李創(chuàng)舉，楊曉鴿，岳華梅，葉 歡，危起偉

(1.農(nóng)業(yè)部淡水生物多樣性保護(hù)重點實驗室，中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所，武漢 430223；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心，江蘇無錫 214081)

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中華鱘piwil1基因的克隆表達(dá)特征研究

李創(chuàng)舉1,2，楊曉鴿1，岳華梅1,2，葉 歡1，危起偉1,2

(1.農(nóng)業(yè)部淡水生物多樣性保護(hù)重點實驗室，中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所，武漢 430223；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心，江蘇無錫 214081)

Piwi是魚類配子發(fā)生和性腺發(fā)育的重要調(diào)控因子。本研究從中華鱘(Acipensersinensis)性腺中克隆得到了piwi基因的全長cDNA序列，該序列長3 393 bp，開放閱讀框為2 583 bp，編碼860個氨基酸。氨基酸序列多重對比發(fā)現(xiàn)，該序列具有PAZ和PIWI保守結(jié)構(gòu)域，與其他魚類piwil具有較高同源性；系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，中華鱘piwil聚于piwil1分支；因此，所得序列為piwi-like1基因，命名為Aspiwil1。熒光定量PCR研究表明，Aspiwil1為母源表達(dá)，且其表達(dá)量隨著胚胎發(fā)育逐漸降低；Aspiwil1在性腺中大量表達(dá)，在腦組織中也有較低水平的表達(dá)。性腺組織切片RNA原位雜交結(jié)果表明，Aspiwil1僅在生殖細(xì)胞表達(dá)，且其雜交信號隨著卵子發(fā)生逐漸增強(qiáng)、精子發(fā)生逐漸減弱。本研究為中華鱘配子發(fā)生過程中Aspiwil1的功能研究提供了基礎(chǔ)。

中華鱘(Acipensersinensis)；piwi；克?。槐磉_(dá)；原位雜交

Piwi屬于Argonaute蛋白家族成員，具有保守的PIWI和PAZ結(jié)構(gòu)域，該蛋白通過與一類長為26-31個核苷酸的piwi-interacting RNAs (piRNA)結(jié)合，形成piwi-piRNA復(fù)合體，在配子發(fā)生、轉(zhuǎn)座子沉默、DNA甲基化及基因組完整性方面起重要作用[1-2]。Piwi基因首先在果蠅中被鑒定分離出來，其在維持果蠅生殖干細(xì)胞的自我更新及分裂調(diào)控方面扮演著不可或缺的角色[3-5]。目前，在斑馬魚、青鳉和奧利亞羅非魚等多種魚類中鑒定了piwi基因[6]。斑馬魚piwi有ziwi和zili兩個成員，且二者在雌、雄性腺中均有表達(dá)[7-8]。Ziwi基因突變導(dǎo)致斑馬魚生殖細(xì)胞凋亡；zili在斑馬魚生殖細(xì)胞分化和減數(shù)分裂中起重要作用[1,8]。青鳉opiwi除了在性腺組織中表達(dá)外，在眼和腦中也有表達(dá)，且opiwi可能參與原始生殖細(xì)胞的數(shù)量決定并控制其遷移[9]。上述研究表明，不同物種中piwi的表達(dá)模式存在一定的差異，但其在生殖細(xì)胞發(fā)育及配子發(fā)生中的功能相對保守。

中華鱘(Acipensersinensis)為大型江海洄游魚類，由于水利水電工程建設(shè)、航運(yùn)、污染和過度捕撈等人類活動的影響，其生存環(huán)境惡化，數(shù)量急劇減少，物種處于極度瀕危狀態(tài)，為國家一級保護(hù)動物。盡管中華鱘全人工繁殖技術(shù)已獲突破，但未能規(guī)?；?，其配子發(fā)生的調(diào)控機(jī)制還不清楚。近年來，pou2[10]、nanos1[11]、dazl/boule[12]和dnd[13]等多個生殖細(xì)胞發(fā)育調(diào)控基因的鑒定為解析中華鱘配子發(fā)生規(guī)律積累了一定數(shù)據(jù)。本研究旨在克隆得到中華鱘配子發(fā)生過程中起重要作用的piwil1基因，分析其序列特征和系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，研究其胚胎和組織表達(dá)特征，為研究中華鱘配子發(fā)生過程中該基因的功能提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本實驗所用子二代中華鱘(3齡，雌、雄各1尾)取自中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所太湖試驗場(湖北荊州)。分別取肝、脾、心、精巢、卵巢、腎、肌肉、腸、垂體、下丘腦、端腦、中腦、小腦和延腦等組織，在液氮中速凍后，然后存放于-80 ℃冰箱備用。用于原位雜交的性腺組織保存于4% 的多聚甲醛溶液中。實驗所用的中華鱘胚胎采自2012年全人工繁殖所得胚胎。

