陳美娜，胡謙，肖強(qiáng)，劉銀歌，李娟英

上海海洋大學(xué)水產(chǎn)動(dòng)物遺傳育種中心協(xié)同創(chuàng)新中心，上海 201306

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Tenax萃取技術(shù)用于養(yǎng)殖底泥中有機(jī)氯農(nóng)藥的生物有效性研究

陳美娜，胡謙，肖強(qiáng)，劉銀歌，李娟英*

上海海洋大學(xué)水產(chǎn)動(dòng)物遺傳育種中心協(xié)同創(chuàng)新中心，上海 201306

本研究以經(jīng)濟(jì)底棲生物菲律賓蛤仔和河蜆為受試生物，分別對(duì)不同濃度梯度的海洋和淡水底泥中9種代表性有機(jī)氯農(nóng)藥(OCPs)進(jìn)行累積實(shí)驗(yàn)；同時(shí)采用Tenax連續(xù)萃取法研究2類底泥中OCPs的脫附動(dòng)力學(xué)，提供簡(jiǎn)單、快速評(píng)價(jià)養(yǎng)殖底泥中OCPs生物有效性的方法，并將Tenax萃取結(jié)果與2種底棲生物的累積結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果表明，菲律賓蛤仔和河蜆對(duì)OCPs的生物-底泥富集因子(BSAF)分別為0.31～1.89和0.12～2.12，且底泥中有機(jī)碳標(biāo)化的OCPs濃度與生物體內(nèi)脂肪標(biāo)化的OCPs濃度之間的相關(guān)性較差。Tenax脫附動(dòng)力學(xué)的結(jié)果表明，2類底泥中OCPs的快速脫附比例(Frap)均在50%左右，其快速、慢速和極慢速脫附速率常數(shù)數(shù)量級(jí)分別為10-1、10-2和10-4。Tenax快速脫附組分與2種底棲生物累積結(jié)果之間具有良好的相關(guān)性(r2=0.75，P<0.0001)，表明Tenax萃取技術(shù)可以預(yù)測(cè)OCPs在底棲生物體內(nèi)的累積量，并且該方法克服了大型底棲生物累積實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性較差等缺點(diǎn)。另外通過(guò)與基于熱力學(xué)平衡的方法對(duì)比發(fā)現(xiàn)，Tenax萃取技術(shù)更適用于濾食性或可消化底泥的底棲生物對(duì)底泥污染物的富集；同時(shí)Tenax 6 h和24 h單點(diǎn)萃取技術(shù)可以作為簡(jiǎn)單快速評(píng)價(jià)底泥疏水性有機(jī)污染物(HOCs)生物有效性的替代方法，進(jìn)一步為養(yǎng)殖領(lǐng)域的底泥污染狀況以及相關(guān)水產(chǎn)品的質(zhì)量安全和食用風(fēng)險(xiǎn)提供生物有效性評(píng)價(jià)依據(jù)。

有機(jī)氯農(nóng)藥；底泥；經(jīng)濟(jì)底棲生物；Tenax萃??；生物有效性

有機(jī)氯農(nóng)藥(organochlorine pesticides, OCPs)是20世紀(jì)70、80年代主要使用的殺蟲(chóng)劑[1]，屬于疏水性有機(jī)污染物(hydrophobic organic contaminants, HOCs)，具有較大的辛醇-水分配系數(shù)(Kow)，主要儲(chǔ)存于底泥(沉積物)有機(jī)質(zhì)中[2]。因?yàn)镺CPs難以降解，在自然環(huán)境中存在可以長(zhǎng)達(dá)數(shù)十年甚至上百年，因此盡管大部分OCPs在我國(guó)已經(jīng)停止生產(chǎn)和使用，但是至今在我國(guó)部分地區(qū)的水體、底泥和食品中仍維持一定量的殘留水平[1]；例如2006年太湖、海河和大沽排污河的表層底泥中OCPs的總濃度分別高達(dá)4.22～460.99、8.95～239.92和27.36～250.46 μg·kg-1(干重)[3-4]。近年來(lái)有研究表明，養(yǎng)殖區(qū)域的底泥中OCPs存在一定的檢出率，如呂贏等[5]的研究結(jié)果顯示呂泗漁場(chǎng)海域受到OCPs一定程度上的污染，其中含量最高的為六六六和滴滴涕。由于OCPs具有生物累積性和高毒性，殘留于底泥中的該類污染物可能被棲息于底泥或水體中的生物富集并造成毒性影響，從而影響水產(chǎn)品如魚(yú)、蝦和蚌等的生長(zhǎng)和食品質(zhì)量，進(jìn)一步經(jīng)食物鏈生物放大作用而危害人類健康[1]。因此，底泥中OCPs生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)受到廣泛關(guān)注，研究底泥中OCPs的殘留風(fēng)險(xiǎn)具有重要意義。

