000）

針對(duì)微生物細(xì)胞傳感器在環(huán)境監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用進(jìn)行分析，總結(jié)了調(diào)節(jié)基因、啟動(dòng)子部分的應(yīng)用進(jìn)展，報(bào)告基因部分的應(yīng)用進(jìn)展等，認(rèn)為在微生物細(xì)胞傳感器中，最為重要的內(nèi)容便可以感應(yīng)污染物質(zhì)的啟動(dòng)子以及對(duì)調(diào)節(jié)基因系統(tǒng)。同時(shí)解釋了lux主要由A、B、C、D、E幾個(gè)部分組成。此外，還討論了對(duì)報(bào)告基因表達(dá)機(jī)制的調(diào)控，報(bào)告菌株的固定化和生物芯片技術(shù)以及微生物細(xì)胞傳感器研究的展望等內(nèi)容，以期為生物細(xì)胞傳感器在環(huán)境監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

微生物細(xì)胞傳感器環(huán)境監(jiān)測(cè)基因系統(tǒng)

微生物細(xì)胞傳感器主要指的是通過(guò)一定的時(shí)間以及一些固定化方法對(duì)毒性環(huán)境或者特定污染物具有一定的感應(yīng)能力，將微生物菌株以及存在信號(hào)轉(zhuǎn)換功能的介質(zhì)相互連接，并借此設(shè)備經(jīng)信號(hào)放大并輸出。這種裝置可以對(duì)環(huán)境中的毒效應(yīng)起到一定的感應(yīng)作用，但是當(dāng)下新發(fā)展的特異性微生物細(xì)胞傳感器已經(jīng)可以對(duì)某一類別的污染物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)。

1　調(diào)節(jié)基因、啟動(dòng)子部分的應(yīng)用進(jìn)展

在微生物細(xì)胞傳感器中，最為重要的內(nèi)容便可以感應(yīng)污染物質(zhì)的啟動(dòng)子以及對(duì)調(diào)節(jié)基因系統(tǒng)。根據(jù)全細(xì)胞系統(tǒng)構(gòu)建過(guò)程中所遵循的目標(biāo)有所不同，選用啟動(dòng)系統(tǒng)也存在著較大的差異[1]。非特異性的生物傳感器具備的啟動(dòng)子是通過(guò)組成型進(jìn)行表達(dá)的。不管在何種情況下，都會(huì)對(duì)其后的基因進(jìn)行啟動(dòng)，進(jìn)而產(chǎn)生信號(hào)。但是對(duì)于半特異性傳感器而言，因?yàn)槠淇梢詫?duì)一些較為特殊的脅迫產(chǎn)生一定的感應(yīng)，因此對(duì)啟動(dòng)子系統(tǒng)進(jìn)行選用也是對(duì)這種類型壓力一級(jí)脅迫具備一定感應(yīng)能力的。例如SOS反映中的recA、熱激反映中具備的rpoH啟動(dòng)子。特異性傳感器可以對(duì)一些化學(xué)污染物起到一些報(bào)告作用，因此這種類型的傳感器存在的調(diào)節(jié)基因、啟動(dòng)子系統(tǒng)類型較多，但仍舊存在著共同選擇的原則。

2　報(bào)告基因部分的應(yīng)用進(jìn)展

報(bào)告基因是檢測(cè)目的基因的一種表達(dá)手段，并被廣泛的使用在分子生物學(xué)的研究中。在一個(gè)特定的條件下，可以對(duì)報(bào)告基因進(jìn)行啟動(dòng)表達(dá)，對(duì)蛋白進(jìn)行編碼和報(bào)告，這種類型的蛋白產(chǎn)生一定的光信號(hào)或者相應(yīng)的顏色反映，能夠在不對(duì)菌體生長(zhǎng)情況帶來(lái)影響的情況下被靈敏檢測(cè)出來(lái)，這就為原位和在線檢測(cè)提供了有力條件。報(bào)告基因基本上被分為以下幾個(gè)特點(diǎn)：（1）對(duì)報(bào)告基因進(jìn)行表達(dá)的活性定量方式一定要簡(jiǎn)單。（2）報(bào)告的蛋白量以及活性一定要通過(guò)目標(biāo)分析物的質(zhì)量進(jìn)行反應(yīng)。（3）在細(xì)胞體內(nèi)部，存在少量或者沒(méi)有和蛋白作為同源性的相似蛋白或酶。當(dāng)下，微生物細(xì)胞傳感器方面存在的報(bào)告基因主要有l(wèi)uxCDABE、lacZ、gfp等。