1.2 總RNA提取、單鏈cDNA及SMART cDNA合成

組織總RNA用RNeasy?Plus Mini Kit試劑盒(QIAGEN，德國)提??；按 Super SMART PCR cDNA Synthesis Kit 操作手冊的方法合成中華鱘精巢的SMART cDNA；參照PrimeScript? RT reagent Kit With gDNA Eraser (TaKaRa，日本)試劑盒合成cDNA用于qRT-PCR。

1.3 中華鱘Aspiwil1基因全長cDNA克隆及序列分析

在NCBI數(shù)據(jù)庫中搜索已知物種piwil1基因序列，通過ClustalX2分析對比保守區(qū)，然后運(yùn)用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計簡并引物，由生工生物工程(上海)有限公司合成(表1)。經(jīng)PCR擴(kuò)增反應(yīng)，克隆獲得部分中華鱘piwil1 cDNA序列，根據(jù)該序列設(shè)計特異引物擴(kuò)增piwil1 cDNA的5′端和3′端，擴(kuò)增產(chǎn)物純化后連入pMD-19T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞(DH5α)，挑取陽性克隆測序。利用DNAStar軟件中SeqMan對獲得的片段進(jìn)行拼接，NCBI Blast (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)對所得序列進(jìn)行比對。氨基酸序列同源性的比較采用Clustal W軟件，利用 MEGA 6.0軟件以鄰接法(Neighbor-Joining,NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，自展法(Bootstrap)檢驗系統(tǒng)分支的置信度(重復(fù)次數(shù)為1 000)。

1.4 實時熒光定量PCR

根據(jù)所得到中華鱘piwil1 cDNA序列，設(shè)計定量引物 RT-piwil1 F和RT-piwil1 R (表1)，以中華鱘不同組織(心、肝、脾、腎、精巢、卵巢、肌肉、腸、垂體、下丘腦、端腦、中腦、小腦和延腦)，以及不同胚胎發(fā)育時序(未受精、多細(xì)胞、囊胚、原腸胚、神經(jīng)胚、心臟原基、心跳、出膜)cDNA 為模板進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng),按SYBR?Premix Ex TaqTM (Perfect Real Time)試劑盒要求操作，每個樣品重復(fù) 3 次，以中華鱘內(nèi)參基因β-actin作對照。擴(kuò)增反應(yīng)在 Bio-Rad CFX96TM Real Time System 儀上進(jìn)行,反應(yīng)程序為 95 ℃預(yù)變性 10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s，共40個循環(huán)。中華鱘Aspiwil1相對表達(dá)量采用2-△△Ct的方法計算，實驗數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)形式呈現(xiàn)。

1.5 探針合成及原位雜交

根據(jù)中華鱘Aspiwil1基因cDNA序列設(shè)計一對引物(表1)，擴(kuò)增產(chǎn)物包括Aspiwil1基因的3′ UTR序列。經(jīng)過PCR擴(kuò)增之后，割膠回收，將目的條帶連接至pGEM-T Easy載體中并測序。按照Plasmid Mini Kit II試劑盒操作說明提取質(zhì)粒，線性化后作為合成探針的模板。用T7 RNA合成酶，地高辛標(biāo)記(DIG)合成探針。性腺組織經(jīng)4%的多聚甲醛固定過夜后，換30%的蔗糖溶液通透過夜，在-20 ℃下連續(xù)切片。按照原位雜交的實驗步驟，切片加相應(yīng)的探針60 ℃雜交至少16 h后，加anti-DIG抗體4 ℃孵育過夜，最后用NBT/BCIP顯色，并在顯微鏡下觀察拍照。

表1 本研究所用引物

2 結(jié)果

2.1 中華鱘piwi基因全長cDNA序列克隆

根據(jù)piwi基因的保守序列設(shè)計簡并引物，以中華鱘的精巢SMART cDNA庫為模板，通過PCR擴(kuò)增得到了一個約700 bp的片段，經(jīng)測序、BLAST同源比對，確定其為piwi-like1基因。隨后，通過末端快速擴(kuò)增的方法獲得了中華鱘piwi-like1 (命名為Aspiwil1)基因的全長cDNA序列。Aspiwil1cDNA全長3 393 bp，包括103 bp 的5′ 非翻譯區(qū)(Untranslated region,UTR)、2 583 bp開放閱讀框(open reading frame，ORF)和687 bp 3′ UTR，編碼860個氨基酸(圖1)。該序列已提交至GenBank (登錄號：KX355457)。

