袁淑杰，丁輝，姜媛媛，夏吾炯*

（1.哈爾濱工業(yè)大學(xué)化工與化學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150001；2.哈藥集團(tuán)技術(shù)中心，哈爾濱 150025）

VPK合成、活性及吸收轉(zhuǎn)運(yùn)特性研究

袁淑杰1，丁輝2，姜媛媛2，夏吾炯1*

（1.哈爾濱工業(yè)大學(xué)化工與化學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150001；2.哈藥集團(tuán)技術(shù)中心，哈爾濱 150025）

候選新藥VPK是哈藥集團(tuán)技術(shù)中心自主研發(fā)治療腦卒中的一類新藥。VPK以長(zhǎng)春西汀為母核，經(jīng)水解、縮合、環(huán)化、成鹽反應(yīng)制備而成，經(jīng)元素分析、核磁共振、高分辨質(zhì)譜、X-射線粉末衍生，X-射線單晶衍射對(duì)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證，經(jīng)PDE1活性研究顯示，VPK和長(zhǎng)春西汀均對(duì)PDE1有抑制作用，其IC50值分別為17.40和1.97 μmol·L-1，VPK在腦卒中治療領(lǐng)域療效較好，采用Caco-2單層細(xì)胞模型測(cè)定候選藥物VPK吸收及外排轉(zhuǎn)運(yùn)特性，結(jié)果表明，VPK在頂端到基底端（A-B）及基底端到頂端（B-A）方向均表現(xiàn)高滲透，該供試化合物是外排轉(zhuǎn)運(yùn)體底物可能性較小。

VPK；結(jié)構(gòu)確證；PDE1；Caco-2細(xì)胞模型；吸收；轉(zhuǎn)運(yùn)；UPLC/MS/MS

袁淑杰,丁輝,姜媛媛,等.VPK合成、活性及吸收轉(zhuǎn)運(yùn)特性研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2016,47(10):25-33.

Yuan Shujie,Ding Hui,Jiang Yuanyuan,et al.Study on the synthesis and activity of VPK and on its absorption and transportation characteristics[J].Journal of Northeast Agricultural University,2016,47(10):25-33.(in Chinese with English abstract)

長(zhǎng)春西?。╒inpocetine）是從夾竹桃科小蔓長(zhǎng)春花中提取的吲哚類生物堿長(zhǎng)春胺經(jīng)結(jié)構(gòu)改造所得的衍生物[1-3]，具有較高脂溶性，易通過(guò)血腦屏障形成較高濃度而發(fā)揮療效。長(zhǎng)春西汀不僅能選擇性增加患者腦血流量，改善血液流變學(xué)參數(shù)，同時(shí)還可增加大腦神經(jīng)元對(duì)缺氧缺血耐受性[4-6]，主要治療腦血管等相關(guān)疾病，包括缺血性及出血性腦血管疾病恢復(fù)期和急性期，血管性癡呆，認(rèn)知功能障礙等[7-8]。雖然長(zhǎng)春西汀已得到廣泛應(yīng)用，但仍存在如水溶性較差，口服片劑的生物利用度低，代謝穩(wěn)定性差，容易被水解成活性較低的酸等問(wèn)題。因此，為提高生物利用度和血腦屏障透過(guò)率，延長(zhǎng)半衰期，哈藥集團(tuán)技術(shù)中心在長(zhǎng)春西汀結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)合成一系列長(zhǎng)春西汀類衍生物。通過(guò)前期的活性和成藥性篩選，獲得候選新藥VPK（見(jiàn)圖1），有望在腦卒中治療領(lǐng)域獲得更好的治療效果。

Caco-2細(xì)胞單層模型是一種廣泛用于研究小腸吸收的模型[9-11]，可在細(xì)胞水平提供藥物分子透過(guò)小腸粘膜吸收、分布及轉(zhuǎn)運(yùn)等綜合信息，與口服藥物的體內(nèi)小腸上皮細(xì)胞吸收過(guò)程相關(guān)性良好。Caco-2細(xì)胞系來(lái)自人體結(jié)腸腺癌細(xì)胞（The human colon carcinoma cell line），形態(tài)學(xué)、標(biāo)志酶功能表達(dá)與滲透特征與小腸類似。利用Caco-2細(xì)胞單層模型，分析候選藥物吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)特性，可初步判斷給藥途徑。

