張國亮 ，呂利群,2

(1.國家水生動物病原庫，農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源利用重點實驗室，上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院，上海 201306;2.淡水水產(chǎn)健康養(yǎng)殖湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，武漢 430070)

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高度耐藥嗜水氣單胞菌的定向誘導及其交叉耐藥性分析

張國亮1，呂利群1,2

(1.國家水生動物病原庫，農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源利用重點實驗室，上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院，上海 201306;2.淡水水產(chǎn)健康養(yǎng)殖湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，武漢 430070)

為了分析比較不同抗生素對耐藥嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)的誘導效率，從五大類抗生素中各挑選出一種代表性的抗生素，在針對嗜水氣單胞菌菌株AH10的防耐藥突變濃度(mutant prevention concentration,MPC)的瓊脂平板上，分別篩選出五株耐藥菌株，并對篩選的耐藥菌株進行交叉耐藥性分析，制定出這些耐藥菌株對常用抗生素的最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentrations,MIC)圖譜。結(jié)果顯示:四環(huán)素、氟苯尼考、磺胺嘧啶、硫酸新霉素、諾氟沙星對AH10的MIC分別為：1.0、0.5、8.0、8.0、0.25 μg/mL;MPC分別為4.0、3.0、128、88、2.0 μg/mL，分離的耐藥菌株對所使用抗生素的MIC均提高100倍以上。4 ℃劃線平板冰箱保存條件下，一個月內(nèi)個別耐藥菌株耐藥性下降。在藥物篩選壓力下，菌株耐藥性隨著傳代次數(shù)增多而表現(xiàn)出遞增的趨勢。同屬一類抗生素耐藥相關(guān)性較高；不同大類抗生素壓力下篩選出來的耐藥菌株表現(xiàn)出不同的交叉耐藥性。

嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)；耐藥性；抗生素；交叉耐藥

由嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)引起的細菌性敗血癥是水產(chǎn)養(yǎng)殖中較嚴重的疾病之一。水產(chǎn)養(yǎng)殖中被廣泛應用于治療敗血癥的抗生素有磺胺類、喹諾酮類、四環(huán)素類、酰胺類以及氨基糖苷類五大類。隨著各類抗生素應用越來越廣泛，魚藥濫用、混用現(xiàn)象嚴重。加上缺乏相應的規(guī)范性法律法規(guī)[1]，導致耐藥性問題日趨嚴重，多重耐藥現(xiàn)象突出，給水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防治帶來很大的困難。

李愛華等[1]對嗜水氣單胞菌耐藥性進行了系統(tǒng)的研究，為研究多重耐藥性提供了依據(jù)。李煥榮等[2]對采集的嗜水氣單胞菌菌株進行了藥物敏感性實驗，發(fā)現(xiàn)耐藥現(xiàn)象較為嚴重，且耐藥性呈現(xiàn)增加的趨勢。Kaskhedikar等[3]發(fā)現(xiàn)采集到的嗜水氣單胞菌對青霉素產(chǎn)生的耐藥率達到了100%。朱芝秀等[4]發(fā)現(xiàn)從江西分離的嗜水氣單胞菌對不同抗生素均有耐藥性，耐藥率最高的達到94%。以上研究表明：嗜水氣單胞菌耐藥性在不同地區(qū)，不同年代略有差異，但總體偏高。耐藥性一但產(chǎn)生，很難消失，且會引起更為復雜的耐藥及多重耐藥機制，影響深遠[5]。

為了解在長期低劑量用藥情況下嗜水氣單胞菌的交叉耐藥性及耐藥變化情況，本研究從五大類抗生素中各挑選出一種代表性的抗生素，針對每種抗生素篩選出五株耐藥菌株，對其進行最小抑菌濃度(MIC)圖譜測定，繪制交叉耐藥圖譜，從而對比其耐藥性及交叉耐藥性，為臨床用藥提供有力依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

本實驗室從上海崇明某養(yǎng)殖場患典型嗜水氣單胞菌性敗血癥瀕死草魚體內(nèi)分離，鑒定后定名為嗜水氣單胞菌AH10，現(xiàn)保存于上海海洋大學國家水生動物病原庫。