傳統(tǒng)評(píng)估底泥質(zhì)量的化學(xué)分析方法通常采用污染物的總量進(jìn)行評(píng)價(jià)，但是由于污染物總量沒(méi)有考慮到生物有效性或污染物的形態(tài)，得到的結(jié)果可能會(huì)高估其環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)[6]，進(jìn)而無(wú)法準(zhǔn)確反映污染物對(duì)生物可能造成的不利影響及相關(guān)的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)，因而生物有效性的研究很有必要。目前，針對(duì)生物有效性的研究方法有生物暴露法，即通過(guò)底棲生物的暴露實(shí)驗(yàn)確定從底泥進(jìn)入到生物體內(nèi)污染物的量，進(jìn)而表征該類污染物的生物有效性，但該方法通常存在受試生物飼養(yǎng)過(guò)程繁瑣，試驗(yàn)周期較長(zhǎng)，生物個(gè)體差異大，耗時(shí)費(fèi)力和實(shí)驗(yàn)重復(fù)性較差等缺點(diǎn)[6]。因此，具有快捷簡(jiǎn)易、價(jià)格相對(duì)低廉和重現(xiàn)性好等特點(diǎn)，用于評(píng)價(jià)底泥中HOCs生物有效性的化學(xué)萃取技術(shù)成為研究熱點(diǎn)[7]?；瘜W(xué)萃取技術(shù)大體上可歸納為2類，包括基于熱力學(xué)平衡(如SPME固相微萃取技術(shù))和基于脫附動(dòng)力學(xué)過(guò)程(如Tenax萃取技術(shù))的評(píng)價(jià)方法[8]；另外通過(guò)2種化學(xué)技術(shù)得到的底泥中HOCs的萃取濃度與生物累積結(jié)果之間的相關(guān)性也被廣泛報(bào)道[9-12]。

本研究以底棲濾食生活的海洋和淡水經(jīng)濟(jì)雙殼類生物菲律賓蛤仔和河蜆為受試生物，利用生物累積實(shí)驗(yàn)測(cè)試2種雙殼類底棲生物對(duì)養(yǎng)殖底泥中OCPs的生物富集程度。同時(shí)利用基于脫附動(dòng)力學(xué)的Tenax萃取技術(shù)評(píng)價(jià)底泥中OCPs的生物有效性，并對(duì)Tenax萃取結(jié)果與生物累積結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析，進(jìn)而驗(yàn)證Tenax萃取技術(shù)應(yīng)用于評(píng)價(jià)生物有效性和預(yù)測(cè)生物累積的可靠性和準(zhǔn)確性，以期在評(píng)價(jià)和預(yù)測(cè)養(yǎng)殖底泥中OCPs的生物有效性和生物累積性時(shí)提供更為簡(jiǎn)單、可行的方法，同時(shí)也為相關(guān)水產(chǎn)品質(zhì)量安全和食用風(fēng)險(xiǎn)提供有力參考依據(jù)。

1 材料與方法 (Materials and methods)

1.1 藥品與試劑

甲醇、丙酮、正己烷和二氯甲烷等有機(jī)溶劑均為色譜純，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；無(wú)水硫酸鈉、Florisil硅土(100～200目)、層析硅膠(80～100目)、氧化鋁和銅粉均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)。無(wú)水硫酸鈉、Florisil硅土、層析硅膠和氧化鋁分別置于馬弗爐中在450 ℃、650 ℃、650 ℃和400 ℃下灼燒6 h，冷卻后轉(zhuǎn)移到干燥器備用；銅粉在使用前，用5 mol·L-1鹽酸活化5 h后再用丙酮超聲清洗2次備用。Tenax-TA(60～80目)購(gòu)自美國(guó)Supelco公司，使用前分別用丙酮和正己烷超聲清洗3次，75 ℃條件下烘干備用。9種有機(jī)氯農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品α-六六六、β-六六六、γ-六六六、δ-六六六、p,p'-DDD、p,p'-DDE、六氯苯、環(huán)氧七氯和狄氏劑購(gòu)自德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法1.2.1 底泥的采集、分析及加標(biāo)老化

本實(shí)驗(yàn)中所用底泥分別采自上海洋山港潮間帶表層底泥(海水底泥)和上海蘆潮港引河表層底泥(淡水底泥)，2種底泥的有機(jī)碳(OC)和黑碳(BC)含量采用元素分析儀測(cè)定，測(cè)定結(jié)果分別為：w(OC)= 0.53%±0.008%，w(BC)= 0.10%±0.001%和w(OC)= 0.75%±0.043%，w(BC)= 0.14%±0.011%。本研究選擇底泥環(huán)境檢出率較高并具有不同梯度Kow值的9種OCPs作為研究對(duì)象，并以實(shí)際環(huán)境底泥中OCPs殘留數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)選擇2個(gè)加標(biāo)濃度梯度，分別為生態(tài)效應(yīng)低值(美國(guó)EPA底泥質(zhì)量基準(zhǔn)，lowest effect level，LEL)的2倍和4倍。將以丙酮為載體的9種有機(jī)氯農(nóng)藥混合液加入2種底泥中，攪拌均勻后于4 ℃冰箱內(nèi)避光條件下老化28 d。

1.2.2 生物累積實(shí)驗(yàn)

分別選取殼長(zhǎng)(32±2) mm、殼高(12±2) mm的健壯成年菲律賓蛤仔和殼長(zhǎng)(22±2) mm、殼高(20±2) mm的健壯成年河蜆在實(shí)驗(yàn)室條件下馴養(yǎng)3周以上。馴養(yǎng)過(guò)程中采用半靜水式方法，水溫控制為(20±1) ℃，連續(xù)曝氣，日換水量1/2，每天定時(shí)定量投加實(shí)驗(yàn)純培養(yǎng)微藻餌料；其中菲律賓蛤仔和河蜆的養(yǎng)殖用水分別為鹽度25±2的人工海水和在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)曝氣2 d以上的自來(lái)水。生物樣品中脂肪的測(cè)定采用索氏抽提法，具體操作步驟參考GB/T5009.6—2003《食品中脂肪的測(cè)定》；菲律賓蛤仔和河蜆的脂肪含量分別為0.51%±0.157%和1.52%±0.155%。