李謙等研究候選藥物TW918在Caco-2細(xì)胞模型中的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)特性及作用機(jī)制[12]，考查時(shí)間、pH及抑制劑等對(duì)TW918吸收影響，測(cè)定藥物在不同轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間雙向轉(zhuǎn)運(yùn)速度，計(jì)算TW918表觀滲透系數(shù)；徐小昆等建立體外Caco-2細(xì)胞模型，考查新補(bǔ)骨脂異黃酮的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制[13]；楊秀偉等利用Caco-2細(xì)胞模型研究羥基芍藥苷等6個(gè)芍藥苷類單萜糖苷吸收及雙向轉(zhuǎn)運(yùn)[14]。目前，Caco-2細(xì)胞單層模型已成為新藥研發(fā)中評(píng)價(jià)藥物口服吸收最有效方法[15-17]。

建立Caco-2細(xì)胞單層模型，研究候選新藥VPK吸收轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程，測(cè)定穿過(guò)Caco-2細(xì)胞模型的雙向滲透性，測(cè)試該化合物是否被外排轉(zhuǎn)運(yùn)，預(yù)測(cè)藥物吸收，為制劑研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)，為安全、有效臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

1.1.1 活性檢測(cè)用試劑

①反應(yīng)緩沖液：10 mmol·L-1Tris-HCl，pH 7.5，5 mmol·L-1氯化鎂，0.01%Brij35，1 mmol·L-1DTT和1%DMSO；

②酶底物：1 mol·L-1cAMP或cGMP（Ca2+-鈣調(diào)蛋白作為PDE1A的輔助因子）；

③檢測(cè)試劑Transcreener?AMP2/GMP2抗體；AMP2/GMP2 AlexaFluor 633標(biāo)記物（Life technolo?gy，美國(guó)）。

1.1.2 Caco-2細(xì)胞吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)用試劑

VPK供試品（批號(hào)201408301，含量98.81%），由哈藥集團(tuán)技術(shù)中心研制；對(duì)照化合物阿替洛爾、普萘洛爾、地高辛及內(nèi)標(biāo)甲苯磺丁脲購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；MEM培養(yǎng)基、Trypsin、EDTA、胎牛血清（FBS）購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；L-谷氨酰胺、丙酮酸鈉購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)；青霉素-鏈霉素雙抗購(gòu)自美國(guó)HyClone公司；P-糖蛋白抑制劑Elacridar（GF120918A）購(gòu)自加拿大TRC公司。

1.2 Caco-2細(xì)胞吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)用細(xì)胞株

人結(jié)腸腺癌細(xì)胞系Caco-2細(xì)胞（產(chǎn)品編號(hào)：HTB-37）購(gòu)自美國(guó)模式菌種收集中心（ATCC）。

1.3 儀器

1.3.1 合成及結(jié)構(gòu)解析用儀器

玻璃反應(yīng)瓶（5 L、3 L）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海耀裕儀器設(shè)備有限公司；元素分析儀（Vario ELⅢ，Elementar）；飛行時(shí)間液質(zhì)聯(lián)用儀（G6224A，安捷倫）；核磁共振譜儀（AV400，Bruker）；X射線衍射儀（Bruker D8 Advance）；X-射線單晶衍射儀（Bruker APEX-ⅡCCD）。

1.3.2Caco-2細(xì)胞吸收及轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)用儀器

96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（BD Inc.#359274）；純水儀（PURELAB Classic，ELGA，英國(guó)）；生物安全柜（NU-425-400E，NuAir ClassⅡ；美國(guó)）；液體處理工作站（PP-550DS,Apricot Designs Inc.,CA）；恒溫培養(yǎng)箱（Thermo HERA Cell 240,美國(guó)）；M2e讀板儀（Molecular Device，澳大利亞）；Waters Aquity UPLC超高效液相色譜儀；API 4000三重四級(jí)桿質(zhì)譜（美國(guó)AB Sciex公司）

1.4 Caco-2細(xì)胞吸收及轉(zhuǎn)運(yùn)分析條件

1.4.1 液相色譜條件

色譜柱為Acquity UPLC BEH C18,1.7 μm，2.1× 50 mm色譜柱；以含0.2%甲酸的水溶液為流動(dòng)相A；以含0.2%甲酸的乙腈溶液為流動(dòng)相B；進(jìn)樣體積：10 μL，流速0.6 mL·min-1，梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 液相梯度洗脫程序Table 1Procedure of liquid chromatography gradient elution