1.2 試劑

Muller-hinton(MH)培養(yǎng)基購于北京陸橋科技有限公司；16S rDNA 引物由上海生工生物工程有限公司合成，27F：5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′；1492R：5′-CTACGGTTACCTTGTTACGAC-3′。沙拉沙星購于南京精瑞久安生物技術(shù)有限公司，純度為98%，批號為20131105；甲風霉素購于上海將來實業(yè)有限公司，純度為98.5%，批號為JL140822005；氧氟沙星(純度≥99%)、強力霉素(純度≥98%)、磺胺嘧啶(純度≥99%)、諾氟沙星(純度≥98%)、四環(huán)素(純度≥98%)、磺胺甲基嘧啶(純度≥98%)、硫酸慶大霉素(純度≥99%)、硫酸新霉素(純度≥98%)均購于生工生物工程有限公司；恩諾沙星(純度≥98.5%)購于浙江國邦藥業(yè)有限公司，氟苯尼考(純度≥98%)購于上海笛柏化學品技術(shù)有限公司。

1.3 原代菌株MIC、MPC測定

從劃線保存的單個平板上挑取AH10單菌落于MH培養(yǎng)基中，培養(yǎng)16 h，參考陳儉清等[6]方法計數(shù)，將懸浮菌液濃度調(diào)整至106CFU/mL，抗生素濃度配制為1 280 μg/mL。將1.8 mL菌液與0.2 mL抗生素溶液充分混勻，參考戴自英等[7]2倍稀釋法。30 ℃搖床培養(yǎng)24 h，以能抑制細菌生長的最小抗生素濃度為該抗生素對AH10的MIC。單菌落AH10接種于MH培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，計數(shù)后，4 000 r/min離心8 min，將菌液調(diào)整為3×1010CFU/mL,采用瓊脂平板法[8]，分別配制濃度為1 MIC～16 MIC抗生素平板，將調(diào)整好的菌液吸取100 μL涂布于平板上，72 h平板上沒有長出菌落的最低濃度抗生素即為該抗生素對AH10的MPC。

1.4 耐藥菌株獲得及耐藥獲得速率評價

1.4.1 耐藥性獲得

將五種抗生素MPC平板上菌落數(shù)不大于5的平板上所長出的單菌落挑取后接種于MH培養(yǎng)基，過夜培養(yǎng)，取菌液劃線，再次挑取單菌落接種于MH培養(yǎng)基，過夜培養(yǎng)，參考徐麗娟[9]的方法，采用16S rDNA通用引物進行PCR擴增。測序后，將所得序列與AH10菌株16S序列上傳至美國國立信息技術(shù)生物中心(NCBI，登錄號：KP999952)比對，相同者作為原代耐藥株。

將得到的原代耐藥菌株單菌落接種過夜培養(yǎng)，將所得菌液稀釋至1×107CFU/mL[10]，吸取100 μL到抗生素濃度分別為1 MIC～10 MIC的MH培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)。第2天取最大抗生素濃度MH培養(yǎng)基中的菌液，劃線，挑取單菌落，再次接種于MH培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)后，將所得菌液稀釋至1×107CFU/mL，吸取100 μL到抗生素濃度更高的MH培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)。如此反復操作，每次設(shè)置10個梯度，梯度間隔為1MIC，直到原代耐藥株能在含有100 MIC抗生素濃度的MH培養(yǎng)基中生長。每傳三代鑒定一次，所得序列與AH10菌株16S序列不同者舍去，細菌過夜培養(yǎng)12 h為1代。將抗生素誘導后的MIC=4倍誘導前MIC定為該菌株對該種抗生素耐藥[10]。 按照此方法，共獲得耐藥菌株25株。將耐四環(huán)素的五株耐藥菌株定名為：A1、A2、A3、A4、A5；將耐諾氟沙星的五株耐藥菌株定名為：B1、B2、B3、B4、B5；將耐氟苯尼考的五株耐藥菌株定名為：C1、C2、C3、C4、C5；將耐磺胺嘧啶的株耐藥菌株定名為：D1、D2、D3、D4、D5；將耐硫酸新霉素的五株耐藥菌株定名為：E1、E2、E3、E4、E5。

1.4.2 耐藥獲得速率

將每次傳代測得的MIC值與最初的MIC值進行比較，繪制耐藥獲得速率圖，對其耐藥速率進行評價。

1.5 耐藥菌株對常見抗生素的交叉耐藥

1.5.1 交叉耐藥

將最終耐氟苯尼考、四環(huán)素、諾氟沙星、硫酸新霉素、磺胺嘧啶的菌株分別挑取單菌落接種于MH培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)24 h，按照本文1.3的方法對沙拉沙星、硫酸新霉素、氟苯尼考、磺胺嘧啶、諾氟沙星、強力霉素、氧氟沙星、恩諾沙星、四環(huán)素、甲風霉素、硫酸慶大霉素進行MIC的測定，繪制耐藥圖譜。