2.2 AsPiwil1氨基酸序列同源性比對及系統(tǒng)發(fā)生分析

從NCBI上搜索了其它物種的Piwi氨基酸序列，并用cluster W和boxshade軟件進(jìn)行了Piwi氨基酸的多重對比分析(圖1)。結(jié)果表明，與其它物種Piwi亞家族的成員一樣，中華鱘Piwi蛋白具有高度保守的PAZ (圖2綠色方框區(qū)域)和PIWI (圖1紅色方框區(qū)域)結(jié)構(gòu)域。中華鱘AsPiwil1與斑馬魚、鯉和青鳉的序列一致性分別為77.38%、77.16%和70.29%；與小鼠(66.16%)和人(65.58%)、雞(63.49%)及爪蟾(62.21%)序列一致性也較高；但與無脊椎動物的序列一致性最低，低至31.16%。

通過NCBI查找其它物種Piwi的氨基酸序列，接著運(yùn)用Mega 6.0構(gòu)建piwi基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹。如圖2所示，中華鱘piwil1與斑馬魚、青鳉等硬骨魚類piwil1聚為一個分支，該分支再與爪蟾、雞、人等高等動物piwil1聚為一支；人Hiwi3(Piwil3)、Hiwi2(Piwil4)及小鼠Miwi2(Piwil4)也均聚于該piwil1分支；脊椎動物piwil2聚于另一分支。

2.3 中華鱘Aspiwil1基因胚胎發(fā)育時序表達(dá)特征

取中華鱘未受精卵及多細(xì)胞、囊胚、原腸胚、神經(jīng)胚、心臟原基、心跳和出膜期胚胎提取總RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用熒光定量PCR法檢測了各個胚胎發(fā)育時期Aspiwil1的表達(dá)情況。如圖3所示，Aspiwil1基因是母源表達(dá)的，在未受精卵中檢測到的轉(zhuǎn)錄本最多；受精后，隨著胚胎的發(fā)育，Aspiwil1的轉(zhuǎn)錄本呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢。在多細(xì)胞期至原腸胚期間仍可以檢測到較多Aspiwil1的轉(zhuǎn)錄本存在，大約為未受精卵中的50%；在神經(jīng)胚期Aspiwil1的轉(zhuǎn)錄本急劇下降，在心臟原基期及后續(xù)的心跳和出膜期只能檢測到微弱Aspiwil1的轉(zhuǎn)錄本存在。

2.4 中華鱘Aspiwil1基因的組織表達(dá)模式

采用熒光定量PCR法檢測了中華鱘心、肝、脾、腎、精巢、卵巢、肌肉、腸、端腦、中腦、小腦、延腦等組織中Aspiwil1基因的表達(dá)情況。如圖4所示，Aspiwil1基因在精巢和卵巢中大量表達(dá)，在垂體、下丘腦、端腦、中腦和小腦等腦組織中有較低水平表達(dá)。

圖1 中華鱘和其它物種Piwil1氨基酸序列的多重對比圖

圖2 中華鱘及其它物種Piwi氨基酸序列構(gòu)建的NJ樹

圖3 中華鱘Aspiwil1基因在胚胎時序中的表達(dá)特征

圖4 中華鱘Aspiwil1基因在不同組織中的表達(dá)特征

2.5 中華鱘Aspiwil1基因在性腺組織中的定位

原位雜交的結(jié)果顯示，Aspiwil1 mRNA僅在中華鱘性腺組織中的生殖細(xì)胞內(nèi)有表達(dá)。用來進(jìn)行RNA原位雜交的卵巢組織處于II期，精巢組織處于III期；II期卵巢有大量的初級卵母細(xì)胞和少量的卵原細(xì)胞，III期精巢包含精子發(fā)生時期的各種類型細(xì)胞。結(jié)果表明，卵巢中Aspiwil1 mRNA在卵原細(xì)胞中的信號較弱，在初級卵母細(xì)胞中的信號較強(qiáng)，并隨初級卵母細(xì)胞的發(fā)育信號逐漸加強(qiáng)(圖5A)；精巢中，雜交信號在精原細(xì)胞較強(qiáng)，在隨后的精子發(fā)生過程中雜交信號有逐漸減弱的趨勢(圖5C)。Aspiwil1正義探針均未檢測到雜交信號(圖B、D)。

圖5 原位雜交檢測Aspiwil1 mRNA在中華鱘卵巢(A)和精巢(C)組織切片中的表達(dá)

