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        石墨烯量子點(diǎn)-銀納米顆粒復(fù)合物用于過氧化氫和葡萄糖比色檢測

        2016-12-01 08:59:14陳旭偉王建華
        分析化學(xué) 2016年1期
        關(guān)鍵詞:檢測

        夏 暢 海 欣 陳 帥 陳旭偉* 王建華*

        (東北大學(xué)理學(xué)院分析科學(xué)研究中心1,生命科學(xué)與健康學(xué)院2,沈陽 110819)

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        石墨烯量子點(diǎn)-銀納米顆粒復(fù)合物用于過氧化氫和葡萄糖比色檢測

        夏 暢1海 欣1陳 帥2陳旭偉*1王建華*1

        (東北大學(xué)理學(xué)院分析科學(xué)研究中心1,生命科學(xué)與健康學(xué)院2,沈陽 110819)

        以石墨烯量子點(diǎn)(GQDs)為還原劑和穩(wěn)定劑,在其表面原位生長銀納米粒子(AgNPs),制備了具有良好分散性的GQDs/AgNPs納米復(fù)合物,其粒徑小于30 nm。GQDs/AgNPs納米復(fù)合物具有類過氧化物酶的催化活性,能有效催化H2O2氧化3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)并發(fā)生顯色反應(yīng)。穩(wěn)態(tài)動力學(xué)分析表明,GQDs/AgNPs催化動力學(xué)遵循典型的Michaelis-Menten模型,其催化機(jī)理符合乒乓機(jī)制。與辣根過氧化物酶(HRP)相比,GQDs/AgNPs納米復(fù)合物具有更強(qiáng)的親和性?;贕QDs/AgNPs的催化活性和葡萄糖氧化產(chǎn)生H2O2的原理,建立了H2O2和葡萄糖的比色檢測方法,檢出限分別為0.18和1.6 μmol/L。將本方法應(yīng)用于血漿中葡萄糖的檢測分析,結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)方法相符。

        石墨烯量子點(diǎn)-銀納米粒子復(fù)合物; 類過氧化物酶; 過氧化氫; 葡萄糖

        1 引 言

        銀納米粒子(AgNPs)是一種重要的納米材料,在催化、電子和抗菌等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。但由于AgNPs易氧化和發(fā)生聚集,因此在實際分析應(yīng)用中一般需加入穩(wěn)定劑(如聚合物、有機(jī)小分子和納米顆粒等)使其穩(wěn)定存在[1]。

        氧化石墨烯(GO)具有優(yōu)良的電子、機(jī)械和化學(xué)性能,已成為構(gòu)建GO-貴金屬新型復(fù)合材料中廣受歡迎的基本構(gòu)件。這些GO-貴金屬材料在催化[2]、表面拉曼掃描[3]、抗菌[4]、電子運(yùn)輸[5]、制氫[6]、光學(xué)和化學(xué)傳感器[7,8]等領(lǐng)域均表現(xiàn)出優(yōu)良的性能。在一步光化學(xué)反應(yīng)制備的GO/AgNPs復(fù)合物中,AgNPs在GO表面均勻分布,在無外加穩(wěn)定劑的條件下,GO/AgNPs溶液呈現(xiàn)出良好的分散性及穩(wěn)定性[9,10]。

        石墨烯量子點(diǎn)(GQDs)是尺寸小于100 nm的零維石墨烯納米片,其量子限域和邊界效應(yīng)帶來的優(yōu)良熒光性能使其在光電子器件、光伏和光發(fā)射器件、生物成像、傳感和電化學(xué)催化等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用[11~13]。本研究以GQDs為還原劑,發(fā)展了一種在GQDs表面原位生長AgNPs顆粒的新方法,進(jìn)而得到GQDs/AgNPs納米復(fù)合物。GQDs在充當(dāng)還原劑的同時,對原位生長的AgNPs表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定作用。此納米復(fù)合物在H2O2氧化3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)產(chǎn)生顯色反應(yīng)的過程中呈現(xiàn)優(yōu)良的催化活性,據(jù)此構(gòu)建了一種簡單、快速的H2O2和葡萄糖定量檢測分析方法。