1.4.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI源）；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)；正離子模式；氣簾氣壓力20 kPa，霧化器壓力50 kPa，加熱輔助氣壓力60 kPa，電噴霧電壓5.5 kV，霧化器溫度600℃，入口電壓10 V，碰撞室出口電壓15 V。

1.5 方法

1.5.1 合成方法

圖2 VPK合成路線Fig.2Synthetic route of VPK

VPK合成路線見(jiàn)圖2。

1.5.1.1 水解反應(yīng)

分別將起始物料長(zhǎng)春西汀酯500 g、水1 L，二氧六環(huán)4 L加入反應(yīng)瓶，并加入NaOH 1.5 kg，在20～30℃溫度下攪拌反應(yīng)16 h，經(jīng)過(guò)濾、干燥得中間體1。

1.5.1.2 縮合反應(yīng)

將中間體1 200 g、二氯甲烷1.8 kg和DMF 1.8 g分別加入反應(yīng)瓶，攪拌，調(diào)節(jié)溫度至（5±5）℃。將草酰氯200 g加入反應(yīng)瓶，在（10±10）℃條件下攪拌2 h，濃縮反應(yīng)液，然后加入二氯甲烷1 L，得到阿樸長(zhǎng)春胺酰氯二氯甲烷溶液。將DIEA 200 g、N-羥基乙脒50 g和二氯甲烷140 mL分別加入反應(yīng)瓶，降溫；將阿樸長(zhǎng)春胺酰氯二氯甲烷溶液滴入反應(yīng)瓶，攪拌30 min。加入水700 mL，分液，有機(jī)層用飽和食鹽水700 mL洗滌，用無(wú)水硫酸鈉干燥，并濃縮濾液。在攪拌條件下，向所得濃縮物中加入正庚烷5.1 L，繼續(xù)攪拌20～30 min后，過(guò)濾、干燥即得中間體2 459 g，收率為80%～90%。

1.5.1.3 環(huán)化反應(yīng)

將中間體2 218 g、三水合四丁基氟化銨130.8 g和異丁醇2.1 L分別加入反應(yīng)瓶，升溫至85～100℃，攪拌4～5 h。降溫至50～60℃，轉(zhuǎn)移至旋蒸瓶，在40～45℃減壓濃縮；濃縮物中加入水2 L，在15～20℃攪拌0.5～1 h后過(guò)濾，收集濾餅，得到的固體在45～50℃真空干燥16 h。烘干后的固體轉(zhuǎn)移到反應(yīng)瓶，加入無(wú)水乙醇1.4 L和水450 mL，升溫至85～95℃，攪拌20～30 min，熱過(guò)濾，濾液靜置析晶，抽濾所得固體在45～50℃下真空干燥4 h，得中間體3 125 g，收率為55%～65%。

1.5.1.4 成鹽反應(yīng)

在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將中間體3 111 g、無(wú)水檸檬酸66.6 g和無(wú)水乙醇1.7 L分別加入反應(yīng)瓶，升溫至（90±5）℃，攪拌0.5～1 h；降溫至（25±5）℃，過(guò)濾，濾餅在45～50℃真空干燥，得目標(biāo)產(chǎn)品153 g，收率為85%～95%，純度達(dá)99.8%。

1.5.1.5 結(jié)構(gòu)確證

得到產(chǎn)品VPK經(jīng)元素分析、核磁共振、高分辨質(zhì)譜、X-射線粉末衍生和X-射線單晶衍射，確認(rèn)化合物結(jié)構(gòu)。

1.5.2 PDE1活性研究方法

用新鮮配制的反應(yīng)緩沖液稀釋待測(cè)人源酶（購(gòu)自Signal Chem）和底物；將酶溶液（濃度3 pmol·L-1）加入反應(yīng)板孔；用Echo550將若干100%DMSO化合物溶液，按所需濃度加入含酶溶液微孔板，室溫孵育10 min；加底物溶液至含酶和化合物溶液微孔板，起始反應(yīng)；室溫孵育1 h，同時(shí)震蕩微孔板；加入檢測(cè)混合物（示蹤和抗體中的終止緩沖液）使酶反應(yīng)停止，室溫孵育90 min，同時(shí)震蕩微孔板；用設(shè)備EnVision（PerkinElmer），Cy5 FP Ex FP 620，Em S-pol 688/P-pol 688，F(xiàn)P mirror D658 fp/ D688檢測(cè)，用Ex/Em 620/688檢測(cè)熒光偏振。

