王貴英，張 涵，李 清，祝東梅， 陳 見， 李 佩 ，孫艷紅

(1．武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)研究院水產(chǎn)科學(xué)研究所，武漢 430207；2．武漢先鋒水產(chǎn)科技有限公司，武漢 430207；3．湖北省潛江市水產(chǎn)技術(shù)推廣中心，湖北潛江 433199)

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黑尾近紅鲌精子低溫保存方法研究與應(yīng)用

王貴英1,2，張 涵2,3，李 清1,2，祝東梅1,2， 陳 見1,2， 李 佩1,2，孫艷紅1,2

(1．武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)研究院水產(chǎn)科學(xué)研究所，武漢 430207；2．武漢先鋒水產(chǎn)科技有限公司，武漢 430207；3．湖北省潛江市水產(chǎn)技術(shù)推廣中心，湖北潛江 433199)

在4 ℃條件下，以精子活力為指標(biāo)，研究了不同濃度的Na+、K+、Ca2+、Mg2+、葡萄糖、氨基酸等組成的5種(A、B、C、D、E)精子保存液及其適量添加青霉素對黑尾近紅鲌(Ancherythroculternigrocauda)精子活力的影響。結(jié)果顯示：1)溫度為4 ℃時，精子活力達(dá)80%的保存液A、B、C、D、E的保存時間分別為48、24、60、48、48 h，保存液C的保存時間明顯高于其它各組；2)在各保存液中分別添加濃度為2.0×104IU/mL的青霉素，精子活力達(dá)80%的保存液A、B、C、D、E的保存時間分別為60、36、156、48、144 h，保存時間延長了12 ～96 h，保存液C和E的延長時間最長，均為96 h；3)人工授精試驗證明，經(jīng)保存的黑尾近紅鲌精子能正常用于人工繁殖，受精率達(dá)(90.6±0.8)%～(91.8±0.9)%，與對照組精子受精率(92.4±0.8)%無顯著差異。添加青霉素，保存液C的保存效果最好，其次是保存液E。

黑尾近紅鲌(Ancherythroculternigrocauda)；精子；保存液；青霉素；保存效果

CHEN Jian1,2,LI Pei1,2,SUN Yan-hong1,2

魚類精子保存技術(shù)包括常溫、低溫和超低溫保存技術(shù)。低溫(4 ℃)保存是精子短期保存的常見方法，操作簡便，能有效提高精液利用率，擴(kuò)大苗種生產(chǎn)，尤其在精液難以獲得或獲得量較少時，以及在雜交育種中具有較大意義[1-3]。精子保存液作為精子體外保存過程中賴以生存的外環(huán)境，其離子成分、滲透壓以及pH值等直接影響精子體外保存效果。魚類精子低溫保存在南方鲇(Silurusmeridionalis)、黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)、胭脂魚(Myxocyprinusasiaticus)等魚類中已有研究，并在實際生產(chǎn)中推廣應(yīng)用[4-6]。

黑尾近紅鲌(Ancherythroculternigrocauda)俗稱高肩、黑尾鲌等，隸屬鯉科鲌亞科近紅鲌屬，是長江上游特有經(jīng)濟(jì)魚類，也是我國漁業(yè)主導(dǎo)品種[7]，其肉質(zhì)細(xì)嫩，味道鮮美，深受消費(fèi)者喜愛[8]。隨著生存環(huán)境的變化，自然資源日趨減少，捕獲的個體逐漸小型化，急需加強(qiáng)對其人工繁殖和養(yǎng)殖方面的研究[9]。相關(guān)學(xué)者先后研究了個體繁殖力[10]、年齡與生長[11-13]、性狀比例及體長與體重的關(guān)系[14]、耗氧率和窒息點[15]、消化酶活性[16]等生物學(xué)與生理特性，初步報道了人工繁殖技術(shù)[17-18]及幼魚的營養(yǎng)需求[19-20]等。目前，關(guān)于黑尾近紅鲌精子保存研究尚未見報道。本研究研究其精子在低溫條件下不同保存液中的活力，以期探索精子保持最大活力的環(huán)境條件與保存時間，為精子保存液配制與保存提供科學(xué)依據(jù)，為黑尾近紅鲌規(guī)?；斯し敝程峁﹨⒖?。