        2 實驗部分

        2.1 儀器與試劑

        H-7650型透射電子顯微鏡(TEM),工作電壓為80 kV; U-3900紫外可見分光光度計(日本日立公司); LabRAM XploRA全自動顯微拉曼光譜儀(法國HORIBA JOBIN YVON公司)。

        石墨粉(南京先鋒納米材料科技有限公司);葡萄糖(Glu)、葡萄糖氧化酶(GOx)、AgNO3、H2O2等(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。除特別標(biāo)注外,所有試劑皆為分析純,實驗用水為二次去離子水(18 MΩ cm)。

        2.2 GQDs/AgNPs的制備

        2.2.1 GQDs的制備 首先根據(jù)文獻(xiàn)[14]的方法制備GO, 具體過程如下:將10.0 g石墨粉、10.0 g K2S2O8和10.0 g P2O5混勻后,加入30 mL濃H2SO4,80℃反應(yīng)6 h。冷卻至室溫后用去離子水洗滌至中性,60℃真空干燥, 得到預(yù)氧化石墨。

        取25 mg GO分散于5 mL去離子水中,與20 mL HNO3(65%,V/V)混合后轉(zhuǎn)移至聚四氟乙烯密封罐中,200℃微波消解5 min。冷卻后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去未反應(yīng)的酸,用NaHCO3中和至中性,再用0.22 μm濾膜過濾,收集濾液透析處理(500~1000 MW CO),得到GQDs。

        2.2.2 GQDs/AgNPs納米復(fù)合物的制備 將0.5 mg/mL GQDs (100 mL)溶液以氨水調(diào)節(jié)至中性,并超聲20 min。將濃氨水逐滴滴加到1 mL 50 mg/mL AgNO3溶液中,至溶液恰好澄清為止,得到銀氨溶液。將上述兩種溶液混合,100℃磁力攪拌油浴回流反應(yīng)1 h,最終得到紅棕色GQDs/AgNPs水溶液。

        為進(jìn)行性能比較,研究中以0.5 mg/mL GO溶液取代GQDs溶液,按上述過程制備了GO/AgNPs納米復(fù)合物。

        2.3 比色法測定H2O2和葡萄糖

        將340 μL HAc-NaAc緩沖液(pH 4.0),100 μL H2O2溶液,12 μL TMB溶液(25 mmol/L)和50 μL GQDs/AgNPs溶液(250 μg/mL)混和搖勻,室溫下渦旋振蕩反應(yīng)40 min,在652 nm波長處測定溶液吸光度。

        葡萄糖檢測時,在葡萄糖樣品溶液中加入100 μL GOx,37℃條件下水浴反應(yīng)30 min。后續(xù)檢測過程與H2O2檢測相同。

        3 結(jié)果與討論

        3.1 GQDs/AgNPs納米復(fù)合物的制備與表征

        圖1 GQDs和GQDs/AgNPs納米復(fù)合物的透射電鏡照片F(xiàn)ig.1 Transmission electron microscopic (TEM) images of graphene quantum dots(GQDs)(A) and GQDs/AgNPs nanocomposites (B)

        圖1A為GQDs的透射電鏡圖,粒徑統(tǒng)計顯示GQDs的平均粒徑為2~7 nm,與文獻(xiàn)[14]報導(dǎo)方法的結(jié)果相符。圖1B為原位生長AgNPs后的GQDs/AgNPs納米復(fù)合物的透射電鏡結(jié)果,可以觀察到在GQDs表面原位生成了黑色的AgNPs,插圖為GQDs/AgNPs的高分辨透射電鏡照片,可以清晰地看到AgNPs的晶格結(jié)構(gòu),晶格間距為0.19 nm,對應(yīng)Ag納米晶的200晶面[16]。粒徑分布統(tǒng)計結(jié)果表明,GQDs/AgNPs納米復(fù)合物的粒徑范圍為8~30 nm,比GQDs的粒徑大,這是因為在GQDs表面生長了一層AgNPs納米粒子所致。