通常情況下，不同類型的發(fā)光菌中存在著徐細(xì)菌熒光素酶基因lux，當(dāng)前，人們已經(jīng)從哈氏弧菌、明亮發(fā)光桿菌以及費(fèi)氏弧菌等大量發(fā)光菌中克隆出這種類型的基因。這種基因可以被分為A、B、C、D、E幾個(gè)部分，這五種組成部分中的AB屬于編碼兩條多肽鏈組合而成的熒光素酶，而CDE分別是編碼還原酶、轉(zhuǎn)移酶以及合成酶。這三種酶相互聚合，形成了一種酶復(fù)合物[2]。FMNH2，也就是細(xì)菌熒光素催化還原性黃素單核苷酸，以及FMN，即長(zhǎng)鏈脂肪醛屬于黃素單核苷酸產(chǎn)生如下反映：

在這種反應(yīng)中，可能會(huì)產(chǎn)生一定的藍(lán)色光或者綠色光，Lux具有較高的蛋白靈敏度，不必再添加底物，在普通的額菌株中不存在內(nèi)源活性，但它也存在著一定的缺點(diǎn)。例如在對(duì)定時(shí)線性進(jìn)行測(cè)定的過(guò)程中，其范圍比較窄，這就導(dǎo)致其熱穩(wěn)定性不高。

近幾年，相關(guān)研究者從多管水母屬的Aequorea victoria中將天然熒光蛋白GFP進(jìn)行分離，其也在生物傳感器的報(bào)告系統(tǒng)中被廣泛應(yīng)用。GFP在進(jìn)行報(bào)告蛋白的過(guò)程中存在的最大的優(yōu)勢(shì)就是其自身具備的熒光，這種方式并不需要格外加上底物。與此同時(shí)，GFP屬于較為穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，在這之中產(chǎn)生的一些變種可能會(huì)達(dá)到24h。但是對(duì)于一些較為普通的蛋白，通常情況下僅僅是40min，即便在較弱的啟動(dòng)子條件下，或者其生理代謝條件不是很強(qiáng)的條件下，GFP同樣可以在細(xì)胞中生長(zhǎng)很長(zhǎng)時(shí)間。因此可以將GFP在實(shí)時(shí)、連續(xù)的監(jiān)測(cè)中使用。而且進(jìn)行GFP熒光信號(hào)進(jìn)行監(jiān)測(cè)是比較簡(jiǎn)單的，不必再添加相應(yīng)的底物，只需要對(duì)其采用395nm或者488nm波長(zhǎng)的燈進(jìn)行照射便可[3]。GFP可以在異源細(xì)胞中穩(wěn)定的將熒光進(jìn)行表達(dá)和發(fā)射，在此過(guò)程中不必增加輔助因子，對(duì)于細(xì)胞來(lái)說(shuō)也沒(méi)有任何毒性，對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)十分方便。因此，GFP這種標(biāo)記基因，已經(jīng)成為對(duì)環(huán)境微生物進(jìn)行研究的這一過(guò)程中比較方便而有效的工具，但這種蛋白也存在著一定的缺點(diǎn)。例如，這種方式具備的敏感性不是很高，需要對(duì)其進(jìn)行翻譯并修飾，只有這樣才能發(fā)出熒光。因此，對(duì)宿主細(xì)胞提出了一定的要求。在一些生物系統(tǒng)中可能會(huì)存在著背景干擾，并且對(duì)一些類型的細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生一定的毒害作用。