1.5.3 Caco-2細(xì)胞單層模型吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)方法

1.5.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞培養(yǎng)使用添加2 mmol·L-1L-谷氨酰胺，10%胎牛血清（FBS），100 U·mL-1青霉素-G以及100 mg·mL-1鏈霉素的MEM（Minimum essential media）培養(yǎng)基。細(xì)胞培養(yǎng)條件為37℃，5%CO2和95%相對(duì)濕度。待細(xì)胞長(zhǎng)至80%～90%密集度，加入胰酶（0.05%,W/V）/EDTA（0.02%,W/V）消化液消化細(xì)胞種板。本試驗(yàn)采用第46代Caco-2細(xì)胞，將細(xì)胞以1×105細(xì)胞·cm-2密度接種Transwell-96孔板，并置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)22 d，期間每4～5 d更換1次培養(yǎng)基。

1.5.3.2 評(píng)估Caco-2細(xì)胞單層完整性

采用熒光黃外排試驗(yàn)（The lucifer yellow rejec?tion assay）測(cè)試Caco-2細(xì)胞層完整性。從頂端和基底端取熒光黃樣品，采用M2e讀板儀在425/528 nm（激發(fā)/發(fā)射）波譜處檢測(cè)其相對(duì)熒光強(qiáng)度（RFU）。輕輕拍打，棄去細(xì)胞板內(nèi)剩余溶液，加入含內(nèi)標(biāo)的乙腈溶液裂解細(xì)胞，輕輕振搖5 min后收集細(xì)胞裂解液。所有樣品漩渦震蕩后于20℃離心20 min，取上清用超純水稀釋儲(chǔ)存于4℃，超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC/MS/MS）分析測(cè)試。

1.5.3.3 雙向轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)

去除培養(yǎng)板中培養(yǎng)基，用預(yù)熱轉(zhuǎn)運(yùn)緩沖液將細(xì)胞潤(rùn)洗2遍。將給藥液和接收液分別加入對(duì)應(yīng)的細(xì)胞板孔位，開(kāi)始雙向轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)：頂端到基底端（A-B）和基底端到頂端（B-A）。將細(xì)胞板置于37℃，5%CO2和95%相對(duì)濕度條件下孵育120 min。

對(duì)于T0樣品，取起始的給藥液與轉(zhuǎn)運(yùn)緩沖液和含內(nèi)標(biāo)的乙腈溶液按一定比例混合。孵育120 min后，從給藥端和接收端收集最終樣品，同樣與轉(zhuǎn)運(yùn)緩沖液和含內(nèi)標(biāo)的乙腈溶液按一定比例混合。

1.5.3.4 樣品分析及數(shù)據(jù)處理

用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC/MS/MS）方法測(cè)定樣品中VPK和對(duì)照化合物阿替洛爾（Atenolol）、普萘洛爾（Propranolol）及地高辛（Digoxin）濃度。

通過(guò)Analyst軟件（版本號(hào)1.4.2）（AB Sciex, Framingham,MA,USA）采集和處理數(shù)據(jù)。以VPK與內(nèi)標(biāo)甲苯磺丁脲的峰面積比值對(duì)VPK濃度（nM）作線性回歸分析。對(duì)于對(duì)照化合物地高辛，阿替洛爾和普萘洛爾，采用半定量分析方法，使用峰面積比（PAR）計(jì)算表觀滲透系數(shù)（Papp,cm·s-1）和回收率數(shù)據(jù)。

表觀滲透系數(shù)（Papp,cm·s-1）、回收率數(shù)據(jù)及外

排率數(shù)據(jù)使用如下公式計(jì)算。

式中，VR為接收孔中溶液體積（A面為0.075 mL，B面為0.25 mL）；Area為細(xì)胞單層的相對(duì)表面積（0.0804 cm2）；Time為孵育時(shí)間（s）；C0為給藥孔中藥物起始濃度（μmol·L-1）；VD為給藥端體積（A面為0.075 mL，B面為0.25 mL）；CD和CR分別為給藥端和接收端最終濃度，Clysate為細(xì)胞裂解液中化合物濃度（μmol·L-1），VA為細(xì)胞裂解液體積（該試驗(yàn)中為0.075 mL）。