        圖2A是GQDs原位生長AgNPs前后的紫外-可見吸收光譜。GQDs在230 nm處有最大吸收,對應(yīng)芳香環(huán)sp2雜化的π-π*躍遷。而GQDs/AgNPs納米復(fù)合材料除230 nm處的吸收峰外,在403 nm處出現(xiàn)新的吸收峰,為AgNPs的表面等離子體共振特征吸收峰[16],說明AgNPs成功原位生長于GQDs表面。

        由GQDs和GQDs/AgNPs納米復(fù)合物的X射線光電子能譜(XPS)全圖分析結(jié)果(圖2B)可以看到,GQDs和GQDs/AgNPs譜圖中均有位于284 eV處的C1s峰和532 eV處的O1s峰,但GQD/AgNPs在370 eV附近出現(xiàn)了Ag的特征能譜峰。從Ag3d的高分辨譜圖(圖2C)可以看出,GQDs/AgNPs納米復(fù)合物中Ag的特征峰分別位于368和374 eV處,對應(yīng)Ag的3d5/2和3d3/2。這兩個峰差值為6.0 eV,與金屬形態(tài)銀的兩峰理論差值相符[17]。

        圖2 GQDs和GQDs/AgNPs納米復(fù)合物的紫外-可見吸收光譜 (A),X射線光電子能譜 (B),Ag3d X射線光電子能譜(C)和拉曼光譜圖 (D)Fig.2 UV-vis spectra (A), X-ray photoelectronic spectroscopic (XPS) spectra (B), Ag3d XPS spectra (C) and Raman spectra (D) of GQDs and GQDs/AgNPs nanocomposites

        3.2 GQDs/AgNPs的催化活性

        圖3 TMB溶液(25 mmol/L)在652 nm處的吸光度-時間曲線Fig.3 Time-dependent absorbance of 3,3′,5,5′-tetra-methylbiphenyl (TMB) solution (25 mmol/L) at 652 nmH2O2濃度: 0.5 mmol/L; GO/AgNPs和 GQDs/AgNPs濃度: 250 μg/mL。Concentration of H2O2: 0.5 mmol/L; Concentrations of GO/AgNPs and GQDs/AgNPs: 250 μg/mL.

        以過氧化物酶底物TMB為顯色底物,H2O2為氧化底物,GQDs/AgNPs為催化劑,通過監(jiān)測體系中TMB氧化物在652 nm處的吸光度,考察GQDs/AgNPs納米復(fù)合物的類過氧化物酶的催化特性;同時,考察GO/AgNPs的催化特性,并進(jìn)行性能比較。GO/AgNPs和GQDs/AgNPs均可催化H2O2氧化TMB產(chǎn)生經(jīng)典的顯色反應(yīng),其氧化產(chǎn)物顯藍(lán)色,在652 nm處有一個特征吸收峰。GO/AgNPs和GQDs/AgNPs均表現(xiàn)出快速的顏色響應(yīng),這是因為石墨烯材料的芳香平面結(jié)構(gòu)和表面羧基基團(tuán)使其具有較強(qiáng)的類過氧化物酶活性[18]。但在強(qiáng)酸條件下,由GO割裂形成GQDs時,其邊緣形成了更加豐富的羧基基團(tuán),GQDs因而呈現(xiàn)出更強(qiáng)的類過氧化物酶活性,故GODs/AgNPs在催化氧化TMB時,表現(xiàn)出更靈敏的催化氧化效果,在同樣條件下得到更高的響應(yīng)信號,如圖3所示。