大腸桿菌中的編碼β-半乳糖苷酶中的lacZ在報(bào)告基因系統(tǒng)中應(yīng)用最早的一種，同時(shí)也是當(dāng)前應(yīng)用比較廣泛的基因，也就是β-Galactosidase。β-Galactosidase可以在β-半乳糖苷在水解過(guò)程中產(chǎn)生一定的催化作用，也正是其具備這一特性，所以可以快速的將其檢測(cè)出來(lái)[4]。對(duì)這種酶進(jìn)行檢測(cè)的過(guò)程中，方法眾多，例如比色法、電化學(xué)法、組織化學(xué)法等。這一報(bào)告蛋白具有較好的靈敏度和穩(wěn)定性，并且存在著比較寬的線性范圍。其中最重要的一點(diǎn)是當(dāng)期處于厭氧調(diào)價(jià)下，還可以進(jìn)行l(wèi)acZ基因進(jìn)行表達(dá)，但是其具備的條件一般是報(bào)告基因中缺乏的條件。這種基因的缺點(diǎn)主要是，在大多數(shù)細(xì)胞中均存在著內(nèi)源活性，這就導(dǎo)致背景值提高。而在實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中，需要格外添加底物。

3　對(duì)報(bào)告基因表達(dá)機(jī)制的調(diào)控

通常情況下，將調(diào)節(jié)基因和啟動(dòng)子系統(tǒng)報(bào)告基因表達(dá)機(jī)劃分為兩種形式。第一種是可可以進(jìn)行誘導(dǎo)的負(fù)控模式，所調(diào)節(jié)的基因主要是一個(gè)編碼阻遏蛋白的基因，可以經(jīng)這種蛋白和啟動(dòng)子相互結(jié)合。進(jìn)而使RNA聚合酶以及這一位點(diǎn)的結(jié)合被阻止，從而致使相關(guān)人員不能對(duì)后面的基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯。當(dāng)環(huán)境中有目標(biāo)物質(zhì)出現(xiàn)時(shí)，目標(biāo)物質(zhì)會(huì)對(duì)足額單位構(gòu)像進(jìn)行誘導(dǎo)，使其發(fā)生改變，并從啟動(dòng)子位點(diǎn)分離出去。在這個(gè)時(shí)候，RNA聚合酶就會(huì)向上聚合，開(kāi)始對(duì)后面存在的報(bào)告基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯，進(jìn)而產(chǎn)生相應(yīng)的信號(hào)。第二種機(jī)制使一種可誘導(dǎo)正控制，對(duì)基因編碼進(jìn)行調(diào)節(jié)，并激活蛋白。但如果沒(méi)有目標(biāo)化學(xué)物質(zhì)，這種蛋白的單體就無(wú)法和啟動(dòng)序列之間相互結(jié)合，進(jìn)而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄翻譯過(guò)程不能完成。如果環(huán)境中有可以和激活蛋白相結(jié)合的目標(biāo)化學(xué)物質(zhì)時(shí)，這種蛋白便會(huì)產(chǎn)生一定的構(gòu)像變化，這時(shí)就會(huì)使啟動(dòng)子位點(diǎn)結(jié)合并激活，當(dāng)RNA聚合酶之間結(jié)合的時(shí)候，報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄翻譯完成。

4　報(bào)告菌株的固定化和生物芯片技術(shù)

4.1報(bào)告菌株的固定

通常情況下，對(duì)報(bào)告菌株進(jìn)行報(bào)告和篩選會(huì)在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)獲得較好的檢測(cè)結(jié)果，這時(shí)會(huì)碰到較多的束縛條件。因此，要利用一些介質(zhì)，將報(bào)告菌株進(jìn)行固定，使其在一個(gè)特定的材料上，通過(guò)這樣的方式可以讓菌株的活性被保持，并且可以將原來(lái)的一些信號(hào)進(jìn)行適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)換并且放大，通過(guò)這樣的方式可以進(jìn)一步將其制作成芯片，為檢測(cè)信號(hào)的獲得奠定一定的基礎(chǔ)。