累積實(shí)驗(yàn)參照EPA方法(EPA 600/R-99/064)，稱取2 kg(濕重)左右的老化底泥，放入8 L玻璃缸中，表面覆蓋6 L左右的養(yǎng)殖用水。靜置1 d后，向盛裝底泥的玻璃缸中放入馴養(yǎng)后活力強(qiáng)、個(gè)體大小相近的菲律賓蛤仔和河蜆25～30只，采用半靜水式方法(日換水量1/2)進(jìn)行累積實(shí)驗(yàn)，條件同馴養(yǎng)，暴露期間不喂食。2種生物的累積實(shí)驗(yàn)分別設(shè)置1個(gè)空白，每個(gè)濃度梯度設(shè)置3個(gè)平行，持續(xù)28 d。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將生物和底泥取出，冷凍干燥磨碎后備用。

1.2.3 Tenax脫附動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)

取4 g(濕重)老化底泥置于40 mL棕色樣品瓶中，加入0.3 g Tenax和35 mL去離子水，再加入約3 mg的HgCl2(相當(dāng)于底泥干重的0.15%)，搖勻后置于滾軸混合器上連續(xù)振蕩。在合適的時(shí)間點(diǎn)(1、3、6、12、24、48、96、168、312、480和672 h)分離Tenax，重新加入0.3 g新鮮Tenax，繼續(xù)振蕩。將上述步驟中每次分離出的Tenax用10 mL丙酮/正己烷(V/V=1:1)混合液超聲萃取2次，每次10 min，將2次萃取液合并，按3 000 r·min-1離心5 min，輕柔氮?dú)獯蹈桑谜和槎ㄈ葜? mL，待氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)測(cè)定，試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行。

1.3 樣品處理及測(cè)定

1.3.1 樣品的萃取和凈化

底泥樣品的萃取和凈化：稱取冷凍干燥后的底泥樣品3 g，加入1 g清洗后的銅粉，用濾紙包好后放入抽提器中，加入100 mL丙酮/正己烷(V/V=1:1)混合液，進(jìn)行索氏提取，提取溫度65 ℃，連續(xù)萃取24 h，萃取結(jié)束后，濃縮萃取液至1 mL左右進(jìn)行凈化。凈化柱從下至上依次填充1 cm無(wú)水硫酸鈉、3～5 g Florisil硅土和1 cm無(wú)水硫酸鈉，凈化之前需用10 mL正己烷預(yù)淋洗凈化柱，然后將濃縮后的萃取液移入凈化柱中，用30 mL正己烷/二氯甲烷(V/V=1:1)混合液淋洗，收集淋洗液，輕柔氮?dú)獯蹈?，用正己烷定容? mL，GC-MS待測(cè)。

生物樣品的萃取和凈化：稱取冷凍干燥后的生物樣品1 g，用濾紙包好后放入抽提器中，加入100 mL丙酮/正己烷(V/V=1:1)混合液，進(jìn)行索氏提取，65 ℃下連續(xù)萃取24 h，萃取結(jié)束后，萃取液用輕柔氮?dú)獯抵两?，將溶劑置換為4 mL乙腈，再加入4 mL乙腈飽和的石油醚，漩渦振蕩1 min，使其充分混合。于3 000 r·min-1離心5 min，棄去上層石油醚，將乙腈層氮?dú)獯蹈伞?乙腈飽和的石油醚的配制：參考GB/T5009.132—2003，向100 mL石油醚中加入20 mL乙腈，振蕩1 min，待靜置分層后，上層即為乙腈飽和的石油醚，取其保存?zhèn)溆肹13]。)將上述氮?dú)獯蹈傻纳飿悠酚? mL正己烷/二氯甲烷(V/V=1:1)混合液溶解殘留物移入已經(jīng)預(yù)淋洗好的凈化柱中，凈化柱從下至上依次為1 cm無(wú)水硫酸鈉、5 g氧化鋁、5 g中性硅膠和1 cm無(wú)水硫酸鈉，用30 mL正己烷/二氯甲烷(V/V=1:1)混合液淋洗，收集淋洗液，輕柔氮?dú)獯蹈桑谜和槎ㄈ葜? mL，GC-MS待測(cè)。

1.3.2 色譜分析

采用GC-MS (Agilent7890A/5975C)和DB-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)色譜柱進(jìn)行分離分析。選用EI離子源，選擇離子監(jiān)測(cè)模式，以脈沖不分流方式進(jìn)樣，進(jìn)樣量為2 μL，載氣流量為1.2 mLmin-1。氣相條件：進(jìn)樣口溫度280 ℃；色譜柱初始溫度50 ℃，保持3 min；以35 ℃min-1上升到220 ℃，保持1 min；15 ℃min-1上升到300 ℃，保持2 min。質(zhì)譜條件：離子源溫度為230 ℃，四級(jí)桿溫度為150 ℃，傳輸線溫度為300 ℃。

1.4 質(zhì)量保證與質(zhì)量控制

通過(guò)測(cè)定2種受試生物體內(nèi)有機(jī)氯農(nóng)藥的背景值發(fā)現(xiàn)，其背景值均低于檢測(cè)限；同時(shí)對(duì)用于喂食的純培養(yǎng)微藻餌料進(jìn)行測(cè)定，同樣沒(méi)有檢測(cè)到有機(jī)氯農(nóng)藥的殘留。生物累積試驗(yàn)期間生物的死亡率控制在15%以內(nèi)，均無(wú)急性毒性，滿足生物累積試驗(yàn)的要求。底泥和生物樣品提取前，進(jìn)行加標(biāo)3個(gè)濃度梯度OCPs的樣品回收率實(shí)驗(yàn)，其回收率在70%～120%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.2%～15%，方法檢出限為0.10～1.5 μg·kg-1。暴露實(shí)驗(yàn)中設(shè)置過(guò)程空白、方法空白及3個(gè)平行，對(duì)底泥和生物樣品的萃取和凈化做全流程空白實(shí)驗(yàn)及3個(gè)樣品平行樣。