熒光黃透過(guò)率用以=下公式計(jì)算：

熒光黃透過(guò)率(%)

2 結(jié)果與分析

2.1 候選新藥VPK合成

以長(zhǎng)春西汀為起始原料，經(jīng)水解、縮合、環(huán)化、成鹽反應(yīng)成功制備合成候選新藥VPK，收率為85%～95%，純度達(dá)99.8%。合成的VPK經(jīng)元素組成分析、核磁共振、高分辨質(zhì)譜、X-射線粉末衍射、X-射線單晶衍射確認(rèn)結(jié)構(gòu)。

2.1.1 藥物元素組成

元素組成測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表2，測(cè)定結(jié)果表明C、H、N含量實(shí)測(cè)值與理論值之差均＜0.3%，元素組成與VPK樣品分子式C22H24N4O·C6H8O7一致。

表2 VPK樣品的元素組成測(cè)定結(jié)果Table 2Results of tests on the element composition of VPK

2.1.2 核磁共振（NMR）

測(cè)試溶劑為：氘代甲醇，溫度為300 K。VPK

化合物編位見(jiàn)圖3。氫譜測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

圖3 VPK化合物編位Fig.3Numbering of positions of the compound VPK

表3 VPK樣品氫譜測(cè)定結(jié)果Table 3Results of the HNMR of VPK

2.1.3 高分辨質(zhì)譜

本品[M+H]+峰質(zhì)荷比計(jì)算值為361.2023，實(shí)測(cè)值為361.2024，相對(duì)誤差為0.28，考慮到誤差、不飽和度和分子組成的合理性，其對(duì)應(yīng)分子組成應(yīng)為C22H25N4O+；因此，本品分子組成應(yīng)為C22H24N4O，與VPK樣品游離堿分子組成一致。

2.1.4 X-射線粉末衍射

VPK的X-射線粉末衍射測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知，本品為結(jié)晶性粉末。

2.1.5 X-射線單晶衍射

VPK的游離堿測(cè)定X-射線單晶衍射，結(jié)果見(jiàn)圖5～6。

由圖5～6可知，本品分子式為C22H24N4O，相對(duì)分子質(zhì)量為360.45，與樣品游離堿的分子組成一致?？梢?jiàn)本品分子結(jié)構(gòu)圖與樣品游離堿結(jié)構(gòu)相符。通過(guò)其晶體結(jié)構(gòu)可以確定樣品游離堿2個(gè)手性中心絕對(duì)構(gòu)型，其立體結(jié)構(gòu)41S，13aS。

2.2 PDE1活性研究

用DMSO作對(duì)照在AMP/GMP標(biāo)準(zhǔn)曲線上找出FP信號(hào)相對(duì)應(yīng)酶活性，并轉(zhuǎn)換成nmol·L-1產(chǎn)物濃度。使用GraphPad Prism分析并計(jì)算IC50值。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。結(jié)果表明，VPK和長(zhǎng)春西汀對(duì)磷酸二酯酶均具有抑制作用，VPK對(duì)PDE1抑制作用是長(zhǎng)春西汀8倍以上。

圖4 VPK的X-射線粉末衍射測(cè)定結(jié)果Fig.4X-ray powder diffraction results of VPK

圖5 VPK游離堿晶體結(jié)構(gòu)橢球圖Fig.5Rystal structure ORTEP of VPK free alkali

圖6 VPK游離堿沿a軸晶胞堆積Fig.6Unit cell stacked plot of the VPK free alkali along axis a

表4 PDE1檢測(cè)IC50測(cè)試結(jié)果Table 4IC50value of PDE1 detection

2.3 Caco-2細(xì)胞單層模型的吸收及轉(zhuǎn)運(yùn)

2.3.1 Caco-2完整性評(píng)價(jià)

熒光黃漏出標(biāo)志物的跨膜通量作為測(cè)定Caco-2細(xì)胞模型的細(xì)胞完整性評(píng)價(jià)指標(biāo)[18-20]，熒光黃外排試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。

表5結(jié)果表明，熒光黃透過(guò)率均＜1%，符合可接受標(biāo)準(zhǔn)，Caco-2細(xì)胞層完整性良好。

表5 熒光黃外排試驗(yàn)結(jié)果Table 5Resultsof Lucifer Yellow rejection assay

2.3.2 細(xì)胞功能特性評(píng)價(jià)

