劉洋，鄒斌，錢(qián)鯤，王亞衡，屠一鋒*

（1.武警總醫(yī)院藥劑科，北京100039；2.蘇州大學(xué)材料與化學(xué)化工學(xué)部，江蘇蘇州215123；3.江蘇宏錦天藥業(yè)有限公司，江蘇泰州225300）

Au/TiO2納米復(fù)合物增強(qiáng)可植入式葡萄糖傳感器

劉洋1，鄒斌2，錢(qián)鯤2，王亞衡3，屠一鋒2*

（1.武警總醫(yī)院藥劑科，北京100039；2.蘇州大學(xué)材料與化學(xué)化工學(xué)部，江蘇蘇州215123；3.江蘇宏錦天藥業(yè)有限公司，江蘇泰州225300）

將Au/TiO2納米復(fù)合材料修飾在針型Pt電極上，用戊二醛作為交聯(lián)劑將葡萄糖氧化酶固定在此修飾電極上，然后在酶電極上以5%Nafion乙醇溶液涂膜形成高分子膜保護(hù)層，制成可植入使用的葡萄糖傳感器。采用三電極體系，考察了該傳感器的檢測(cè)能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該傳感器的檢出限為3.0×10-6mol·L-1，線性范圍為1.0×10-5～1.0× 10-3mol·L-1。研究表明，將納米材料應(yīng)用于葡萄糖傳感器，成功地提高了靈敏度。還考察了影響傳感器酶活性的部分因素。該傳感器作為一種可植入器件的雛形，有望發(fā)展成有實(shí)際應(yīng)用前景的臨床檢測(cè)裝備。

血糖；植入式；傳感器；葡萄糖氧化酶；Au/TiO2納米復(fù)合物

定期血糖監(jiān)測(cè)可以提示糖尿病患者的血糖變化，對(duì)生活規(guī)律、運(yùn)動(dòng)、飲食以及合理用藥都具有重要的指導(dǎo)意義[1-2]。臨床上通常要求每天監(jiān)測(cè)四次（三餐前，睡前）或七次（三餐前，三餐后2 h，睡前）來(lái)了解血糖變化情況，但是因?yàn)闇y(cè)量次數(shù)較多，給病人的正常工作和生活帶來(lái)極大的不便，也并不能真實(shí)地反映患者血糖的波動(dòng)情況，而且頻繁的針刺采血也帶來(lái)較大的感染風(fēng)險(xiǎn)。20世紀(jì)90年代以來(lái)，血糖監(jiān)測(cè)研發(fā)的焦點(diǎn)逐步集中于發(fā)展微創(chuàng)的可植入設(shè)備上[3]，國(guó)外已經(jīng)有可植入式動(dòng)態(tài)血糖傳感器[4]問(wèn)世，并用于血糖的連續(xù)監(jiān)測(cè)控制自動(dòng)胰島素泵。連續(xù)動(dòng)態(tài)血糖檢測(cè)儀可以更好地指導(dǎo)臨床用藥，必將大幅提高糖尿病的治療效果[5]。從病理上說(shuō)，糖尿病本身對(duì)病人生命不產(chǎn)生直接的威脅，只要控制好血糖水平，諸多并發(fā)癥如大血管、微血管受損并危及心、腦、腎、周?chē)窠?jīng)、眼睛、足等得以防止，則糖尿病人的生活質(zhì)量可以得到很好的保證。因此，性能優(yōu)越的并可實(shí)施動(dòng)態(tài)連續(xù)監(jiān)測(cè)的植入式葡萄糖傳感器十分必要。但是，動(dòng)態(tài)血糖檢測(cè)在技術(shù)上還不成熟，仍需利用靜脈或末梢血糖值加以校正[6]，而國(guó)內(nèi)這方面研發(fā)工作則比較缺乏。

現(xiàn)有的血糖傳感器主要是葡萄糖生物傳感器[7]，各種葡萄糖生物傳感器的工作原理大體相仿，基本以葡萄糖氧化酶（GOD）作為生物識(shí)別單元，以電化學(xué)方法檢測(cè)酶催化反應(yīng)生成的H2O2[8]，研究方法與性能上的差異主要在于對(duì)H2O2的檢測(cè)。隨著對(duì)納米材料研究的不斷深入，制備納米金屬氧化物及復(fù)合金屬氧化物粉體技術(shù)不斷發(fā)展和成熟[9]，對(duì)納米材料修飾電極的研究及其應(yīng)用也越來(lái)越受到關(guān)注[10-11]。該研究合成了一種負(fù)載型的Au/TiO2納米復(fù)合物[12]，通過(guò)一系列表征手段證實(shí)Au是以原子簇的形式分布于納米TiO2的表面，該納米復(fù)合物有較好的對(duì)化學(xué)分子氧化還原的催化作用。該研究利用納米復(fù)合材料功能化針形Pt電極，其對(duì)H2O2氧化還原具有良好的促進(jìn)作用，并以此為基礎(chǔ)研制了一種微創(chuàng)的可植入型葡萄糖傳感器。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