1 材料與方法

1.1 試驗魚來源

黑尾近紅鲌來自武漢先鋒水產(chǎn)科技有限公司養(yǎng)殖基地，體重450～530 g，性成熟良好，無病無傷。

1.2 精子保存液配制

根據(jù)魚類精子生理要求，參照有關(guān)資料[1,4-6]配制A～E 5種精子保存液。

(1)精子保存液A配方：分別取Hanks精子保存液配方甲液、乙液各5 mL，混合后加蒸餾水定容至100 mL，即配制成精子保存液A。Hanks精子保存液配方見表1。

表1 Hanks 精子保存液配方

(2)精子保存液B配方(漁用任氏液)：NaCl 0.78 g，KCl 0.02 g，CaCl20.021 g，NaHCO30.002 1 g ，蒸餾水100 mL。

(3)精子保存液C配方：葡萄糖2.90 g，KCl 0.05 g，CaCl20.02 g，NaHCO30.21 g，蒸餾水100 mL。

(4)精子保存液D配方：NaCl 0.743 g，KCl 0.278 g，CaCl20.029 g，MgCl2·6H2O 0.030 g，NaHCO30.042 g，蒸餾水100 mL。

(5)精子保存液E配方：NaCl 0.690 3 g，KCl 0.094 6 g，CaCl20.03 g，MgCl2·6H2O 0.014 2 g，Na2HPO40.054 g，NaHCO30.399 9 g，酪氨酸0.099 6 g，甘氨酸0.041 2 g，牛血清白蛋白0.411 g，蒸餾水100 mL。

以上精子保存液均用可密封棕色玻璃瓶低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試驗設(shè)計

以A～E精子保存液和A～E精子保存液分別添加2.0×104IU/mL青霉素，在低溫4 ℃條件下保存黑尾近紅鲌精子，比較各配方的精子保存效果。前12 h每隔2 h觀察精子活力1次，以后每隔12 h觀察精子活力1次。觀察保存在精子保存液中黑尾近紅鲌精子活力隨時間而變化的規(guī)律，確定最佳精子保存液配方與保存時間。

1.4 精子采集保存

選用10 mL可密封避光離心管，經(jīng)滅菌處理后作精子保存容器用，共30個。采精前擦干魚體并排除尿液和糞便，輕輕擠壓腹部，當(dāng)有乳白色精液流出時，立即用吸管收集注入精子保存液中，精液與保存液比例為1∶5，采集結(jié)束后4 ℃低溫保存。每種精子保存液分3組保存觀察。

1.5 精子活力觀察

以精子被激活后的活力(快速運(yùn)動精子占總精子數(shù)的百分比)為指標(biāo)對保存效果進(jìn)行評價。觀察時先將保存有精子的精子保存液取出搖勻，然后用移液槍吸出一小滴置于載玻片上，在顯微鏡16×10倍數(shù)下觀察精子，觀察到精子后立即用半滴蒸餾水激活精子，觀察其運(yùn)動情況并記錄。精子活力區(qū)分與記錄方法按文獻(xiàn)[4]進(jìn)行。

1.6 受精效果觀察

采用保存效果最優(yōu)的保存液保存黑尾近紅鲌精子，通過人工授精驗證經(jīng)短期低溫保存的精子受精效果。

在繁殖季節(jié)挑選性成熟良好、體質(zhì)健壯的黑尾近紅鲌親魚，用PG、HCG和LRH-A2進(jìn)行催產(chǎn)，發(fā)情時起捕親魚，輕壓雌魚腹部獲取卵子，隨機(jī)分成9組，每組550～600粒，置入干燥、潔凈的培養(yǎng)皿中；分別及時加入1 mL黑尾近紅鲌鮮精和最優(yōu)保存液保存的精子(取100%、80%以上快速運(yùn)動達(dá)最長時間點的精子)混勻，迅速加入10 mL 0.7%的生理鹽水充分混勻并防止卵粒堆積，立即加入100 mL蒸餾水后靜置平放，待受精卵完全粘附培養(yǎng)皿后置換蒸餾水5次，排出精卵帶入的其它物質(zhì)影響孵化環(huán)境；10 h后受精卵處于囊胚中期時觀察并統(tǒng)計受精卵，計算受精率。