        催化反應(yīng)體系的pH值和反應(yīng)溫度對酶催化活性產(chǎn)生決定性影響,本研究對這些影響因素進(jìn)行了詳細(xì)考察,結(jié)果如圖4。當(dāng)溫度高于25℃時,GQDs/AgNPs的類過氧化物酶活性隨溫度升高而略有下降。在pH 2~4范圍內(nèi),GQDs/AgNPs的催化性能隨pH值增大而增強(qiáng),但pH 4~6時,隨著pH增大,其催化性能急劇降低,并在pH 6時完全失去催化作用。其原因可能是pH過大導(dǎo)致H2O2加速分解。后續(xù)研究中選擇pH 4.0的HAc-NaAc緩沖液在25℃下進(jìn)行反應(yīng)。

        圖4 反應(yīng)溫度(A)和pH值(B)對GQDs/AgNPs納米復(fù)合物催化性能的影響Fig.4 Effect of reaction temperature (A) and pH (B) on catalytic performance of GQDs/AgNPs nanocompositesConcentration of H2O2: 0.5 mmol/L; Concentration of GQDs/AgNPs: 250 μg/mL.

        為分析GQDs/AgNPs的催化機(jī)理,分別通過改變體系中TMB和H2O2濃度測定了顯色反應(yīng)的穩(wěn)態(tài)動力學(xué)參數(shù)。由圖5A和5B可知,GQDs/AgNPs納米復(fù)合物催化反應(yīng)遵循典型酶催化反應(yīng)歷程即Michaelis-Menten動力學(xué)模型。利用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)方程1/V=Km/Vmax(1/[S]+1/Km)計算得到GQDs/AgNPs催化反應(yīng)的最大反應(yīng)速率Vmax和米氏常數(shù)Km, 如表1所示。GQDs/AgNPs對底物TMB和H2O2的Km與其它報道的類過氧化物酶納米材料相當(dāng),但均遠(yuǎn)小于HRP。由于米氏常數(shù)Km可反映酶與底物之間的親和性能,Km值越大,親和能力越弱,反之亦然。上述結(jié)果說明GQDs/AgNPs對TMB和H2O2的親和力較強(qiáng)。

        表1 GQDs/AgNPs納米復(fù)合物與其它材料的催化性能比較

        Table 1 Comparison of the kinetic parameters of GQDs/AgNPs nanocomposites and other materials

        催化物Catalyst反應(yīng)底物Substance米氏常數(shù)Km(mmol/L)最大反應(yīng)速率Vmax(10-8molL-1s-1)參考文獻(xiàn)Ref.石墨烯量子點(diǎn)/銀納米粒子GQDs/AgNPsTMB0.0916H2O20.275819本方法ThisworkFe3O4磁性納米粒子Fe3O4MNPsTMB0.0983.44H2O21549.78[19]多壁碳納米管MWCNTsTMB0.077±0.0323.04±0.65H2O233.1±5.60.56±0.12[20]辣根過氧化物酶HRPTMB0.43410H2O23.78.7[19]

        圖5C和5D為不同TMB和H2O2濃度時得到的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線。GQDs/AgNPs催化底物H2O2(TMB)顯色反應(yīng)的3條雙倒數(shù)曲線基本平行。這表明以H2O2(TMB)為底物時,改變TMB(H2O2)濃度,Lineweaver-Burk雙倒數(shù)的斜率基本不發(fā)生變化,只有截距隨著TMB(H2O2)濃度的增大而減小。GQDs/AgNPs納米復(fù)合物的催化反應(yīng)符合乒乓機(jī)理[21],即GQDs/AgNPs先與第一種底物結(jié)合并發(fā)生反應(yīng),且在第二種底物反應(yīng)之前釋放出第一種底物。

        圖5 GQDs/AgNPs納米復(fù)合物的穩(wěn)態(tài)動力學(xué)分析。A, B:米氏模型;C, D:賴氏模型Fig.5 Steady-state kinetic analysis using Michaelis-Menten model (A, B) and Lineweaver-Burk model (C, D) for GQDs/AgNPs nanocompositesA: TMB固定為0.6 mmol/L,變化H2O2濃度。B: H2O2固定為1.0 mmol/L,變化TMB濃度。 C: TMB 濃度分別0.2, 0.4和0.6 mmol/L,變化H2O2濃度。D: H2O2濃度分別為0.5, 1.0和1.5 mmol/L, 變化TMB濃度。A:Fixing the concentration of TMB at 0.6 mmol/L while varying the concentration of H2O2. B: Fixing the concentration of H2O2 at 1.0 mmol/L while varying the concentration of TMB. C: Fixing the concentration of TMB at 0.2, 0.4 and 0.6 mmol/L, while varying the concentration of H2O2. D: Fixing the concentration of H2O2 at 0.5, 1.0 and 1.5 mmol/L, while varying the concentration of TMB.