納米TiO2（南京海泰納米有限公司，中國(guó)），氯金酸、二水合檸檬酸三鈉、乙醇、氨水、戊二醛、H2O2等均為

分析純?cè)噭▏?guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，中國(guó)）；Nafion（阿法埃莎中國(guó)化學(xué)有限公司，中國(guó)）。葡萄糖氧化酶（GOD，10KU，Sigma，美國(guó)）；牛血清蛋白（BSA，F(xiàn)luka，美國(guó)）；pH＝7.0的NaH2PO4/Na2HPO4緩沖液。實(shí)驗(yàn)用水為超純水。RST600電化學(xué)工作站（蘇州瑞斯特科技有限公司，中國(guó)），測(cè)試系統(tǒng)為三電極體系，針形鉑電極（φ＝0.3 mm）為工作電極，甘汞電極為參比電極，另一支鉑電極為輔助電極。UV-3600 UV-Vis-NIR光譜儀（島津，日本）。

1.2 Au/TiO2納米復(fù)合物及修飾電極的制備

納米復(fù)合材料的制備：取一定量的混晶型納米TiO2粉末于三頸燒瓶中，加入50 mL 1×10-4g·mL-1HAuCl4溶液，在超聲儀中超聲分散5 min。將燒瓶置于130℃油浴中加熱回流并勻速攪拌。當(dāng)燒瓶中混合液完全沸騰時(shí)，迅速沿?zé)勘诩尤胍欢?×10-2g·mL-1檸檬酸鈉溶液，同時(shí)劇烈攪拌，瓶中混合液由乳白色變?yōu)榈仙?。繼續(xù)加熱攪拌15 min后停止，靜置，直至完全冷卻。所制備的復(fù)合納米材料的電子顯微圖像見(jiàn)圖1，可明顯觀察到Au納米顆粒沉積于TiO2顆粒表面。

圖1 材料的透射電鏡圖像

該材料的漫反射紫外可見(jiàn)吸收光譜見(jiàn)圖2，從該圖上可明顯觀察到TiO2的吸收峰發(fā)生了約20 nm的紅移，表明其半導(dǎo)體性能有所改變。一般意義上說(shuō)，吸收光譜發(fā)生紅移對(duì)應(yīng)半導(dǎo)體材料的禁帶寬度減小，從而有更多電子從價(jià)帶躍遷到導(dǎo)帶，不僅使材料的導(dǎo)電性有所提高，而且催化性能也得以增強(qiáng)。

修飾電極制備：將針形鉑電極粗糙處理、清洗干凈并且超聲5 min，干燥后在上述Au/TiO2納米復(fù)合物分散液中采用提拉法均勻蘸滿(mǎn)分散液，置于紅外燈下烘干約2 h。

圖2 材料的漫反射紫外可見(jiàn)吸收光譜

1.3 葡萄糖傳感電極的制備

將20 mg GOD，15 mg BSA，0.5 mL pH＝7的緩沖液攪拌均勻，置于冰箱保存。取0.1 mL上述混合液和0.1 mL 5%戊二醛迅速混合，將Au/TiO2修飾電極浸入混合液中，待溶液蘸滿(mǎn)電極后取出，置于陰涼通風(fēng)處，直至完全風(fēng)干，形成一層含酶的薄膜。然后將此電極浸入5%Nafion乙醇溶液后提出，待其風(fēng)干后形成保護(hù)層。

2 結(jié)果和討論

2.1 Au/TiO2納米復(fù)合物的優(yōu)化及催化性能

納米復(fù)合物中TiO2與Au的質(zhì)量比對(duì)其性能有重要而直接的影響，實(shí)驗(yàn)中通過(guò)調(diào)整HAuCl4和TiO2的投料比改變其最終質(zhì)量比。為得到合成產(chǎn)物中Au的實(shí)際含量，將合成的納米復(fù)合物旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)以除掉溶劑，得到紫色的納米復(fù)合物固體并經(jīng)干燥得到粉末，用少量王水浸泡粉末將復(fù)合物中的Au溶解到王水中，稀釋定容后用原子吸收光譜測(cè)定Au的含量。研究結(jié)果表明，當(dāng)Au和TiO2的質(zhì)量比為1∶170時(shí)，該納米復(fù)合物具有最大的催化活性。檸檬酸鈉作為還原劑和保護(hù)劑，其用量對(duì)氯金酸的還原以及所生成納米金的粒徑大小、分散性，以及與TiO2的相互作用都有重要影響，因此，實(shí)驗(yàn)中對(duì)檸檬酸鈉的使用量進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明2倍于HAuCl4質(zhì)量的檸檬酸鈉可實(shí)現(xiàn)最好的效果。