2 結(jié)果與討論(Results and discussions)

2.1 2種雙殼類底棲生物對(duì)養(yǎng)殖底泥中OCPs的生物富集作用

一般認(rèn)為底泥環(huán)境中HOCs的生物富集是HOCs在生物體脂類與底泥之間的分配過(guò)程，HOCs在水生生物中的累積主要是通過(guò)鰓與表皮的直接吸收和攝食懸浮顆粒物以及其他生物等途徑，通常用生物-底泥富集因子(biota-sediment accumulation factor，BSAF)表示水生生物對(duì)底泥HOCs的富集程度，即平衡時(shí)生物體內(nèi)化學(xué)物質(zhì)濃度與底泥中濃度的比值，其大小取決于HOCs在生物脂肪與底泥有機(jī)碳之間的相對(duì)親和力[14]。為了更好地比較HOCs的生物富集作用，本研究通過(guò)計(jì)算得到菲律賓蛤仔和河蜆對(duì)OCPs的BSAF值(表1)。

由表1可知，菲律賓蛤仔和河蜆對(duì)底泥中9種OCPs的生物-底泥富集因子BSAF在0.31～1.89和0.12～2.12之間，這與李天云[15]的研究中河蜆對(duì)OCPs的BSAF(1.79±0.22)值接近。有研究認(rèn)為，當(dāng)HOCs在底泥、水和生物體內(nèi)達(dá)到分配平衡時(shí)，BSAF值一般處于1～4之間[16]，因此本研究中大部分OCPs的BSAF值屬于正常范圍。其中菲律賓蛤仔對(duì)六氯苯和p,p’-DDE及河蜆對(duì)六氯苯的BSAF值較其他有機(jī)氯農(nóng)藥相對(duì)偏低，這可能是由于底泥理化性質(zhì)和農(nóng)藥的自身性質(zhì)等導(dǎo)致了六氯苯和p,p’-DDE類有機(jī)氯農(nóng)藥在生物體內(nèi)的富集程度偏低。另外國(guó)內(nèi)也有研究報(bào)道魚(yú)類、蝦、蟹以及烏賊對(duì)DDTs的BSAF值分別為0.55、0.26、0.56和0.06，發(fā)現(xiàn)本研究中2種底棲生物對(duì)p,p’-DDE和六氯苯的BSAF值與之比較接近，這與BSAF值受多種因子如底泥OC含量、粒徑分布和生物相的脂肪含量等的影響有關(guān)[15]。

表1 2種濃度梯度下菲律賓蛤仔和河蜆對(duì)有機(jī)氯農(nóng)藥(OCPs)的生物-底泥富集因子(BSAF)

另外，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，底泥中有機(jī)碳標(biāo)化的OCPs濃度(Cs,oc)與生物體內(nèi)脂肪標(biāo)化的OCPs濃度(Cb,lip)之間相關(guān)性不顯著關(guān)(圖1，r2=0.13和0.12；P>0.05)，這主要是由于底棲生物體內(nèi)污染物的主要來(lái)源是底泥中生物有效部分的污染物[17]，而底泥粒徑分布和OC含量與特性以及污染物本身的理化性質(zhì)都會(huì)影響污染物在底泥和生物體內(nèi)的分布濃度，從而導(dǎo)致Cs,oc與Cb,lip的相關(guān)性較差。

目前在養(yǎng)殖水域和水生生物體內(nèi)均能檢測(cè)到有機(jī)氯農(nóng)藥的殘留[5]，長(zhǎng)期以來(lái)，研究工作者使用全底泥監(jiān)測(cè)的方法忽視了環(huán)境介質(zhì)中污染物的總濃度與污染物的生物吸收程度的相關(guān)性，導(dǎo)致污染物的總濃度往往過(guò)高地估計(jì)了污染物的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)[18]。因此，具有快捷、價(jià)格相對(duì)低廉和重現(xiàn)性好等特點(diǎn)的基于脫附動(dòng)力學(xué)的Tenax萃取技術(shù)，用于評(píng)價(jià)底泥中HOCs生物有效性成為研究熱點(diǎn)，并且通過(guò)Tenax(6 h和24 h)單點(diǎn)萃取技術(shù)得到的底泥中HOCs的萃取濃度與生物累積結(jié)果之間的相關(guān)性也被廣泛報(bào)道[10]。

圖1 生物體內(nèi)OCPs濃度(Cb,lip)和底泥中OCPs濃度(Cs,oc)的關(guān)系注：Cb,lip為生物體內(nèi)脂肪標(biāo)化的OCPs濃度(μg·kg-1)，Cs,oc為底泥中有機(jī)碳標(biāo)化的OCPs濃度(μg·kg-1)。Fig. 1 The correlation between the concentrations of OCPs in organisms (Cb,lip) and sediments (Cs,oc)Note: Cb,lip, lipid-normalized concentrations in organisms (μg·kg-1); Cs,oc, organic carbon normalized OCPs concentrations in sediments (μg·kg-1).

