李創(chuàng)舉，宋明月,2，岳華梅，阮 瑞，葉 歡，楊曉鴿

(1.農(nóng)業(yè)部淡水生物多樣性保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所，武漢 430223；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306)

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興國紅鯉AR基因的鑒定及MT暴露對(duì)幼魚肝中AR和vtg表達(dá)的影響

李創(chuàng)舉1，宋明月1,2，岳華梅1，阮 瑞1，葉 歡1，楊曉鴿1

(1.農(nóng)業(yè)部淡水生物多樣性保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所，武漢 430223；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306)

實(shí)驗(yàn)克隆了興國紅鯉(Cyprinuscarpiovarsinguonensis)雄激素受體(androgen receptor,AR)基因的全長cDNA序列和卵黃蛋白原(vitellogenin,vtg)基因的部分cDNA序列，并對(duì)雌性個(gè)體組織及甲基睪丸酮(Methyltestosterone,MT)暴露下幼魚肝胰腺(以下簡稱：肝)中AR和vtg的表達(dá)進(jìn)行檢測。興國紅鯉AR基因cDNA全長3 229 bp，包括104 bp的5′非編碼區(qū)(untranslation region,UTR)、編碼846個(gè)氨基酸的2 541 bp開放閱讀框(open reading frame,ORF)和485 bp 3′UTR。氨基酸序列同源性分析表明，興國紅鯉AR與其他鯉科魚類AR的同源性較高。組織表達(dá)特征研究表明，AR在雌性個(gè)體的肝、卵巢、中腎、肌肉和端腦中有表達(dá)，其中肝中的表達(dá)量最高；vtg主要在肝、端腦和鰓中表達(dá)。興國紅鯉幼魚在50 μg/L的MT中暴露4周后，采用qRT-PCR檢測了肝中AR和vtg的表達(dá)情況。在處理第1、2周，AR的表達(dá)受到一定的抑制，而在第3、4周其表達(dá)量升高，但其表達(dá)無顯著性變化；而vtg的表達(dá)量在第3、4周均有極顯著的升高。

雄激素受體；興國紅鯉(Cyprinuscarpiovarsinguonensis)；MT；實(shí)時(shí)定量PCR；卵黃蛋白原

YangtzeRiverFisheriesResearchInstitute,ChineseAcademyofFisherySciences,Wuhan430223，China；2.CollegeofFisheriesandLife,ShanghaiOceanUniversity,Shanghai201306，China)

環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(endocrine disrupting chemicals，EDCs)因其在低劑量下能夠干擾野生動(dòng)物和人類的生理活動(dòng)而受到廣泛關(guān)注。EDCs分為環(huán)境雌激素和環(huán)境雄激素，后者又分為天然雄激素和合成雄激素。甲基睪丸酮(Methyltestosterone，MT)屬于天然雄激素，已有報(bào)道顯示在城市廢水和自然界沉積物中可檢測到MT[1-2]。MT在魚類性別分化和發(fā)育過程中起重要的作用[3]。

雄激素是一種類固醇激素，在芳香化酶的作用下轉(zhuǎn)化為雌激素，被認(rèn)為是雌激素的前體物質(zhì)[4]，雄激素的生理作用主要是通過雄激素受體(androgen receptor，AR)介導(dǎo)。AR屬于核受體超家族(nuclear receptor super family)中的類固醇受體，該受體家族成員還包括雌激素受體、孕酮受體[5-6]和鹽皮質(zhì)激素受體[7]。魚類AR基因首先是從日本鰻鱺(Auguillajaponica)中克隆得到的，隨后，在黑鯛(Pagrusmajor)[8]、細(xì)須石首魚(Micropogonundulatus)[9]和斑馬魚(Daniorerio)[10]等魚類中均克隆得到該基因。魚類卵黃蛋白原(vitellogenin，vtg)主要在肝中由雌激素誘導(dǎo)合成，是卵黃的前體。Matozzo等[11]認(rèn)為，Vtg可作為水環(huán)境中內(nèi)分泌干擾物污染的一種有用的生物標(biāo)志物。