以上述合成的Au/TiO2納米復(fù)合物修飾針形Pt電極，采用計(jì)時(shí)電流法（設(shè)定電位400 mV）測(cè)定H2O2，結(jié)果見(jiàn)圖3，檢出限可達(dá)到1.0×10-7mol·L-1（裸電極為1×10-6mol·L-1），且所需電位較低（裸電極需700 mV），表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢(shì)。

該納米功能化電極對(duì)H2O2有較為靈敏的響應(yīng)，其原因在于Au/TiO2納米材料的應(yīng)用。如前文述及，在TiO2納米材料表面沉積Au后，減小了禁帶寬度，從而使更多的電子躍遷至導(dǎo)帶，在材料表面存在較多的e/h+對(duì)，對(duì)吸附于材料表面的分子的氧化還原具有顯著的催化作用[13]。而經(jīng)由酶催化反應(yīng)產(chǎn)生的H2O2即在納米材料的催化下發(fā)生快速的氧化還原反應(yīng)，因此，得到較大的響應(yīng)電流。

2.2 酶電極的響應(yīng)特性

以該酶電極測(cè)定葡萄糖，從計(jì)時(shí)電流曲線（圖4）可以明確得到隨葡萄糖的加入而產(chǎn)生的電流變化，該響應(yīng)具有良好的線性，其線性回歸方程為：i（μA）＝0.02+0.009Cglucose（μmol·L-1），線性相關(guān)系數(shù)r＝0.999，該傳感器的響應(yīng)線性范圍為1.0×10-5～1.0×10-3mol·L-1，檢出下限為3.0× 10-6mol·L-1。

圖3 Au/TiO2修飾電極上H2O2的計(jì)時(shí)電流響應(yīng)

2.3 傳感器活性的影響因素

考慮該傳感器未來(lái)主要用于在體的血糖連續(xù)監(jiān)測(cè)，研究中考察了可能影響傳感器活性的因素，對(duì)于人類(lèi)而言，正常的飲食不會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)生理成分的大幅度變化，而唯有大量飲酒可能導(dǎo)致體液內(nèi)乙醇濃度的較大幅升高，因此，重點(diǎn)考察了乙醇對(duì)傳感器活性的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖4 傳感器對(duì)葡萄糖的計(jì)時(shí)電流響應(yīng)

圖5 乙醇對(duì)傳感器活性的影響

由圖5可知，高濃度乙醇確實(shí)會(huì)導(dǎo)致酶的失活從而使傳感器完全失效。但這種失效發(fā)生在高濃度乙醇高溫長(zhǎng)時(shí)間處理?xiàng)l件下，正常人體條件完全不可能出現(xiàn)這種情況，這預(yù)示該傳感器有較好的活性保持能力，筆者認(rèn)為這應(yīng)該得益于保護(hù)膜的應(yīng)用。Nafion?是聚四氟乙烯（Teflon?）和全氟-3，6-二環(huán)氧-4-甲基-7-癸烯-硫酸的共聚物[14]，Nafion的主要作用是靠膜內(nèi)部親水性的離子化磺酸基聚集溶劑分子，以提供親水性的生物相容的界面和空間。Nafion十分穩(wěn)定，一般情況下不會(huì)發(fā)生任何化學(xué)變化，熱穩(wěn)定性高達(dá)160℃，因而可以提供合適的微環(huán)境保護(hù)酶的活性。

3 結(jié)語(yǔ)

基于Au/TiO2納米復(fù)合物膜構(gòu)建的葡萄糖傳感器的檢出限為3.0×10-6mol·L-1，線性范圍為1.0×10-5～1.0× 10-3mol·L-1。一般情況下，血液中的葡萄糖濃度在1～25 mmol·L-1范圍內(nèi)，該研究開(kāi)發(fā)的傳感器是預(yù)期植入皮下組織中進(jìn)行葡萄糖檢測(cè)，而皮下組織中的葡萄糖濃度較血液中為低，故可認(rèn)為該傳感器具有實(shí)際應(yīng)用的可能。同時(shí)，研發(fā)該傳感器應(yīng)用的是φ＝0.3 mm的針形Pt電極，這是考慮了皮膚組織的痛覺(jué)閾值，目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)如此小尺寸的葡萄糖傳感器的研究報(bào)道。由于該傳感器的研發(fā)目標(biāo)是植入式動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，目前尚不具備進(jìn)行實(shí)際人體檢測(cè)應(yīng)用的條件。

[1]中華醫(yī)學(xué)會(huì)糖尿病學(xué)分會(huì).中國(guó)血糖監(jiān)測(cè)臨床應(yīng)用指南（2015年版）[J].中華糖尿病雜志，2015，7（10）:603-613.