2.2 Tenax萃取技術(shù)評(píng)價(jià)底泥中OCPs的生物有效性

Tenax(商品名)是一種多孔的高分子聚合物，化學(xué)名為聚2,6-二苯基對(duì)苯醚(poly(2,6)-diphenyl-p-phenylene oxide)，具有孔隙多、比表面積大和吸收容量大等性質(zhì)，對(duì)HOCs具有良好的吸附和脫附能力，可以源源不斷地萃取孔隙水中的HOCs，從而促進(jìn)底泥有機(jī)質(zhì)中的HOCs向孔隙水中轉(zhuǎn)移，最終達(dá)到完全提取的目的[6]。Cornelissen等[19]較早使用Tenax連續(xù)萃取結(jié)果擬合三相脫附方程(下述式1和2)來(lái)研究底泥中HOCs的脫附動(dòng)力學(xué)，根據(jù)HOCs與底泥的結(jié)合能力不同，分為快速、慢速和極慢速脫附部分，并用快速脫附組分所占比例(Frap)來(lái)表征底泥中HOCs的生物有效性，其中快速脫附部分容易脫附下來(lái)進(jìn)入到水相中，因而易于被生物吸收富集。

(1)

Frap+Fslow+Fvs= 1

(2)

其中：S0、St分別表示初始點(diǎn)和t (h)時(shí)間點(diǎn)測(cè)得的底泥中HOCs的含量(ng)；Frap，F(xiàn)slow和Fvs分別表示快速、慢速和極慢速脫附組分的量占總量的比例(%)；krap、kslow和kvs分別表示快速、慢速和極慢速脫附組分的脫附速率常數(shù)(h-1)。

2.2.1 有機(jī)氯農(nóng)藥的脫附動(dòng)力學(xué)

本文通過(guò)Tenax連續(xù)萃取實(shí)驗(yàn)研究底泥中OCPs的脫附動(dòng)力學(xué)，得出各脫附動(dòng)力學(xué)參數(shù)(表2)，以期為養(yǎng)殖底泥中OCPs的生物有效性提供簡(jiǎn)單快捷、有效的評(píng)價(jià)方法。

由表2可知，海水和淡水2種底泥中OCPs的快速脫附組分所占比例(Frap)最大，均在50%左右，范圍處于40%～70%之間，慢速脫附比例(Fslow)約在10%～40%之間，極慢速脫附比例(Fvs)約在10%～30%之間。說(shuō)明底泥中接近一半的OCPs屬于快速脫附組分，較容易脫附下來(lái)被生物所利用，而慢速和極慢速脫附組分之和約占總量一半。其他研究對(duì)底泥中OCPs的脫附動(dòng)力學(xué)也作出了報(bào)道，如Agustina等[27]的研究顯示，底泥中DDTs的Frap在30%～45%之間，Yang等[28]的研究中DDTs的Frap在25%～45%之間，本研究中DDTs的Frap(40%～50%)與兩者相比均較高，這可能是由于不同理化性質(zhì)的底泥對(duì)DDTs的生物有效性有所差異。You等[29]的研究證明了底泥有機(jī)碳(OC)含量的不同會(huì)影響HOCs的生物有效性，該研究通過(guò)模擬OC含量分別為1.31%和7.85%的2種底泥中DDE的脫附動(dòng)力學(xué)，得出OC含量較低的底泥中DDE的Frap(40%～60%)明顯高于OC含量較高的底泥中的值(20%～30%)，這是由于OC含量較高的底泥表面具有更多的吸附位點(diǎn)，污染物更難脫附下來(lái)，因而表現(xiàn)出較低的生物有效性。Yang等[28]的研究中底泥的OC含量為2.2%，本研究中海水底泥和淡水底泥的OC含量(0.53%和0.75%)均比其較低，因此本研究底泥中OCPs較容易脫附下來(lái)被生物利用，表現(xiàn)出了更高的生物有效性。所以O(shè)C含量較低的底泥中HOCs具有較高的生物有效性，導(dǎo)致了其較高的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)，尤其在養(yǎng)殖底泥中容易被經(jīng)濟(jì)底棲生物所富集進(jìn)而危害到人類健康。

由表2可知，對(duì)于大部分的OCPs，其快速、慢速和極慢速脫附速率常數(shù)大小順序描述為10-1>10-2>10-4(h-1)，這與Yang等[28]的研究結(jié)果一致。Liu等[30]的研究顯示，PBDEs的快速和慢速脫附速率常數(shù)與本研究中的OCPs比較接近分別為10-1和10-2～10-3(h-1)，而PBDEs的極慢速脫附速率常數(shù)(10-5h-1)比OCPs小一個(gè)數(shù)量級(jí)；這是由于具有更強(qiáng)疏水性的PBDEs (lgKow值的范圍5.9～10.33)的極慢速脫附組分更難從底泥中脫附下來(lái)，進(jìn)而更難以被生物所利用。因此通過(guò)Tenax萃取技術(shù)模擬脫附動(dòng)力學(xué)，可以得到底泥中HOCs各組分的脫附比例和相應(yīng)脫附速率常數(shù)，進(jìn)而使用快速脫附比例(Frap)評(píng)價(jià)底泥中HOCs的生物有效性，尤其對(duì)養(yǎng)殖底泥更具有實(shí)踐意義。