興國紅鯉(Cyprinuscarpiovarsinguonensis)是一種溫度適應(yīng)范圍廣、易于飼養(yǎng)，產(chǎn)卵量大的魚類。本研究通過RT-PCR和RACE方法獲得興國紅鯉AR基因的全長cDNA序列和vtg基因的部分cDNA序列；采用定量PCR(Quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)方法研究了AR和vtg基因在興國紅鯉雌性成體的組織表達(dá)特征及MT暴露對(duì)興國紅鯉幼魚肝胰腺(以下簡稱：肝)中AR和vtgmRNA表達(dá)的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)魚和試劑

興國紅鯉成魚和幼魚均取自中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所窯灣試驗(yàn)場。取1齡的興國紅鯉成魚(♀)的肝、脾、鰓、性腺、中腎、肌肉、腸、端腦、中腦、小腦、延腦等組織。用于暴露的幼魚(♀)為150日齡。暴露之前將MT(H31020524)(1 mL∶25 mg)溶于二甲基亞砜(Dimethyl Sulfoxide,DMSO)(CAS.No.67-68-5)溶液，避光保存。

1.2 MT暴露實(shí)驗(yàn)

MT暴露實(shí)驗(yàn)處理組為50 μg/L(處理濃度參照Zheng等[12])，對(duì)照組僅加入DMSO(體積分?jǐn)?shù)<0.01%)。暴露時(shí)間為四周(28 d)。暴露前將實(shí)驗(yàn)魚在80 L的水箱中暫養(yǎng)10 d，每個(gè)處理組/對(duì)照組有3個(gè)水箱作為平行試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)水體體積為60 L，每天更換一半暴露溶液，全天用充氣泵增氧，并記錄暴露過程中魚的死亡率，黑暗周期為14 h∶10 h，水溫25 ℃。暴露7、14、21、28 d進(jìn)行采樣，每缸隨機(jī)取三尾雌幼魚對(duì)肝采樣，放入RNA Save 溶液中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 總RNA的提取、cDNA模板的合成

參照SV Total RNA Isolation System(Promega，美國)試劑盒說明書提取興國紅鯉各組織總RNA并檢測其濃度和完整性；用PrimeScriptRT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa，Japan)試劑盒合成第一鏈cDNA，獲得各組織的cDNA 模板存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 興國紅鯉AR和vtg基因cDNA的克隆及序列分析

采用RT-PCR和RACE方法，以肝cDNA為模板克隆AR和vtg的cDNA序列，所用的引物如表1，分別根據(jù)GenBank中魚類AR和vtg的cDNA序列來設(shè)計(jì)。根據(jù)獲得AR的cDNA序列設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增3′和5′端，擴(kuò)增產(chǎn)物均純化后連入PMD19-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞(DH5α)擴(kuò)培，通過M13引物進(jìn)行菌液PCR檢測陽性克隆，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。采用Clustal X[1.8]軟件將推導(dǎo)的AR氨基酸序列和NCBI公布的同源氨基酸序列比對(duì)。利用Mega6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(鄰接法，Neighbor-Joining，N-J)。

表1 本研究所用的引物序列

1.5 AR 和vtg mRNA的組織分布檢測

根據(jù)所得到的興國紅鯉AR和vtgcDNA序列設(shè)計(jì)定量PCR引物：qAR-F和qAR-R、qvtg-R和qvtg-F，以興國紅鯉雌性成體組織(肝、脾、鰓、中腎、端腦、中腦、小腦、延腦、卵巢、肌肉、腸)cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增，并以興國紅鯉β-actin(特異性引物β-actin F和β-actin R，表1)作為內(nèi)參基因。PCR在Bio-Rad CFX96TM Real Time System儀上進(jìn)行，反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃ 變性15 s，58 ℃ 退火15 s，72 ℃ 延伸15 s，循環(huán)數(shù)為40。

1.6 MT暴露后興國紅鯉幼魚肝中AR和vtg mRNA表達(dá)

參照SV Total RNA Isolation System(Promega，美國)試劑盒說明書提取實(shí)驗(yàn)幼魚肝總RNA。采用qRT-PCR方法檢測MT暴露下AR和vtg的表達(dá)變化，對(duì)照組處理組分別取3個(gè)樣品，每個(gè)樣品采用3個(gè)平行，PCR反應(yīng)液包括SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，引物(濃度為10 μM)各1 μL，cDNA模板1 μL和雙蒸水2 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃ 預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s，58 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s，循環(huán)數(shù)為40。數(shù)據(jù)結(jié)果采用ΔCt分析法，相對(duì)表達(dá)量=2-ΔΔCt。