1.5.2 交叉耐藥比率

每株耐藥菌株均是由抗生素誘導，除去誘導該菌株產(chǎn)生耐藥性的抗生素，交叉耐藥程度的判斷公式為：

菌株的交叉耐藥比率=(M-1/F-1)×100%。

M表示該菌株所耐抗生素數(shù)。F表示該菌株所測試抗生素總數(shù)。分析比較耐藥百分比，繪制耐藥百分比圖譜，百分比越高，交叉耐藥越顯著[11]。

1.5.3 耐藥菌株對各種抗生素耐藥比率

氟苯尼考、四環(huán)素、諾氟沙星、硫酸新霉素、磺胺嘧啶為誘導AH10耐藥的抗生素，除去本身誘導的5株耐藥菌株，耐藥比率判斷公式為：

耐藥比率=(耐該種抗生素的耐藥菌株總數(shù)-5/該種抗生素測試的耐藥菌株總數(shù)-5)×100%。

未誘導菌株產(chǎn)生耐藥性的抗生素，耐藥比率判斷公式為：

耐藥比率=(耐該種抗生素的耐藥菌株總數(shù)/該種抗生素測試的耐藥菌株總數(shù))×100%。

1.6 耐藥菌株保存條件

將終耐藥菌株分別均勻涂布于平板上，分別于4 ℃下保存5 、10 、15 、20 、25、30 d，挑取單菌落，擴大培養(yǎng)后按照本文1.3的方法，進行MIC測定，探討其耐藥穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 原代菌株AH10體外測試結(jié)果

經(jīng)測試諾氟沙星、恩諾沙星、氧氟沙星、沙拉沙星、四環(huán)素、強力霉素、硫酸新霉素、氟苯尼考、甲風霉素、硫酸慶大霉素、磺胺嘧啶對AH10的MIC分別為：0.25、0.25、0.25、0.25、1.0、0.25、8.0、0.5、1.0、0.5、8.0 μg/mL，諾氟沙星、磺胺嘧啶、氟苯尼考、四環(huán)素、硫酸新霉素對AH10的MPC分別為：2.0、128、3.0、4.0、88 μg/mL。根據(jù)原始嗜水氣單胞菌AH10的體外藥效參數(shù)，確定耐藥菌株篩選時MH培養(yǎng)基中抗生素添加量。

2.2 供試菌株隨傳代次數(shù)對五種篩選抗生素的平均耐藥性及獲得速率

供試菌株在供試藥物連續(xù)傳代培養(yǎng)100次中，在各種抗生素篩選壓力下，耐藥菌株隨傳代次數(shù)增加其耐藥性逐步增加，但在抗生素壓力下，傳代在10～25次之間，耐藥菌株耐藥性并無明顯增加，甚至略有下降，且耐藥性極不穩(wěn)定。傳代至35次穩(wěn)定耐藥后，其耐藥性逐步增加，但傳代至55～65次時，耐藥性增長速率減慢，耐藥性基本保持不變，隨后耐藥性大幅度增加(圖1)。耐藥性增加速率呈現(xiàn)不規(guī)則變化，在傳代至10～25次之間，出現(xiàn)了負增長，在傳代至65～95次之間MIC增長倍數(shù)一直處于12倍左右，與耐藥性增長趨勢相吻合(圖1)。