2 結(jié)果

2.1 5種(A～E)精子保存液的保存效果比較

低溫4 ℃條件下，A、B、C、D、E 5種精子保存液對黑尾近紅鲌精子的保存效果表現(xiàn)出明顯差異，具體結(jié)果見表2。

表2 不同精子保存液對黑尾近紅鲌精子的保存效果

注：*表示添加2.0×104IU/mL青霉素的精子保存液。“+++”表示100%精子快速運(yùn)動，“++”表示80%以上的精子快速運(yùn)動，“+”表示50%精子快速運(yùn)動，“+-”表示10%～30%精子快速運(yùn)動，“-”表示全部死亡或少量在原地振動。

用精子保存液A、B、C、D、E保存黑尾近紅鲌精子，100%的精子處于快速運(yùn)動狀態(tài)時，保存時間分別為24、10、36、24、24 h；80%的精子處于快速運(yùn)動狀態(tài)時，保存時間分別為48、24、60、48、48 h。此后的精子活力明顯下降，其中保存液A、D組下降更明顯，未能觀察出快速運(yùn)動精子為50%的保存時間；保存液B、C、E分別保存至36、72、60 h時，快速運(yùn)動精子為50%。用精子保存液A、B、C、D、E分別保存至60、48、84、60、72 h時，僅10%～30%的精子處于快速運(yùn)動狀態(tài)；精子基本死亡或少量原地振動時，保存時間分別為72、60、96、72、84 h。

A、B、C、D、E 5種精子保存液保存黑尾近紅鲌精子，以精子保存液C的保存效果最好，精子活力為80%的保存時間(60 h)比A、D、E等保存液組延長了12 h，比保存液B組延長了36 h；其次為保存液E，精子活力為80%的保存時間與保存液A和D組別一致、比保存液B組延長24 h，但精子活力為50%的保存時間比保存液A、D組別長；保存液B的保存效果最差。

2.2 適量添加青霉素的5種(A～E)精子保存液保存效果比較

低溫4℃條件下，在A、B、C、D、E 5種精子保存液中分別添加2.0×104IU/mL青霉素，黑尾近紅鲌精子保存效果表現(xiàn)出明顯差異，具體結(jié)果見表2。

精子保存液A、B、C、D、E分別添加2.0×104IU/mL青霉素保存黑尾近紅鲌精子，100%的精子處于快速運(yùn)動狀態(tài)時，保存時間分別為36、10、84、24、48 h；80%的精子處于快速運(yùn)動狀態(tài)時，保存時間分別為60、36、156、48、144 h。此后的精子活力明顯下降，其中保存液A、D組下降更明顯，與未添加青霉素組一樣未能觀察出快速運(yùn)動精子為50%的保存時間；保存液B、C、E分別保存至48、168、156 h時，快速運(yùn)動精子為50%。用精子保存液A、B、C、D、E分別保存至72、60、180、60、168 h時，僅10%～30%的精子處于快速運(yùn)動狀態(tài)；精子基本死亡或少量原地振動時，保存時間分別為84、72、192、72、180 h。

在各保存液中分別添加濃度為2.0×104IU/mL的青霉素，精子活力達(dá)80%的A、B、C、D、E保存液的保存時間延長了12 ～96 h。保存液C和E的延長時間最長，均為96 h；保存液A、B的延長時間均為12 h，保存液D與未添加組基本一致。

結(jié)果表明，在保存液中添加2.0×104IU/mL的青霉素，保存液C的保存效果最好，精子活力達(dá)80%的保存時間為156 h；其次是保存液E，精子活力達(dá)80%的保存時間為144 h。