4.2生物芯片技術(shù)

生物芯片技術(shù)屬于上個(gè)世紀(jì)90年代發(fā)展的新興技術(shù)并結(jié)合微加工技術(shù)而構(gòu)成的，可以通過(guò)很多方式對(duì)對(duì)中生物樣品進(jìn)行處理。與此同時(shí)，可以將其包含的不同生物信息適當(dāng)?shù)慕馕?，通過(guò)這樣的方式實(shí)現(xiàn)分析和檢測(cè)的目的。生物芯片技術(shù)中主要涉及了生物、化學(xué)、光學(xué)等內(nèi)容[5]。對(duì)生物傳感器技術(shù)進(jìn)行使用的最終目的是進(jìn)行生物感應(yīng)原件和一些信號(hào)生產(chǎn)、轉(zhuǎn)換等過(guò)程進(jìn)行整合，將其放入到芯片中去。通過(guò)這樣的方式，可以使其的實(shí)際使用性能得到有效提升。

5　生物細(xì)胞

因?yàn)槲⑸锛?xì)胞傳感器在運(yùn)行過(guò)程中速度較快，并且可以進(jìn)行在線連續(xù)監(jiān)測(cè)，因此在現(xiàn)代環(huán)境分析和檢測(cè)中較為合適?？梢?jiàn)，在不遠(yuǎn)的將來(lái)，這一技術(shù)將被廣泛的應(yīng)用在環(huán)境檢測(cè)領(lǐng)域，并且在這一領(lǐng)域內(nèi)大放異彩。但當(dāng)下，仍舊存在著較多的因素對(duì)這一技術(shù)起著限制作用。因此，在今后的研制工作中，也會(huì)圍繞著這一內(nèi)容進(jìn)行分析。

5.1實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中的相應(yīng)時(shí)間

它是對(duì)導(dǎo)入微生物細(xì)胞的啟動(dòng)子進(jìn)行研究，它主要對(duì)倒入微生物強(qiáng)啟動(dòng)子對(duì)污染物帶來(lái)影響的進(jìn)行研究，同時(shí)也是檢測(cè)過(guò)程中的關(guān)鍵內(nèi)容，這種檢測(cè)直接對(duì)傳感器的靈敏度和精確性，也對(duì)相應(yīng)時(shí)間進(jìn)行控制。為了對(duì)這以難點(diǎn)進(jìn)行更進(jìn)一步的了解，還需要對(duì)細(xì)菌基因的表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)方面的知識(shí)進(jìn)行更深的研究。對(duì)這一問(wèn)題進(jìn)行研究的過(guò)程中，需要將微生物轉(zhuǎn)錄分析以及后基因組學(xué)的相關(guān)信息進(jìn)行適當(dāng)?shù)慕Y(jié)合，通過(guò)這樣的方式，將會(huì)使找到不同污染物變得更加有效。此外，在發(fā)展過(guò)程中，出現(xiàn)了大量不同新的污染物，污染物的數(shù)量也逐漸增多，這就需要找到跟對(duì)不同污染物產(chǎn)生相應(yīng)的調(diào)控原件，這樣就能使不同的環(huán)境條得到適應(yīng)。

5.2信號(hào)轉(zhuǎn)換和便攜式傳感器的研制

對(duì)信號(hào)轉(zhuǎn)換器和便攜式傳感器進(jìn)行研制，當(dāng)前這種技術(shù)發(fā)展的關(guān)鍵內(nèi)容。因?yàn)?，在?shí)際檢測(cè)過(guò)程中，需要能夠原位、快速并精準(zhǔn)，所以需要獲得相對(duì)靈敏的轉(zhuǎn)換介質(zhì)，從而精準(zhǔn)并快速的將可測(cè)量信號(hào)進(jìn)行轉(zhuǎn)化和放大[7]。與此同時(shí)，為了使其更加方便的在實(shí)際環(huán)境的監(jiān)測(cè)中應(yīng)用，需要對(duì)將這一技術(shù)作為核心的一些傳感設(shè)備和儀器進(jìn)行研制，這就需要對(duì)相應(yīng)生物傳感器報(bào)告菌株進(jìn)行固定，使其在生物芯片當(dāng)中。這樣，可以將信息的感應(yīng)、轉(zhuǎn)換、集成以及檢測(cè)均放在一個(gè)芯片上，從而可以迅速的完成。