2.3 耐藥菌株交叉耐藥

A1、A2、A3、A4、A5耐藥性提高均在100 μg/mL(100倍MIC)以上(表1)，對同為四環(huán)素類的強力霉素耐藥性提高較大，耐藥性提高最小的達到15.75 μg/mL(100倍MIC)；對磺胺嘧啶、氟苯尼考耐藥性提高非常大，其中對氟苯尼考的耐藥性提高達到60 μg/mL以上，對磺胺嘧啶的耐藥性更是達到了100 μg/mL以上；對硫酸新霉素耐藥性未提高。B1、B2、B3、B4、B5耐藥性提高在50 μg/mL(200倍MIC，表2)以上，沙拉沙星與氧氟沙星同為喹諾酮類，但對氧氟沙星耐藥性提高達到3.75 μg/mL(15倍MIC)，對沙拉沙星耐藥性未明顯提高；對酰胺類和四環(huán)素類耐藥性提高較大，對氟苯尼考耐藥性提高更是達到50 μg/mL(100倍MIC)以上；對磺胺類耐藥性同樣提高幅度較大，提高都在20 μg/mL(表2)以上。C1、C2、C3、C4、C5耐藥性均由最初的0.5 μg/mL提高到128 μg/mL以上[大于200倍MIC(表3)]，對同為酰胺類的甲風霉素的耐藥性提高在50 μg/mL(50倍MIC)以上，對四環(huán)素類提高同樣較為明顯，對喹諾酮類和氨基糖苷類耐藥性提高較小。D1、D2、D3、D4、D5對磺胺嘧啶耐藥性提高均在100 μg/mL以上。D1、D2、D3、D4、D5對四環(huán)素類和酰胺類抗生素耐藥性提高較明顯，未發(fā)現(xiàn)對氨基糖苷類產(chǎn)生明顯耐藥，對硫酸新霉素的耐藥性出現(xiàn)下降(表4)。對比表1、表3、表4我們發(fā)現(xiàn)耐藥株對磺胺類、酰胺類和四環(huán)素類抗生素耐藥相關(guān)性較為一致(即對這三類中的一類抗生素產(chǎn)生耐藥對另外兩類抗生素耐藥性同樣較為明顯)。E1、E2、E3、E4、E5耐藥性提高在120 μg/mL[15倍MIC(表5)]，對氟苯尼考表現(xiàn)出耐藥性，對其他各大類抗生素耐藥性與AH10對比無明顯變化。

圖1 耐藥菌株隨傳代次數(shù)的平均耐藥性和平均增加速率

表1 耐四環(huán)素菌株對常見抗生素的交叉耐藥

2.4 耐藥菌株交叉耐藥比率

由圖2可以看出，菌株耐藥后交叉耐藥現(xiàn)象明顯，耐喹諾酮類菌株對另外四大類抗生素耐藥性提高最明顯，平均交叉耐藥比率為74.0%。耐四環(huán)素類菌株交叉耐藥性同樣較為明顯，平均交叉耐藥性為66.68%，而氨基糖苷類耐藥菌株則相對交叉耐藥率較低，平均耐藥率不足20%。耐酰胺類菌株平均交叉耐藥性為56.0%，且耐藥后各耐藥株對另外四類抗生素交叉耐藥各異。耐磺胺類菌株交叉耐藥性則相對接近,平均耐藥性為48%。

表2 耐諾氟沙星菌株對常見抗生素的交叉耐藥

表3 耐氟苯尼考菌株對常見抗生素的交叉耐藥

表4 耐磺胺嘧啶菌株對常見抗生素的交叉耐藥

圖2 篩選藥物外耐藥菌株耐藥比率

2.5 耐藥菌株對各種抗生素的耐藥比率

耐藥菌株耐藥比率很高，但差異較大(圖3)，對氟苯尼考耐藥率最高，達到了85%。然而對硫酸新霉素未表現(xiàn)出交叉耐藥性。對磺胺嘧啶、四環(huán)素、甲砜霉素的耐藥率均達到了75%。

圖3 篩選藥物外耐藥菌對抗生素耐藥比率

2.6 耐藥菌株4℃條件下保存耐藥穩(wěn)定性

由表6可以看出，耐藥菌株在4 ℃劃線平板保存條件下，耐藥性出現(xiàn)波動，耐藥保存一個月后，C1、C2、E2下降為原來的1/2。

表6 耐藥菌4 ℃保存下 MIC

續(xù)表6

3 討論

細菌在對抗一種抗生素時，往往同時有兩種或兩種以上的耐藥方式[12]，這與本研究中同一種抗生素誘導產(chǎn)生的耐藥菌株，其交叉耐藥性有很大差異相吻合。從耐四環(huán)素類菌株與耐酰胺類菌株呈現(xiàn)出高度的相關(guān)性我們可以看出：這兩類抗生素產(chǎn)生的耐藥株可能存在著相似的耐藥途徑。氨基糖苷類耐藥菌株耐藥后，交叉耐藥現(xiàn)象并不顯著，甚至有些耐藥菌株的MIC相比AH10略有下降，說明這類耐藥菌可能有其特有的耐藥方式。 嗜水氣單胞菌在長期低劑量抗生素環(huán)境下，耐藥性隨著傳代次數(shù)不斷增加，但在平板保存條件下，耐藥性隨保存時間的延長卻不斷改變，呈現(xiàn)出下降的趨勢，這表明：耐藥性變化與其所處的環(huán)境有直接的聯(lián)系。