2 結(jié)果

2.1 興國紅鯉AR基因全長cDNA序列克隆

興國紅鯉AR基因的全長cDNA序列為3 130 bp，包括104 bp的5′非編碼區(qū)(untranslation region,UTR)、編碼846個(gè)氨基酸的2 541 bp開放閱讀框(open reading frame，ORF)和485 bp 3′UTR。該序列已提交GenBank，登錄號(hào)為KX094549。

2.2 興國紅鯉AR氨基酸序列同源性比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)生分析

將興國紅鯉AR與彭澤鯽(Carassiusauratusvarpengze)等其他魚類AR進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)，結(jié)果表明，興國紅鯉AR與彭澤鯽、斑馬魚和黑頭軟口鰷(Pimephalespromelas)等鯉科魚類AR的相似性分別為87%、78%、77%。興國紅鯉 AR具有核激素受體所共有的 3 個(gè)主要功能區(qū)域,即保守性較低的氨基酸結(jié)構(gòu)域(NTD)、高保守的DNA 結(jié)合域(DBD)和 C 端配體結(jié)合域(LBD)(圖1)。以上結(jié)果證明本研究克隆所得序列確為興國紅鯉AR基因。

2.3 興國紅鯉AR和vtg的組織表達(dá)模式

采用熒光定量PCR法檢測了興國紅鯉雌魚肝、脾、鰓、中腎、端腦、中腦、小腦、延腦、肌、卵巢、腸等組織中AR和vtg基因的表達(dá)。AR基因在肝、中腎、卵巢、肌肉和端腦等多個(gè)組織有表達(dá)，肝中的表達(dá)量最高(圖3A)；vtg在檢測的組織中均有表達(dá)，肝、端腦和鰓中的表達(dá)量較高(圖3B)。

2.4 MT暴露對(duì)AR和vtg mRNA在興國紅鯉幼魚肝中的轉(zhuǎn)錄水平影響

經(jīng)過四周50 μg/L MT的暴露，興國紅鯉幼魚肝中AR和vtg的表達(dá)量均有變化。與對(duì)照相比，處理第1、2周幼魚肝中AR的表達(dá)受到一定的抑制，但在第3、4周AR的表達(dá)高于對(duì)照(圖4A)。在處理第1、2周幼魚肝中vtg的表達(dá)無明顯變化，但在第3、4周表達(dá)極其顯著的增長，第4周時(shí)實(shí)驗(yàn)組幼魚肝中vtg的表達(dá)量約為對(duì)照組的50倍(圖4B)。

3 討論

在部分硬骨魚類如虹鱒[7]、細(xì)須石首魚[9]、大西洋黃魚(Micropogoniasundulates)[13]、鰻[14]等硬骨魚類中克隆到兩種AR亞型：ARα和ARβ，這可能是由于魚類在進(jìn)化過程中經(jīng)歷了一次特有的基因組倍增過程，該基因發(fā)生了復(fù)制。但在本研究中，僅有一種興國紅鯉AR亞型被鑒定，這與斑馬魚[15]、半滑舌鰨[16]等魚類中的研究結(jié)果一致。而且，興國紅鯉性腺轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果表明，僅有一種AR中被發(fā)現(xiàn)(未發(fā)表資料)。因此，興國紅鯉中是否存在其他AR亞型還有待于進(jìn)一步研究。

在虹鱒和日本鰻鱺等魚類中AR具有兩種亞型，ARα和ARβ，但二者的表達(dá)模式存在差異。ARα在腦、精巢、卵巢、肝、中腎等多種組織中均有表達(dá)，性腺中表達(dá)水平較高；而ARβ僅在精巢、脾和肌肉等組織中特異表達(dá)[17-18]。本研究中，ARmRNA在各興國紅鯉組織中廣泛表達(dá)，在肝中的表達(dá)量最高，中腎和卵巢中的表達(dá)量也很高。這種組織表達(dá)模式與斑馬魚[15]和半滑舌鰨[16]中的研究相似。