對(duì)照化合物和供試化合物的滲透性見(jiàn)表6。作為通過(guò)細(xì)胞旁路途徑滲透的標(biāo)記物，阿替洛爾通常表現(xiàn)低滲透性，該試驗(yàn)中阿替洛爾的平均表觀滲透系數(shù)（Papp（A-B））為0.24×10-6cm·s-1。作為被動(dòng)跨細(xì)胞滲透的標(biāo)記物，普萘洛爾通常表現(xiàn)出高滲透性，該試驗(yàn)中普萘洛爾平均表觀滲透系數(shù)（Papp（A-B））為24.68×10-6cm·s-1。作為外排轉(zhuǎn)運(yùn)標(biāo)記物，地高辛通常表現(xiàn)較高外排率（Efflux ratio,ER），該試驗(yàn)中不加GF120918A（一種熟知的外排轉(zhuǎn)運(yùn)子抑制劑，如抑制P糖蛋白P-gp）時(shí)，地高辛平均表觀滲透系數(shù)Papp（A-B）和Papp（B-A）值分別為0.02和8.05×10-6cm·s-1，外排率為502.55。加入GF120918A后，地高辛外排率降低至1.10。因此本

研究所用的Caco-2細(xì)胞功能特性合格。

表6 對(duì)照化合物和供試化合物滲透性Table 6Permeability of control compound and test compound

2.3.3 候選新藥VPK的雙向通透性及外排

未添加GF120918A，在給藥濃度為0.5、2和10 μmol·L-1時(shí)，VPK在A到B方向的表觀滲透常數(shù)分別為12.84、14.20和11.79×10-6cm·s-1；在B到A方向表觀滲透常數(shù)分別為6.82、7.66和7.45× 10-6cm·s-1；3個(gè)給藥濃度外排率REa分別為0.53、0.54和0.63（均＜2）。因此未觀察到明顯外排轉(zhuǎn)運(yùn)現(xiàn)象。VPK是外排轉(zhuǎn)運(yùn)體底物的可能性較小。

加入GF120918A，在給藥濃度為0.5、2和10 μmol·L-1時(shí)，VPK在A到B方向表觀滲透常數(shù)分別為13.93、14.16和13.53×10-6cm·s-1；在B到A方向表觀滲透常數(shù)分別為7.96、8.23和7.65×10-6cm·s-1；3個(gè)給藥濃度下外排率REi的數(shù)值分別為0.57、0.58和0.57。因此REa/REi值分別為0.93、0.93和1.11。

VPK在不同濃度，無(wú)論是否加入GF120918A樣品溶液回收率82.19%～98.81%，總回收率87.43%～99.27%?？偦厥章蔬_(dá)70%及以上為最佳，本試驗(yàn)中VPK在不同試驗(yàn)條件下均表現(xiàn)充足回收率。

綜上所述，VPK在測(cè)試濃度為0.5、2和10 μmol·L-1時(shí)，在Caco-2細(xì)胞中表現(xiàn)高滲透性，該供試化合物是外排轉(zhuǎn)運(yùn)體底物的可能性較小。

3 討論與結(jié)論

我國(guó)腦卒中發(fā)病率和致殘率較高。長(zhǎng)春西汀因?qū)Π悬c(diǎn)磷酸二酯酶PDE1具有抑制作用，抑制cGMP水解，調(diào)節(jié)cGMP/cAMP平衡，雙向調(diào)節(jié)血管張力，治療腦卒中[21-22]。但長(zhǎng)春西汀溶解度差，片劑生物利用度較低?；谀X卒中治療現(xiàn)狀及現(xiàn)有藥物治療效果不佳，本研究以長(zhǎng)春西汀為母核，設(shè)計(jì)合成新型長(zhǎng)春西汀衍生物VPK。通過(guò)與長(zhǎng)春西汀對(duì)比，VPK具有更強(qiáng)的PDE1抑制作用，對(duì)腦卒中治療效果應(yīng)更好。