嗜水氣單胞菌耐藥機制多樣[13]，尤其是抗生素被廣泛應用以來，細菌耐藥性迅速增加，耐藥機制也變得越來越復雜。張丹鳳等[14]發(fā)現(xiàn)獲得性藥物外排基因Armb對氨基糖苷類耐藥起到重要作用，與本研究中氨基糖苷類特有的耐藥方式相吻合；周萬蓉[15]和方一鳳等[16]發(fā)現(xiàn)磺胺類和喹諾酮類耐藥均可能為質(zhì)粒介導，可被多種抗生素所誘導，這也與本研究中這兩類抗生素誘導的耐藥株交叉耐藥現(xiàn)象嚴重相一致。莫嵐等[17]對酰胺類抗性基因PBPs系統(tǒng)做了較為深入的研究，PBPs系統(tǒng)廣泛存在于細胞膜表面，通過細胞膜表面蛋白的改變來阻止藥物的侵害，該系統(tǒng)介導耐藥性可廣泛擴散。本研究中喹諾酮類、四環(huán)素類和磺胺類耐藥株均對酰胺類產(chǎn)生了耐藥，說明這三類抗生素誘導的耐藥株耐藥性變化與細胞膜PBPs系統(tǒng)不無關(guān)系。蔣紅霞等[18]報道：耐藥機制與酶的改變、染色體、質(zhì)粒、膜蛋白以及通透屏障等眾多因素有關(guān)，既有遺傳穩(wěn)定性耐藥機制，又有非遺傳穩(wěn)定性耐藥機制，研究4 ℃保存條件下耐藥性的變化可能由非遺傳穩(wěn)定性耐藥機制引起。

為減少耐藥性產(chǎn)生，在防治嗜水氣單胞菌引起的疾病過程中，應首先對其進行最小抑菌濃度(MIC)測定，在MIC大小相似的情況下，應注意輪換使用不同大類的抗生素。本研究發(fā)現(xiàn)，嗜水氣單胞菌耐藥性與抗生素的接觸次數(shù)有關(guān)，接觸次數(shù)越多，則耐藥性增加越明顯?；前奉?、喹諾酮類以及氨基糖苷類易產(chǎn)生交叉耐藥性，且磺胺類和氨基糖苷類抗生素防治效果不佳，此三類抗生素應酌情選用。四環(huán)素類和酰胺類抗生素耐藥交叉率較低，且這兩類抗生素不易產(chǎn)生耐藥性，應作為首選。因此，在養(yǎng)殖中應充分了解各種抗生素對病原菌的抑制效果，做到定期檢測[19]，采樣研究，充分掌握第一手資料。建立用藥標準制度，嚴格按照用藥標準用藥，尤其應該建立完整的交叉耐藥標準制度，建立起無公害的防治體系，保證我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展。

[1]李愛華，蔡桃珍，吳玉深，等.我國魚類病原——嗜水氣單胞的耐藥性研究[J].微生物學通報,2001,28(1):58-63.

[2]李煥榮，田麗英，崔德鳳，等.致病性嗜水氣單胞菌對31種抗菌藥物的敏感試驗[J].北京農(nóng)學院學報,2001,16(3):34-37.

[3]Kaskhedikar M,Chhabra D.Multiple drug resistance ofAeromonashydrophilaisolates from Chicken samples collected from Mhow and Indore city of Madhyapradesh[J].Veterinary World,2009,2(1):31-32.

[4]朱芝秀，何后軍，鄧舜洲，等.嗜水氣單胞菌江西地區(qū)分離株耐藥性及耐藥質(zhì)粒分析[J].江西農(nóng)業(yè)大學學報,2012，34( 6) :1262-1268.

[5]林居純，羅忠俊，舒 剛，等.嗜水氣單胞菌臨床分離菌對抗菌藥物的耐藥性調(diào)查[J].安徽農(nóng)業(yè)科學,2009,37(15):7024 -7025.

[6]陳儉清，盧彤巖，劉紅柏，等.恩諾沙星對嗜水氣單胞菌的體外藥效學研究[J].水產(chǎn)學雜志,2010，23(1):47-50.

[7]戴自英，臨床抗菌藥物學[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1985：6-8.

[8]荊靚艷.6種氟喹諾酮類藥物對葡萄球菌防耐藥變異濃度的研究[D].遼寧大連：大連醫(yī)科大學，2008.