2.2.2 Tenax萃取結(jié)果與生物累積結(jié)果的相關(guān)性分析

Tenax萃取技術(shù)被廣泛應(yīng)用于評(píng)價(jià)底泥中HOCs的生物有效性，同時(shí)發(fā)現(xiàn)Tenax萃取部分與底棲生物累積量之間存在良好的相關(guān)性，并且污染物濃度經(jīng)有機(jī)碳標(biāo)化后其相關(guān)性更為顯著。本研究分析了快速脫附組分經(jīng)有機(jī)碳標(biāo)化后OCPs濃度Cs,rap(μg·kg-1)與雙殼類經(jīng)濟(jì)底棲生物菲律賓蛤仔和河蜆體內(nèi)經(jīng)脂肪標(biāo)化后OCPs濃度Cb,lip(μg·kg-1)之間的關(guān)系。結(jié)果表明，lgCs,rap與lgCb,lip之間的相關(guān)性達(dá)到極顯著水平(圖2，P<0.0001)，表明Tenax萃取技術(shù)可以預(yù)測(cè)OCPs在雙殼類經(jīng)濟(jì)底棲生物菲律賓蛤仔和河蜆體內(nèi)的累積量。這與其他研究結(jié)果類似，如Tricia等[9]研究了基于Tenax萃取的lgCs,rap與通過(guò)底棲無(wú)脊椎動(dòng)物L(fēng)umbriculus variegates富集PCBs得到的lgCb,lip之間的線性關(guān)系，即lgCb,lip=0.94 lgCs,rap+ 0.83，r2=0.91。本研究與其他研究中Tenax萃取結(jié)果與生物累積結(jié)果之間均具有良好的相關(guān)性，因此使用Tenax萃取技術(shù)可以準(zhǔn)確、有效地評(píng)價(jià)底泥中HOCs的生物有效性，進(jìn)而為養(yǎng)殖底泥中HOCs的環(huán)境質(zhì)量和相關(guān)水產(chǎn)品的質(zhì)量評(píng)估提供科學(xué)依據(jù)。

圖2 生物體內(nèi)OCPs濃度(Cb,lip)和Tenax萃取快速脫附濃度(Cs,rap)的關(guān)系Fig. 2 The relationship between concentrations of OCPs in Ruditapes philippinarum and Corbicula fluminea (Cb,lip) and concentrations in sediments in the rapidly desorbing fraction (Cb,lip) measured by Tenax extraction

圖3 Frap與F6、F24的相關(guān)性注：F6，F(xiàn)24表示Tenax單點(diǎn)萃取6 h或24 h獲得組分所占比例。Frap 為快速脫附比例。Fig. 3 The relationship between Frap and F6/F24Note: F6, F24 stand for the desorbing fraction after 6 h or 24 h Tenax extraction; Frap stands for rapidly-desorbing fraction.

2.3 Tenax單點(diǎn)萃取技術(shù)評(píng)價(jià)底泥中OCPs的生物有效性

由上述脫附動(dòng)力學(xué)可知，快速脫附比例(Frap)是基于完整的脫附動(dòng)力學(xué)擬合而來(lái)，要獲得底泥中的快速脫附組分一般需要1～100 h，實(shí)驗(yàn)耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)，故有研究認(rèn)為采用Tenax單點(diǎn)萃取(如6 h和24 h)獲得的組分所占比例(如F6和F24)可以代替Frap來(lái)評(píng)價(jià)底泥中HOCs的生物有效性[8]。本研究通過(guò)對(duì)Frap與F6和F24進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)rap與F6、F24相關(guān)性極顯著(圖3，P<0.0001)，其中F6、F24與Frap的比值分別為0.59和1.15。與其他研究類似，如Liu等[30]的研究中，F(xiàn)6/Frap的值為0.60±0.024，F(xiàn)24/Frap的值為1.01±0.015，Yang等[28]的研究發(fā)現(xiàn)F6/Frap的范圍在0.47～0.54之間。另外通過(guò)Tenax(6 h和24 h)單點(diǎn)萃取技術(shù)得到的底泥中HOCs的萃取濃度與生物累積結(jié)果之間的相關(guān)性也被廣泛報(bào)道，Mehler等[10]研究了基于Tenax萃取6 h的結(jié)果lgCs,6h與底棲無(wú)脊椎動(dòng)物L(fēng)umbriculus variegates富集PCBs、DDTs和PBDEs 3種HOCs得到的lgCb,lip之間的線性關(guān)系，結(jié)果為lgCb,lip=1.06 lgCs,6h+ 0.74， r2=0.89；Landrum等[31]研究了基于Tenax萃取24 h的結(jié)果lgCs,24h與通過(guò)2種生物Diporeia spp.和Oligochaetes富集PAHs和PCBs的實(shí)驗(yàn)結(jié)果lgCb,lip之間的線性關(guān)系，分別為lgCb,lip=0.032 lgCs,24h+ 1.06，r2=0.63和lgCb,lip=0.626 lgCs,24h+ 0.71，r2=0.63。因此Tenax 6 h和24 h的單點(diǎn)萃取技術(shù)可以作為簡(jiǎn)單快速測(cè)定底泥HOCs生物有效性的方法，進(jìn)而使用F6和F24實(shí)現(xiàn)了在評(píng)價(jià)上更加簡(jiǎn)單快速而有效(lgCb,lip=1.28 lgCs,6h- 1.01，r2=0.54，P<0.0001；lgCb,lip=1.41 lgCs,24h- 1.60，r2=0.57，P<0.0001)；同時(shí)還可以快速預(yù)測(cè)棲息于海洋和淡水2類底泥中的雙殼類經(jīng)濟(jì)底棲生物對(duì)HOCs的累積程度，為養(yǎng)殖領(lǐng)域的底泥環(huán)境質(zhì)量和污染狀況以及相關(guān)水產(chǎn)品的質(zhì)量安全和食品風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)提供更為快捷、有效的參考依據(jù)。