        3.3 分析應(yīng)用

        基于GQDs/AgNPs納米復(fù)合物的類過氧化物酶催化性質(zhì),建立了簡單的H2O2比色定量分析方法。由圖6A可見,反應(yīng)生成的藍(lán)色產(chǎn)物的顏色隨H2O2濃度的增大而加深。在最優(yōu)實驗條件下,H2O2檢測分析的線性曲線如圖6B所示,在H2O2濃度0.5~100 μmol/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系,檢出限為0.18 μmol/L。表2列出了一些納米粒子作為類過氧化物酶在H2O2檢測的分析性能,可以看到,GQDs/AgNPs納米復(fù)合物的檢測性能較為優(yōu)良,同時相較于單一的N-GQDs體系而言,GQDs/AgNPs納米復(fù)合物由于表面AgNPs的原位生成,導(dǎo)致其類過氧化物酶活性更強(qiáng),因而對H2O2表現(xiàn)更高的檢測靈敏度。

        基于GOx能夠催化葡萄糖產(chǎn)生H2O2,本方法也可用于對葡萄糖的分析檢測。圖7A為葡萄糖定量分析的標(biāo)準(zhǔn)曲線,在6~200 μmol/L范圍內(nèi),葡萄糖濃度與吸光度具有良好的線性關(guān)系,檢出限為1.6 μmol/L。圖7B表明葡萄糖濃度為0.2 mmol/L時,2 mmol/L果糖(Fru)、乳糖(Lac)、蔗糖(Sac)、纖維二糖(Cel)和麥芽糖(Mal)對葡萄糖測定的干擾情況。由于GOx酶催化的專一性,本方法對葡萄糖的檢測具有良好的選擇性。

        圖6 不同H2O2濃度條件下形成的反應(yīng)產(chǎn)物(A)和測定H2O2的線性曲線(B)Fig.6 Photograph of colored products at different H2O2 concentrations(A) and linear calibration plots for H2O2 detection(B)

        表2 H2O2檢測性能比較

        Table 2 Comparisons of performances in H2O2detection

        納米顆粒復(fù)合物Nanocomposite線性范圍Linearrange(μmol/L)檢出限LOD(μmol/L)參考文獻(xiàn)Ref.Fe3O4磁性納米粒子Fe3O4MNPs-3.0[19]N摻雜石墨烯量子點(diǎn)N-GQDs20~11705.3[22]還原氧化石墨烯-四氧化三鈷ReducedGO-Co3O40.5~1000.5[23]氧化石墨烯-四氧化三鐵GO/Fe3O41~500.32[24]石墨烯-氧化鈷鐵G/CoFe2O42~1000.3[25]石墨烯量子點(diǎn)/銀納米粒子GQDs/AgNPs0.5~1000.18本方法Thiswork

        圖7 葡萄糖測定的線性回歸曲線(A)和選擇性能(B)Fig.7 Linear calibration plot (A) and selectivity investigations (B) for glucose detectionFru: 果糖,Lac: 乳糖,Sac: 蔗糖,Cel: 纖維二糖,Mal: 麥芽糖。Fru: fructose, Lac: lactose, Sac: saccharose, Cel: cellobiose, Mal: maltose.