2.3 保存液保存的精子人工授精結(jié)果

采用添加2.0×104IU/mL青霉素的保存液C保存黑尾近紅鲌精子，分別取保存至84 h(精子活力100%)和156 h(精子活力80%)的精子與剛排出的成熟卵子進(jìn)行人工授精，并與新鮮精液精子的受精效果進(jìn)行比較。由表3可見，添加2.0×104IU/mL青霉素的保存液C保存精子至84 h和156 h的黑尾近紅鲌受精率分別為(91.8±0.9)%、(90.6±0.8)%，而剛排出的黑尾近紅鲌新鮮精液精子受精率為(92.4±0.8)%；經(jīng)顯著性檢驗分析，三者受精率無顯著性差異(P>0.05)。

表3 精子保存液保存的黑尾近紅鲌精子人工授精結(jié)果

※ 同列標(biāo)注相同字母a表示差異不顯著(P>0.05)。

由此驗證，添加青霉素(2.0×104IU/mL)的保存液C為最優(yōu)的黑尾近紅鲌精子保存液，經(jīng)低溫短期保存(4 ℃，156 h)的精子用于人工繁殖的效果與新鮮精液的效果相當(dāng)。

3 討論

魚類精漿成分主要包括Na+、K+、Ca2+、Mg2+、葡萄糖、氨基酸等，這些成分均為精子存活的重要基礎(chǔ)[1,21-24]。在精子保存液配制方面，目前尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，一般原則為：保存液與保存的精液等滲或稍高滲，以抑制精子運(yùn)動；具有一定的緩沖能力；含有一定的營養(yǎng)物質(zhì)，以供精子在低溫下微弱的代謝需要[25]。本試驗中的配方是基于相關(guān)學(xué)者精子保存環(huán)境研究以及模擬保存配方，旨在實踐操作中為精子提供與體內(nèi)相似的環(huán)境，從而達(dá)到長時間保存效果。筆者根據(jù)上述原則配制的A、B、C、D、E 5種精子保存液的保存效果差異較大，保存液C對黑尾近紅鲌精子的保存效果最好，80%的精子呈快速運(yùn)動狀態(tài)的時間達(dá)60 h；其次是保存液E，80%的精子呈快速運(yùn)動狀態(tài)的時間雖與保存液A、D組一致，繼續(xù)保存時，50%的精子呈快速運(yùn)動狀態(tài)的時間比A、D組長；保存液B的保存效果最差，80%的精子呈快速運(yùn)動狀態(tài)的時間僅24 h。

有研究報道，Ca2+、Mg2+對鯉(Cyprinuscarpio)和團(tuán)頭魴(Megalobramaamblycephala)等精子有抑制作用[26]。本實驗中的保存液A、D、E組均含有Ca2+、Mg2+，未表現(xiàn)出明顯提高精子保存效果的作用；而保存液C組無Mg2+，但葡萄糖含量較高(0.029 g/ mL)，其保存時間最長。這可能與不同物種的精子特性、C組中的葡萄糖為精子提供較好的營養(yǎng)有關(guān)。

嚴(yán)安生等[27]研究表明，單糖對精子的活力有影響，體外受精魚類的精子具有利用細(xì)胞外源性小分子單糖來補(bǔ)償自身消耗的能力。從保存液配方來看，A組中影響滲透壓和精子活力的Na+、K+、Ca2+、Mg2+等離子明顯高于C組，C組中的葡萄糖(0.029 g/mL)顯著高于A組(0.001g/mL)，另外3組保存液中均不含葡萄糖；這表明在上述一定的離子濃度范圍內(nèi)，保存液中適量添加葡萄糖可延長黑尾近紅鲌精子的保存時間。

沈建忠等[4]對南方鲇精子保存液研究結(jié)果表明，牛血清蛋白和氨基酸作營養(yǎng)物質(zhì)對南方鲇精子活力的保存有很好的效果，比僅添加葡萄糖作營養(yǎng)物質(zhì)的效果強(qiáng)。本實驗中，只添加葡萄糖作營養(yǎng)物質(zhì)的保存液C的保存效果略優(yōu)于保存液E。這與沈建忠等結(jié)果相異，添加牛血清蛋白和氨基酸的具體原因有待進(jìn)一步研究。