A、C為Aspiwil1反義探針檢測到的雜交信號，B和D為Aspiwil1正義探針未檢測到信號。og為卵原細(xì)胞，羅馬數(shù)字表示卵細(xì)胞發(fā)育的不同時期；sg為精原細(xì)胞，psp為初級精母細(xì)胞，ssp為次級精母細(xì)胞，標(biāo)尺50 μm。

3 討論

本研究通過基因同源克隆和末端快速擴(kuò)增的方法獲得了Aspiwil1的全長cDNA序列，其編碼的蛋白質(zhì)具有Piwi亞家族所特有的PAZ和PIWI結(jié)構(gòu)域；Aspiwil1與硬骨魚類等其它物種piwil1具有較高的氨基酸一致性。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，Aspiwil1與其它物種piwil1、人Hiwi3 (Piwil3)、Hiwi2 (Piwil4)及小鼠Miwi2 (Piwil4)聚于piwil1分支。與哺乳動物中存在3至4個piwi同源基因不同的是，斑馬魚、鯉、牙鲆、奧利亞羅非魚等硬骨魚類均只鑒定了2個piwi基因[6]。Piwi在哺乳類等高等脊椎動物中進(jìn)化為更多分支可能與其復(fù)雜的生物學(xué)功能相對應(yīng)。

在斑馬魚中，ziwi是母源表達(dá)基因[7]；在青鳉中采用RT-PCR研究發(fā)現(xiàn)opiwi是母源性的，并在整個胚胎發(fā)育時期都有表達(dá)[14]；olpiwi2在青鳉的胚胎中也有類似的表達(dá)模式[15]，而在斑馬魚早期發(fā)育中沒有檢測到母源性的zili[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，Aspiwil1為母源表達(dá)，這與piwi1在其它硬骨魚類胚胎中的表達(dá)模式是一致的。Aspiwil1除在精巢和卵巢中有表達(dá)外，在腦組織中也有少量的表達(dá)。在青鳉和斑馬魚等模式魚類中也發(fā)現(xiàn)了類似的表達(dá)模式，青鳉的piwil1不僅在性腺組織中大量表達(dá)，在眼和腦組織中也有表達(dá)，這表明piwil1除了在生殖細(xì)胞的發(fā)生發(fā)育中起重要做用外，還參與神經(jīng)組織等體細(xì)胞的發(fā)育。此外，在禽類中，piwil1除在性腺中有表達(dá)外，在腎臟組織中也有表達(dá)[16-17]；在小鼠等哺乳動物中，piwi僅在精巢中有表達(dá)[18]。這些有關(guān)piwi基因表達(dá)特征的研究結(jié)果說明，在進(jìn)化過程中，piwi的功能在保守中變得更為專一。在青鳉中，原位雜交揭示了piwi基因在精原細(xì)胞和精母細(xì)胞中大量表達(dá)，在更加成熟的精子發(fā)生階段則檢測不到piwi基因的信號[9]。與青鳉相似，Aspiwil1僅在達(dá)氏鱘兩性性腺組織切片中的生殖細(xì)胞中有表達(dá)，在體細(xì)胞中沒有表達(dá)；且在卵巢中，其雜交信號隨卵細(xì)胞的發(fā)育有增強(qiáng)的趨勢；而在精巢中，雜交信號在精子發(fā)生的后期有所減弱。上述研究結(jié)果為后續(xù)中華鱘piwil1基因的功能研究提供了基礎(chǔ)。

[1]Houwing S,Kamminga L M,Berezikov E,et al.A role for Piwi and piRNAs in germ cell maintenance and transposon silencing in zebrafish [J].Cell,2007,129(1):69-82.

[2]Bak C W,Yoon T K,Choi Y.Functions of PIWI proteins in spermatogenesis [J].Clin Exp Reprod Med,2011,38(2):61-67.

[3]Lin H,Spradling A C.A novel group of pumilio mutations affects the asymmetric division of germline stem cells in theDrosophilaovary [J].Development,1997,124(12):2463-2476.

[4]Cox D N,Chao A,Baker J,et al.A novel class of evolutionarily conserved genes defined by piwi are essential for stem cell self-renewal [J].Genes Dev,1998,12(23):3715-3727.

[5]Cox D,Chao A H.Piwi encodes a nucleoplasmic factor whose activity modulates the number and division rate of germline stem cells [J].Development,2000,127(3):503-514.

[6]肖 俊,周 毅,陳文治,等.奧利亞羅非魚Piwi基因的克隆與生物信息學(xué)分析[J].激光生物學(xué)報,2014,23(4):362-368.