藥物透過(guò)腸道壁的滲透性可用以評(píng)價(jià)藥物在腸道的吸收情況，與此同時(shí)，腸壁細(xì)胞內(nèi)側(cè)存在藥物外排泵，將已攝入細(xì)胞內(nèi)的藥物外排，對(duì)藥物吸收和生物利用度產(chǎn)生影響[9,23]?；贑aco-2細(xì)胞單層模型，研究候選新藥VPK的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)特性，在有或無(wú)P-糖蛋白抑制劑GF-120918A情況下，VPK雙向給藥，給藥濃度為0.5、2和10 μmol·L-1。孵育120 min后，收集頂端、基底端和細(xì)胞裂解樣品，采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC/MS/MS）檢測(cè)供試化合物在樣品中含量。采用熒光黃檢測(cè)細(xì)胞單層完整性。結(jié)果顯示，熒光黃和對(duì)照化合物的數(shù)據(jù)均符合可接受試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，表明該研究的測(cè)試系統(tǒng)功能完好。未添加GF120918A，在0.5、2及10 μmol·L-1給藥濃度下，VPK在頂端到基底端（AB）方向表現(xiàn)出高滲透性（Papp＞2.5×10-6cm·s-1，Papp為表觀滲透系數(shù)），其表觀滲透系數(shù)分別為12.84、14.20及11.79×10-6cm·s-1，基底端到頂端（B-A）方向表觀滲透系數(shù)為6.82、7.66以及7.45× 10-6cm·s-1。相應(yīng)地，在0.5、2以及10 μmol·L-1給藥濃度下，VPK外排率均＜2，分別為0.53、0.54及0.63，未觀察到明顯外排現(xiàn)象。加入GF-120918A時(shí)，VPK在頂端到基底端（A-B）方向表觀滲透系數(shù)分別為13.93、14.16以及13.53×10-6cm· s-1，相應(yīng)基底端到頂端（B-A）方向?yàn)?.96、8.23以及7.65×10-6cm·s-1。VPK外排率ER為0.57、0.58和0.57。綜上所述，VPK在測(cè)試濃度為0.5、2和10 μmol·L-1時(shí)，在Caco-2細(xì)胞中表現(xiàn)高滲透性，該供試化合物是外排轉(zhuǎn)運(yùn)體底物的可能性較小。候選新藥的高滲透性及非外排轉(zhuǎn)運(yùn)底物的特性表明，VPK具有良好的口服吸收和生物利用度，制劑開(kāi)發(fā)難度較小。

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Study on the synthesis and activity of VPK and on its absorption and transportation characteristics

YUAN Shujie1,DING Hui2,JIANG Yuanyuan2,XIA Wujiong1

(1.School of Chemistry and Chemical Engineering,Harbin Institute of Technology,Harbin 150001,China;2.Technology Center of Harbin Pharmaceutical Group,Harbin 150025,China)

The candidate drug VPK was category 1 of chemical drugs for stroke which was selfdeveloped by Technology Center of Harbin Pharmaceutical Group.VPK was with vinpocetine as the mother nucleus and was obtained by reactions of hydrolysis,condensation,cyclization and salt-forming reaction. The structure of the compound was confirmed by elemental analysis,NMR,HRMS,X-ray powder diffraction, X-ray single crystal diffraction.Study based on the activity of PDE1 showed that both VPK and vinpocetine had inhibitory effects on PDE1,with the values of IC50at 17.40 and 1.97 μmol·L-1,respectively,suggesting that VPK had better effect in the treatment of stroke.The characteristics of absorption and efflux transportation of candidate drug VPK was determined with Caco-2 single-layer cell model and the results had shown that VPK showed high permeability both in the apical-basal(A-B)direction and in the basal-apical (B-A)direction.There was little chance that the test compound was the substrate for efflux transporter,or it was not the substrate for efflux transporter.

VPK;structural confirmation;PDE1;Caco-2 cell model;absorption;transportation;UPLC/ MS/MS

TQ460.7+2

A

1005-9369（2016）10-0025-09

時(shí)間2016-10-26 16:28:00[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20161026.1628.006.html

2016-08-31

黑龍江省抗腫瘤藥物研制工程技術(shù)研究中心計(jì)劃任務(wù)項(xiàng)目（GZ2013-45）

袁淑杰（1962-），女，研究員級(jí)高級(jí)工程師，博士研究生，研究方向?yàn)榛瘜W(xué)工程與技術(shù)。E-mail:yuan_yjy@163.com

*通訊作者：夏吾炯，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橛袡C(jī)合成（包括藥物合成）和光化學(xué)反應(yīng)。E-mail:xiawj@hit.edu.cn