[9]徐麗娟.恩諾沙星控制淡水魚類嗜水氣單胞菌性敗血癥的防耐藥用藥方案研究[D].上海：上海海洋大學,2014.

[10]王美珍，陳昌福，劉振興，等.嗜水氣單胞菌對四環(huán)素類和氟喹諾酮類藥物的耐藥性研究[J].華中農(nóng)業(yè)大學學報,2011,30(1):89-93.

[11]張健騑，李躍龍，陳鮮花，等.禽致病性大腸桿菌對氟喹諾酮類藥物交叉耐藥性研究[J].廣東農(nóng)業(yè)科學,2005,(2):74-76.

[12]夏永祥.臨床抗生素的應用和細菌耐藥性分析[J].實用全科醫(yī)學,2003,1(4):331-333.

[13]夏 飛，梁利國，謝 駿，.嗜水氣單胞菌耐藥性研究進展[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學,2012,40(10):16-18.

[14]張丹鳳，陳國平，張國廣，等.AmrB對嗜水氣單胞菌氨基糖苷類抗生素耐藥性的影響[J].中國農(nóng)業(yè)科技導報,2013,15(3):123-128.

[15]周萬蓉.細菌對磺胺類藥物耐藥基因三重PCR檢測試劑盒研制與應用[D].四川雅安：四川農(nóng)業(yè)大學,2007.

[16]方一風，潘曉藝，藺凌云，等.嗜水氣單胞菌對喹諾酮類藥物耐藥的分子機制[J].微生物學報,2014,54(2):174-182.

[17]莫 嵐.青霉素結(jié)合蛋白與細菌對β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥機制的研究進展[J].國外醫(yī)藥(抗生素分冊),1996,17(3):187-191+223.

[18]蔣紅霞,曾振靈.細菌耐藥機制及耐藥性控制對策[J].動物醫(yī)學進展,2001,22(4) :4-7.

[19]孟小亮，陳昌福，吳志新，等.嗜水氣單胞菌對鹽酸多西環(huán)素的耐藥性獲得與消失速率研究[J].長江大學學報(自然科學版農(nóng)學卷),2009,6(1):42-44,58,112.

(責任編輯：鄧 薇)

Directional induction of antibiotics-resistant Aeromonas hydrophila and analysis of its multiple drug resistance

ZHANG Guo-liang1,LV Li-qun1,2

(1.NationalPathogenCollectionCenterforAquaticAnimals/KeyLaboratoryofFreshwaterandGermplasmResourcesUtilizationCollegeofFisheriesandLifeScience/ShanghaiOceanUniversity,Shanghai201306,China;2,AquacultureCollaborativeInnovationCenterofHubeiProvince，Wuhan430070,China)

In order to compare the effects of available antibiotics on inducing drug-resistantA.hydrophilaand lay a foundation for rational use of different antibiotics,five typical antibiotics drugs representing the five major categories of antibiotics were selected to induce drug-resistantA.hydrophilastrain AH10 on agar plate supplied with a concentration of mutant prevention concentration (MPC) for each specific antibiotics.Through determining the minimum inhibitory concentration (MIC) of different antibiotics on all the identified drug-resistant mutant bacterial,the cross drug-resistance map was drawn in this report.The results showed that the MIC of Tetracycline,Florfenicol,Sulfadiazine,Neomycin sulfate and Norfloxacin to AH10 was 1.0,0.5,8.0,8.0,and 0.25 μg/mL,respectively;the corresponding MPC value was 4.0,3.0,128,88 and 2.0 μg/mL,respectively.Generally,induced drug-resistant bacteria demonstrated an over 100 times-higher MIC value in comparison to the wild type ofA.hydrophilastrain AH10.Individual strain resistance decreased after storage at 4 ℃ in one month.Under the pressure of drug screening,the resistance of the strains increased with the increase of passages.Resistant mutants induced from antibiotics belonging to the same class drug-resistant correlation is higher;while,resistant mutants induced from antibiotics belonging to different classes demonstrated different resistant map.

Aeromonashydrophila.;drug-resistance;antibiotics;cross resistance

2016-01-17；

2016-06-24

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資金項目(CARS-46-12)

張國亮(1990-),男,碩士研究生,專業(yè)方向為水產(chǎn)病原學。E-mail:314865661@qq.com

呂利群。 E-mail:lqlv@shou.edu.cn

S941.42

A

1000-6907-(2016)06-0056-08