[7]Tan C H,Lee T C,Weeraratne S D,et al.Ziwi,the zebrafish homologue of the Drosophila piwi:co-localization with vasa at the embryonic genital ridge and gonad-specific expression in the adults [J].Mech Dev,2002,119 Suppl 1(2):257-260.

[8]Houwing S,Berezikov E,Ketting R F.Zili is required for germ cell differentiation and meiosis in zebrafish[J].Embo Journal,2008,27 (20):2702-2711.

[9]Li M,Hong N,Gui J,et al.Medakapiwiis essential for primordial germ cell migration [J].Curr Mol Med,2012,12 (8):1040-1049.

[10]Ye H,Du H,Chen X H,et al.Identification of apou2 ortholog in Chinese sturgeon,Acipensersinensisand its expression patterns in tissues,immature individuals and during embryogenesis [J].Fish Physiol Biochem,2012,38 (4):929-942.

[11]Ye H,Chen X H,Wei Q W,et al.Molecular and expression characterization of ananos1 homologue in Chinese sturgeon,Acipensersinensis[J].Gene,2012,511 (2):285-292.

[12]Ye H,Li C J,Yue H M,et al.Differential expression of fertility genesbouleanddazlin Chinese Sturgeon (Acipensersinensis),a basal fish [J].Cell Tissue Res,2015,360 (2):413-425.

[13]Yang X G,Yue H M,Ye H,et al.Identification of a germ cell marker gene,the dead end homologue,in Chinese sturgeonAcipensersinensis[J].Gene,2015,558 (1):118-125.

[14]李名友.青鳉piwi和vasa基因的表達(dá)模式和功能分析[D].中國科學(xué)院水生生物研究所,2008.

[15]Zhao H,Duan J,Cheng N,et al.Specific expression of Olpiwi1 and Olpiwi2 in medaka (Oryziaslatipes) germ cells.Biochem Biophys Res Commun,2012,418:592-597.

[16]Chen R,Chang G,Zhang Y,et al.Cloning of the quail PIWI gene and characterization of PIWI binding to small RNAs [J].Plos One,2012,7 (12):e51724.

[17]陳 蓉.禽類Piwill基因與piRNAs生物學(xué)功能的初步研究[D].揚(yáng)州大學(xué),2013.

[18]Deng W,Lin H.miwi,a murine homolog ofpiwi,encodes a cytoplasmic protein essential for spermatogenesis [J].Dev Cell,2002,2 (6):819-830.

(責(zé)任編輯：張瀟峮)

Molecular cloning and expression analysis of piwil1 gene in Acipenser sinensis

LI Chuang-ju1,2,YANG Xiao-ge1,YUE Hua-mei1,2,YE Huan1,WEI Qi-wei1,2

(1.KeyLaboratoryofFreshwaterBiodiversityConservation,MinistryofAgricultureofChina/YangtzeRiverFisheriesResearchInstitute,ChineseAcademyofFisherySciences,Wuhan430223China;2.FreshwaterFisheriesResearchCenter,ChineseAcademyofFisheriesScience,Wuxi214081,Jiangsu,China)

Piwigenes play important roles in regulating the proliferation and division of germline stem cells.Apiwigene,piwi-like1 (Aspiwil1),was cloned through homologous cloning method from the gonad ofAcipensersinensis.The full length ofAspiwil1 was 3 393 bp with an opening reading frame (ORF) of 2 583 bp.Multiple amino acid sequences alignment showed sturgeonAspiwil1 contained the typical conserved PAZ and PIWI motif.Phylogenetic analysis revealed that sturgeonAspiwil1 was clustered into the Piwil1 clade.Aspiwil1 transcripts were found to originate from the maternal parent,of which expression level was gradually decreased with the embryo development by qRT-PCR analyses.In different tissues,Aspiwil1 was distributed in brain besides the gonads.Insituhybridization in gonadal tissues presented thatAspiwil1 transcripts were only detected in germ cells of both sexes.This work would be valuable for further investigation ofpiwigene function in the gonadal development of sturgeon.

Acipensersinensis;piwi;cloning;expression;insituhybridization

2016-06-15；

2016-08-22

中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項資金項目(2015JBFM41)；公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201203086)；國家自然科學(xué)基金項目(31472286)

李創(chuàng)舉(1980- )，男，博士，副研究員，研究方向為魚類分子遺傳。E-mail:lcj@yfi.ac.cn

危起偉。E-mail:weiqw@yfi.ac.cn

S917.0

A

1000-6907-(2016)06-0020-06