2.4 Tenax萃取技術(shù)與基于熱力學(xué)平衡方法的比較

由于底泥中HOCs的生物有效性是一個(gè)復(fù)雜的問(wèn)題，因此正確理解其環(huán)境影響有賴于生物有效性評(píng)價(jià)方法的不斷發(fā)展。基于熱力學(xué)平衡的方法是利用平衡被動(dòng)采樣技術(shù)測(cè)定HOCs的化學(xué)活性或底泥孔隙水中HOCs的自由溶解態(tài)濃度(freely dissolved concentration，Cfree)來(lái)評(píng)價(jià)生物有效性(指“即手可得”部分，是環(huán)境中現(xiàn)成的，在一定時(shí)間內(nèi)可穿過(guò)膜進(jìn)入生物體的那部分污染物)；而另一種方法則是使用不完全萃取技術(shù)估計(jì)底泥中HOCs的潛在生物有效性(指“即手可得”與“潛在可給”部分之和，“潛在可給”部分是指暫時(shí)難以被生物所利用，但是在一定條件下可以從底泥中釋放出來(lái)而被生物所吸收的那部分污染物)[8]。基于2種方法得到的“現(xiàn)成”和“潛在”的生物有效性，可以在理論上從2個(gè)不同的方面很好地進(jìn)行描述[12,18,32]。本研究已通過(guò)以上結(jié)果驗(yàn)證了基于脫附動(dòng)力學(xué)的Tenax萃取技術(shù)在評(píng)價(jià)底泥中HOCs生物有效性的準(zhǔn)確性。為了更好地比較該技術(shù)與固相微萃取技術(shù)在量化生物有效性的區(qū)別及相應(yīng)的適用范圍，本研究通過(guò)固相微萃取實(shí)驗(yàn)得到的基于熱力學(xué)平衡狀態(tài)下的生物有效性與基于Tenax脫附動(dòng)力學(xué)方法得到的結(jié)果進(jìn)行比較(圖4)。FAEP(本課題同期未發(fā)表實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，即底泥中HOCs在平衡分配過(guò)程中有效態(tài)濃度占總濃度的比例(the fraction available for equilibrium partitioning，F(xiàn)AEP)[8])與基于Tenax萃取技術(shù)中得到的快速脫附比例(Frap)的相關(guān)性分析，有助于對(duì)2類化學(xué)技術(shù)在評(píng)價(jià)生物有效性方面進(jìn)行較為直觀的比較。

圖4 FAEP與Frap的相關(guān)性分析Fig. 4 The relationship between the fraction available for equilibrium partitioning (FAEP) measured by matrix solid-phase microextraction and the rapidly desorbing fraction (Frap) measured by Tenax extraction

由圖4可知，F(xiàn)AEP與Frap相關(guān)性非常顯著(FAEP=0.50Frap+0.02，r2=0.78，P<0.0001)，這與You等[8]的研究結(jié)果一致(FAEP=0.47Frap+0.02，r2=0.77)，斜率接近且均小于1，說(shuō)明基于Tenax萃取技術(shù)得到的Frap總體上高于基于固相微萃取技術(shù)得到的FAEP值，并且兩者之間存在良好的相關(guān)性，2種技術(shù)都能很好地評(píng)價(jià)底泥中HOCs的生物有效性。由此可知，在評(píng)價(jià)生物有效性上，基于熱力學(xué)平衡的固相微萃取技術(shù)測(cè)定的底泥孔隙水中自由溶解態(tài)濃度反映了相對(duì)較低的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)，有研究證明該技術(shù)可模擬生物吸收污染物的過(guò)程，適用于原位的測(cè)定，可作為一種評(píng)價(jià)現(xiàn)場(chǎng)底泥污染物生物有效性的原位被動(dòng)采樣技術(shù)[8]。但是由于底泥中污染物的平衡時(shí)間通常較長(zhǎng)，且隨著污染物疏水性增強(qiáng)，平衡時(shí)間可達(dá)到數(shù)月，甚至更長(zhǎng)，因此該方法在應(yīng)用上相對(duì)比較耗時(shí)、費(fèi)力。另外，由于部分底棲生物通過(guò)攝取底泥結(jié)合態(tài)污染物而進(jìn)行累積，并通過(guò)各種途徑將有毒物質(zhì)傳遞到食物鏈的上一級(jí)，進(jìn)而影響到相關(guān)水產(chǎn)品質(zhì)量安全和人類健康[15]；因此使用Tenax萃取技術(shù)得到的生物有效性污染物組分在底泥的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)上更加保守，尤其對(duì)濾食性或可以消化底泥的底棲生物所棲息的養(yǎng)殖底泥的環(huán)境質(zhì)量和污染狀況分析及相關(guān)水產(chǎn)品質(zhì)量評(píng)估等方面更具有意義。而Tenax 6 h和24 h單點(diǎn)萃取技術(shù)使其在生物有效性評(píng)價(jià)的應(yīng)用中大大縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間，同時(shí)該方法的樣品、溶劑等使用量耗費(fèi)較少使其在實(shí)驗(yàn)操作上更加簡(jiǎn)單、快捷；因此使用Tenax單點(diǎn)萃取技術(shù)不僅能快速、準(zhǔn)確評(píng)價(jià)和預(yù)測(cè)養(yǎng)殖底泥中HOCs生物有效性和生物累積性，為養(yǎng)殖領(lǐng)域底泥污染管理和科學(xué)修復(fù)提供有力科學(xué)依據(jù)；同時(shí)也能克服大型底棲生物累積實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性和準(zhǔn)確性較差的缺點(diǎn)，并及時(shí)反映養(yǎng)殖底泥中HOCs污染狀況，為相關(guān)水產(chǎn)品的質(zhì)量安全和食用風(fēng)險(xiǎn)提供早期預(yù)警。