[2]中華醫(yī)學(xué)會(huì)糖尿病學(xué)分會(huì).糖尿病的現(xiàn)狀、流行趨勢(shì)與危害性[R].北京：衛(wèi)生部疾病控制司，2011.

[3]侯憲全，任湘菱，唐芳瓊，等.納米ZnO增強(qiáng)葡萄糖生物傳感器的制備和應(yīng)用[J].分析化學(xué)，2006，34（3）：303-306.

[4]佚名.新型植入式無(wú)線血糖傳感器[J].生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)進(jìn)展，2010，31（3）：168.

[5]劉劍，劉紅敏，楊慶德，等.利用電化學(xué)生物傳感器進(jìn)行無(wú)創(chuàng)血糖檢測(cè)技術(shù)研究[J].傳感技術(shù)學(xué)報(bào)，2007，20（12）：2535-2539.

[6]UPDIKE S J，HICKS G P.The enzyme electrode[J].Nature，1967，214：986-988.

[7]魏吟秋.葡萄糖生物傳感器研究概況[J].醫(yī)藥前沿，2012，21：84-85.

[8]許淑芬，鄭展望，徐甦.國(guó)內(nèi)外液相過(guò)氧化氫的測(cè)定方法及其進(jìn)展[J].中國(guó)安全科學(xué)學(xué)報(bào)，2007，3：166-170.

[9]李風(fēng)生，楊毅，馬振葉，等.納米功能復(fù)合材料及應(yīng)用[M].北京：國(guó)防工業(yè)出版社，2003.

[10]任湘菱，唐芳瓊.超細(xì)銀-金復(fù)合顆粒增強(qiáng)酶生物傳感器的研究[J].化學(xué)學(xué)報(bào)，2002，60（3）：393-397.

[11]岳波，茍立，冉均國(guó)，等.金納米顆粒增強(qiáng)一次性使用葡萄糖傳感器的響應(yīng)性能[J].化工進(jìn)展，2005，24（4）：387-390.

[12]YU Z M，WEIX H，YAN J L，et al.Intensification of electrochemiluminescence of luminol on TiO2supported Au atomic cluster nano-hybrid modified electrode[J].Analyst，2012，137（8）：1922-1929.

[13]KWON B G.Characterization of the hydroperoxyl/superoxide anion radical（HO2*/O2*-）formed from the photolysis of immobilized TiO2in a continuous flow[J].J Photochem Photobio A：Chemistry，2008，199：112-118.

[14]MAURITZ K A，MOORE R B.State of understanding of Nafion[J].Chemical Reviews，2004，104（10）：4535-4585.

An Au/TiO2nanocomposite enhanced biosensor for embedding glucose monitoring

LIU Yang1，ZOU Bin2，QIAN Kun2，WANG Yaheng3，TU Yifeng2
（1.Department of Pharmacy，General Hospital of Armed Police Forces，Beijing 100039，China；2.College of Chemistry，Chemical Engineering and Material Science，Soochow University，Suzhou 215123，China；3.Jiangsu Hongjintian Pharmaceutical Co.Ltd.，Taizhou 225300，China）

Based on the modification of Au/TiO2nanocomposites on a Pt needle electrode，we fixed the glucose oxidase on it by BSA and glutaraldehyde as the cross-linker.A glucose biosensor was fabricated by coating with 5%Nafion to act as a polymer preserving layer.The resulted embeddable glucose biosensor was tested for evaluation of its detection performance.The experimental results show that the linear range of this biosensor is 1.0×10-5to 1.0×10-3mol·L-1with a detection limit of 3.0×10-6mol·L-1.The sensitivity of this needle sensor is promoted by nanomaterials.In addition，the factors affecting the enzyme activity of this biosensor were discussed.As a prototype for implantable usage，the resultant sensor is promising used as a clinical assay device.

blood glucose；embedment；biosensor；glucose oxidase；Au/TiO2nanocomposite

O657.1

A

1672－0687（2016）04－0048－04

責(zé)任編輯：李文杰

2016－04－05

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（21375091）

劉洋（1974-），女，副主任藥師，碩士，研究方向：藥物制劑與臨床藥學(xué)。

*通信聯(lián)系人：屠一鋒（1963-），男，教授，博士，博士生導(dǎo)師，E-mail：tuyf@suda.edu.cn。