        將本方法用于人體血清樣品中葡萄糖含量的分析測定,結(jié)果見表3,測定結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)方法的測定結(jié)果一致,說明本方法能夠應(yīng)用于實際樣品中葡萄糖的檢測分析。

        4 結(jié) 論

        以石墨烯量子點(diǎn)(GQDs)為還原劑和穩(wěn)定劑,在其表面原位生長銀納米粒子(AgNPs),制備了GQDs/AgNPs納米復(fù)合物。GQDs/AgNPs具有優(yōu)良的類過氧化物酶催化活性,能夠快速催化H2O2氧化TMB顯色,其催化動力學(xué)遵循Michaelis-Menten動力學(xué)模型,催化機(jī)理符合乒乓機(jī)制。GQDs表面和邊緣豐富的羧基基團(tuán),使GQDs/AgNPs較GO/AgNPs具有更強(qiáng)的催化性能?;贕QDs/AgNPs的酶催化活性建立了H2O2和葡萄糖的比色檢測方法,可成功用于血樣中葡萄糖的測定。GQDs表面原位生長納米粒子的方法不僅為納米粒子的穩(wěn)定制備提供了一種有效方案,并為進(jìn)一步拓展GQDs的應(yīng)用范疇和調(diào)控其光學(xué)性能提供了新思路。

        表3 人體血清樣品中葡萄糖含量的測定結(jié)果

        Table 3 Determination results for glucose in human serum samples

        樣品Sample本方法Thismethoda(mmol/L±SD,n=3)參考方法Officialmethodb(mmol/L)血清1Serum14.45±0.064.73血清2Serum24.90±0.114.94血清3Serum35.16±0.145.15a血清稀釋200倍后進(jìn)行葡萄糖測定;b該結(jié)果由東北大學(xué)醫(yī)院采用光譜法測定所得。a.Bloodsampleswerediluted200-foldforglucosedetermination;b.There-sultswereprovidedbytheHospitalofNortheasternUniversitywithdetectionbyspectrophotometry

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        (Received 16 July 2015; accepted 13 August 2015)

        This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (Nos. 21275027, 21235001, 21475017)

        Preparation of Graphene Quantum Dots/Ag Nanoparticles Nanocomposites for Colorimetric Detection of H2O2and Glucose

        XIA Chang1, HAI Xin1, CHEN Shuai2, CHEN Xu-Wei*1, WANG Jian-Hua*1

        1(ResearchCenterforAnalyticalSciences,CollegeofSciences,NortheasternUniversity,Shenyang110819,China)2(CollegeofLifeandHealthScience,NortheasternUniversity,Shenyang110819,China)

        Graphene quantum dots/Ag nanoparticles nanocomposite (GQDs/AgNPs) was prepared via in-situ growth of AgNPs on the surface of GQDs, in which GQDs served as both reducing agent and stabilizer. The as-prepared nanocomposites were mono-dispersed with an average diameter of less than 30 nm. The obtained GQDs@AgNPs nanocomposites exhibited excellent intrinsic peroxidese-like activity, which could catalyze the oxidization of 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) by H2O2to produce a colour product. Steady-state kinetic assays showed that the catalytic activity of GQDs/AgNPs towards H2O2fitted well with typical Michaelis-Menten kinetic model, followed by the ping-pong mechanism. Compared with the horseradish peroxidase (HRP), GQDs/AgNPs showed higher affinity towards TMB and H2O2substrate. Based on the intrinsic peroxidese-like activity of GQDs/AgNPs nanocomposites and the production of H2O2after the oxidation of glucose, a colorimetric method was developed for the detection of H2O2and glucose, along with detection limit of 0.18 μmol/L and 1.6 μmol/L, respectively. The present method was applied to the detection of glucose in human serum, and the obtained results agreed with that obtained by reference method.

        Graphene quantum dots/Ag nanopartides nanocomposite; Peroxidase-like activity; Hydrogen peroxide; Glucose

        10.11895/j.issn.0253-3820.150568

        本文系國家自然科學(xué)基金項目(Nos.21275027, 21235001, 21475017)資助

        2015-07-16收稿;2015-08-13接受

        * E-mail: jianhuajrz@mail.neu.edu.cn

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