綜上可知：

(1)通過(guò)2種雙殼類底棲生物的累積實(shí)驗(yàn)得到，菲律賓蛤仔和河蜆對(duì)9種OCPs的生物-底泥富集因子(BSAF)為0.31～1.89和0.12～2.12；且發(fā)現(xiàn)底泥中OC標(biāo)化的OCPs濃度與生物體內(nèi)脂肪標(biāo)化的OCPs濃度之間相關(guān)性不顯著，說(shuō)明用全底泥監(jiān)測(cè)的方法忽視了底泥中污染物的生物有效性與生物吸收的影響。

(2)Tenax脫附動(dòng)力學(xué)的結(jié)果表明，海水和淡水底泥中OCPs的快速脫附比例(Frap)均在50%左右，說(shuō)明底泥中約有一半的OCPs具有生物有效性，其快速、慢速和極慢速脫附速率常數(shù)數(shù)量級(jí)分別為10-1、10-2和10-4；Tenax快速脫附組分與2種底棲生物累積結(jié)果之間具有顯著的相關(guān)性，表明Tenax萃取技術(shù)可以預(yù)測(cè)OCPs在底棲生物體內(nèi)的累積量，并且該方法克服了大型底棲生物累積實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性和準(zhǔn)確性較差的缺點(diǎn)，使得其在評(píng)價(jià)生物有效性時(shí)更加準(zhǔn)確、有效。

(3)Tenax 6 h和24 h的單點(diǎn)萃取技術(shù)可以代替完整的脫附動(dòng)力學(xué)評(píng)價(jià)生物有效性，F(xiàn)6和F24使得在評(píng)價(jià)上更加簡(jiǎn)單快速而有效。

(4)與基于熱力學(xué)平衡的評(píng)價(jià)生物有效性的方法對(duì)比發(fā)現(xiàn)，Tenax萃取技術(shù)更適用于濾食性或可以消化底泥的底棲生物所棲息的養(yǎng)殖底泥的環(huán)境質(zhì)量和污染狀況分析，并為養(yǎng)殖領(lǐng)域的底泥污染狀況以及相關(guān)水產(chǎn)品的質(zhì)量安全和食用風(fēng)險(xiǎn)提供早期預(yù)警。

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Research on Bioavailability of Sediment-associated Organochlorine Pesticides of Aquaculture Zone Based on Their Desorption Kinetics with Tenax Extraction

Chen Meina, Hu Qian, Xiao Qiang, Liu Yinge, Li Juanying*

Shanghai Collaborative Innovation Center for Aquatic Animal Genetics and Breeding, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China

Received 8 September 2015 accepted 10 October 2015

In the present study, we used two economic benthic organisms Ruditapes philippinarum and Corbicula fluminea to study the bioaccumulation of nine organochlorine pesticides (OCPs) from marine or freshwater sediment with different concentration gradients. In parallel, we applied Tenax-based sequential extraction to assess the desorption kinetics of these OCPs from the tested sediment samples in comparison with their bioaccumulation characteristics in the two model organisms. This approach provided a simple, rapid way to evaluate the bioavailability of these aquaculture sediment-associated chemicals. The results showed that the biota-sediment accumulation factor (BSAF) for Ruditapes philippinarum and Corbicula fluminea were within the range of 0.31-1.89 and 0.12-2.12, respectively. A poor correlation was observed between organic carbon normalized concentrations of OCPs in the sediment studied and the lipid-normalized concentrations of OCPs in organisms. The Tenax desorption kinetics study showed that the rapidly-desorbing fraction (Frap) of OCPs was approximately 50% for both marine and freshwater sediments, and the rate constants for the rapidly-, slowly- and very slowly-desorbing fractions were of the order of magnitude of 10-1, 10-2and 10-4, respectively. The lipid-normalized concentrations of OCPs in the test organisms were significantly correlated with their concentrations of the rapidly-desorbing fraction in Tenax extraction (r2=0.75, P<0.0001), suggesting the predictive power of Tenax-based extraction for the bioaccumulation of OCPs in benthic organisms. This method overcomes the poor reproducibility of conventional bioaccumulation studies using benthic organisms. Compared with themodynamic equilibrium-based predictions, Tenax extraction is more suited to predict the bioaccumulation of sediment-associated chemicals in filter feeders that can ingest sediment particles. 6-h and 24-h Tenax extractions can therefore serve as a simple, rapid altemative to evaluate the bioavailability of hydrophobic organic contaminants in sediment, providing a sound basis for assessing aquatic product safety and human health risks associated with its consumption.

organochlorine pesticides; sediment; economic benthic animal; Tenax extraction; bioavailability

上海海洋大學(xué)科技發(fā)展專項(xiàng)資助(A2-0209-14-200055)；農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(B1-4901-13-000151)

陳美娜(1990—)，女，碩士，研究方向?yàn)榈啄嘀杏袡C(jī)污染物的生物有效性，Email: 915024130@qq.com

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: jyli@shou.edu.cn

10.7524/AJE.1673-5897.20150908001

2015-09-08 錄用日期：2015-10-10

1673-5897(2016)4-079-11

X171.5

A

簡(jiǎn)介：李娟英(1978—)，女，博士，副教授，主要從事底泥中有機(jī)污染物生物有效性研究。

陳美娜, 胡謙, 肖強(qiáng), 等. Tenax萃取技術(shù)用于養(yǎng)殖底泥中有機(jī)氯農(nóng)藥的生物有效性研究[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào)，2016, 11(4): 79-89

Chen M N, Hu Q, Xiao Q, et al. Research on bioavailability of sediment-associated organochlorine pesticides of aquaculture zone based on their desorption kinetics with Tenax extraction [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2016, 11(4): 79-89 (in Chinese)