在精子采集和保存過程中難免會帶入細(xì)菌，從而導(dǎo)致保存液污染或精子感染死亡。以往的研究報道中通常青霉素的使用量為0.5×104～1.0×104IU/mL[28-29]；本研究添加2.0×104IU/mL青霉素，除保存液D外，其它各添加組均延長了精子保存時間，與趙欽等[5]對黃顙魚的研究結(jié)果一致；保存液C組156 h內(nèi)精子活力超過80%，人工繁殖時與新鮮精子受精效果相當(dāng)，經(jīng)短期低溫保存的精子完全可用于實際生產(chǎn)中。添加同樣濃度青霉素的保存液D組未能延長精子保存時間，這是否與該配方添加此濃度青霉素未能改善精子保存條件或精子采集過程中污染較嚴(yán)重有關(guān)有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，低溫4 ℃條件下，在保存液中添加2.0×104IU/mL青霉素，保存液C的保存時間最長，其次是保存液E，保存液C、E使精子活力達(dá)80%的保存時間分別為156、144 h，能滿足黑尾近紅鲌人工繁殖或育種需求；且保存液C的配制成本低廉，方法簡單，保存條件易滿足，操作方便，適合在生產(chǎn)上推廣應(yīng)用。

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(責(zé)任編輯：陳細(xì)華)

Preservation of sperm from Ancherythroculter nigrocauda at low temperature and its application

WANG Gui-ying1,2,ZHANG Han2,3,LI Qing1,2,ZHU Dong-mei1,2,

( 1.FisheriesResearchInstitute，WuhanAcademyofAgriculturalScience&Technology,Wuhan430207,China;2.WuhanXianfengAquacultureTechnologyCo.Ltd.,Wuhan430207,China;3.QianjiangFisheriesTechnologyPromotionCenter,Qianjiang433199,Hubei,China)

Under the condition of low temperature (4oC),we studied the effects of 5 kinds of sperm preservation solutions (A,B,C,D,E) containing different concentration of Na+,K+,Ca2+,Mg2+,amino acid,glucose and adding moderate amount of penicillin on the sperm motility inAncherythroculternigrocauda,to explored the best preservation condition of the sperm vitality as indicators.The results showed that:1) Under the temperature of 4 ℃,the preservative solution of A,B,C,D and E could keep 80% of spermatozoa having fast motility within 48,24,60,48,48 h respectively,and the preservation time of C solution was obviously higher than that of other groups;2) With the addition of 2.0×104IU/mL penicillin,A,B,C,D and E could keep 80% of spermatozoa having fast motility within 60,36,156,48,144 h respectively,and the preservation time were prolonged for 12 h ～ 96 h.C and E solutions were extended to the longest time both with 96 h;3) The experiment of artificial insemination proved that the preserved sperm ofA.nigrocaudacould be normally used for artificial breeding,and the fertilization rate (90.6±0.8)%～(91.8±0.9)% had no significant difference (p>0.05) compared with control group fresh sperm (92.4±0.8%).The results indicated that among the preservation solutions with addition of 2.0×104IU/mL penicillin,the C solution had the best preservation effect,followed by E,which could be applied in the factory production.

Ancherythroculternigrocauda;sperm;preservation solution;penicillin;preservation effect

2016-01-13；

2016-05-27

國家科技計劃項目(2015BAD25B01-5)；武漢市黃鶴英才計劃項目(武人才辦[2014]8號，序號19)；武漢市科技計劃項目(20032003035、2013020705070350-15、2014020202010137)

王貴英(1965- )，女，碩士，高級工程師，主要從事魚類育種與健康養(yǎng)殖研究。E-mail：whxfsc@163.com

李 清。E-mail：xfsckj@163.com

S917.0

A

1000-6907-(2016)06-0003-05