圖1 興國紅鯉與其它4種魚類及人AR氨基酸序列比對(duì)

由于工業(yè)廢水、生活污水、農(nóng)牧業(yè)排污等人類活動(dòng)的影響，環(huán)境EDCs含量呈增長趨勢，對(duì)魚類機(jī)體有較大影響。彭澤鯽的研究中，50 μg/L MT暴露對(duì)AR的表達(dá)無顯著影響[12]。本研究中，50 μg/L MT處理前期(第1、2周)，興國紅鯉幼魚肝中ARmRNA表達(dá)量受到一定的抑制；但在后期小寫字母a、b和c分別表示不同處理濃度組的mRNA表達(dá)量的顯著性差異(P<0.05)。圖4同。

圖2 興國紅鯉及其它代表性脊椎動(dòng)物AR氨基酸序列構(gòu)建的進(jìn)化樹

圖3 熒光定量PCR檢測興國紅鯉成體組織中AR (A)和vtg(B) mRNA的轉(zhuǎn)錄水平

圖4 熒光定量PCR檢測MT暴露4周興國紅鯉幼魚肝中AR (A)和vtg (B) mRNA的轉(zhuǎn)錄水平

(第3、4周)，對(duì)AR的表達(dá)有一定的促進(jìn)作用，但作用不顯著。vtg基因的表達(dá)在MT暴露第1、2周無明顯變化，但在第3、4周時(shí)顯著升高，其表達(dá)量分別約為對(duì)照組的30、50倍，與黑頭軟口鰷[19]的研究結(jié)果一致。而在彭澤鯽的研究中，50 μg/L MT處理第1、3和4周，vtg的表達(dá)顯著升高[12]。因此，MT暴露可誘導(dǎo)魚類vtg的表達(dá)，這可能是由于MT被肝轉(zhuǎn)化為內(nèi)源性雌激素使vtg的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，或MT與ESRs結(jié)合之后使vtgmRNA表達(dá)量增加[19-20]。

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(責(zé)任編輯：張瀟峮)

Characterization of AR gene in Cyprinus carpio var singuonensis and AR and vtg expression in the liver of juveniles upon MT exposure

LI Chuang-ju1，SONG Ming-yue1,2,YUE Hua-mei1，RUAN Rui1,YE Huan1,YANG Xiao-ge1

(1.KeyLaboratoryofFreshwaterBiodiversityConservation,MinistryofAgricultureofChina/

In the study,the full-length cDNA sequence of androgen receptor (AR) and partial sequence of vitellogenin (vtg) were isolated and characterized from the liver ofCyprinuscarpiovarsinguonensis.TheC.carpiovarsinguonensisARcDNA was 3 229 bp in length,including 104 bp 5′-untranslated region (UTR),2 541 bp open reading frame (ORF) encoding 846 amino acid residues,and 485 bp 3′-UTR.Predicted amino acid sequence alignment showed thatC.carpiovarsinguonensisAR shared the highest identities with three cyprinidae species.The expression characterizations ofARandvtgin tissues of mature female fish were analyzed using qRT-PCR.ARwas mainly expressed in liver,ovary,kidney,muscle and cerebrum,with the highest expression level in liver.The mRNA expression ofvtgwas higher in liver,cerebrum and gill.And,the expression profiles ofARandvtgin the liver of juveniles,which was exposed to Methyltestosterone (MT,50 μg/L) for 4 weeks,were detected by qRT-PCR.TheARexpression was down-regulated in the first two weeks and was up-regulated in the 3rd and 4rd weeks,but there were no significant changes in the four weeks.However,the expression ofvtgwas dramatically increased in the 3rd and 4th week.

Androgen receptor;Cyprinuscarpiovarsinguonensis;Methyltestosterone;Quantitative real-time PCR;vitellogenin

2016-05-16；

2016-07-29

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2011AA100401)

李創(chuàng)舉(1980- )，男，博士，副研究員，研究方向?yàn)轸~類分子遺傳。E-mail：lcj@yfi.ac.cn

S917.0

A

1000-6907-(2016)06-0014-06