5.3傳感器細(xì)胞生物穩(wěn)定性和一致性的問(wèn)題

因?yàn)閷?duì)這種傳感器進(jìn)行使用的過(guò)程中，生物活體是一種敏感元件，因此將其在實(shí)際毒性環(huán)境檢測(cè)中應(yīng)用時(shí)，需要?dú)饩邆湟欢ǖ姆€(wěn)定性和長(zhǎng)期性。當(dāng)前，業(yè)內(nèi)已經(jīng)存在一些文章和微生物菌體活性保持相關(guān)的文章，如相關(guān)學(xué)者對(duì)如何利用冷凍干燥、真空干燥以及繼代培養(yǎng)等固定技術(shù)等方式對(duì)菌體的活性進(jìn)行保持的方法。

5.4假陰性問(wèn)題的研究

假陰性現(xiàn)象的存在會(huì)產(chǎn)生錯(cuò)誤結(jié)果，因?yàn)樵诩?xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中，會(huì)有諸多因素對(duì)其產(chǎn)生影響，例如營(yíng)養(yǎng)狀況、溫度或者含氧量等。但伴隨著污染物組分的逐漸發(fā)展，其會(huì)變得越來(lái)越復(fù)雜，毒物的濃度也會(huì)逐漸升高，這種情況下，容易導(dǎo)致細(xì)胞活力喪失而死亡，這時(shí)將檢測(cè)不到信號(hào)，導(dǎo)致測(cè)量結(jié)果出現(xiàn)偏差，從而出現(xiàn)假陰性結(jié)果。為了方式這一錯(cuò)誤結(jié)果的發(fā)生，當(dāng)前較為常見(jiàn)的方式為：第一種，對(duì)細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行科學(xué)利用，對(duì)其生長(zhǎng)環(huán)境中的總體毒性做出指示，但是針對(duì)報(bào)告基因的表達(dá)信號(hào)來(lái)說(shuō)，經(jīng)特定的毒物或者遭到的脅迫進(jìn)行指示。第二種方式就是對(duì)雙報(bào)告基因系統(tǒng)進(jìn)行科學(xué)利用，可以將一些在細(xì)胞內(nèi)處于恒量低水平表達(dá)的基因?qū)?，例如racA，并且可以將這種基因具備的變大情況動(dòng)作是其基線系統(tǒng)對(duì)目標(biāo)毒物做出指示，或者對(duì)壓力進(jìn)行脅迫。

6　結(jié)束語(yǔ)

當(dāng)前，微生物傳感器已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用，在未來(lái)的發(fā)展過(guò)程中也會(huì)為環(huán)境質(zhì)量檢測(cè)做出巨大的貢獻(xiàn)。相關(guān)人員需要做的就是其技術(shù)進(jìn)行不斷的創(chuàng)新和完善，對(duì)這一技術(shù)進(jìn)行發(fā)展，從而使我們預(yù)期的目標(biāo)得以實(shí)現(xiàn)，這樣有望使我國(guó)環(huán)境問(wèn)題得到緩解。

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The microbial cells sensors in environmental monitoring analysis,summed up the gene,application progress promoter portion is adjusted,to report on progress applications such as part of a gene that in a microbial cell sensor,the most important content can be induced pollution promoter substances and regulating gene system.Meanwhile lux explained mainly by the A,B,C,D,E of several parts.It also discusses the reporter gene expression mechanism of regulation of the reporter strain immobilization and biotechnology as well as prospects Sensor microbial cell chip,etc.,in order to provide a theoretical basis for the biological cell sensor applications in environmental monitoring.

microbial cell sensor;environmental monitoring;gene system

X8[文獻(xiàn)碼]B

1000-405X（2016）-9-357-2