田彩彥 丁薛璐 尹金維 段憶翔*,3

(四川大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院1, 分析儀器研究中心2，生物資源與生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室3，成都 610064)

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微型輝光放電等離子體用于質(zhì)譜成像分析的初步研究

田彩彥1,2丁薛璐1,2尹金維1,2段憶翔*1,2,3

(四川大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院1, 分析儀器研究中心2，生物資源與生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室3，成都 610064)

本實(shí)驗(yàn)利用實(shí)驗(yàn)室自主研發(fā)的微型輝光放電等離子體(MFGDP)作為離子源解吸樣品，使之離子化，得到樣品的特征質(zhì)譜圖，經(jīng)特定軟件的轉(zhuǎn)化即可得到對(duì)應(yīng)的圖像，圖像表明，MFGDP用于質(zhì)譜成像具有可行性。本方法具有裝置簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)易、等離子體羽低溫、分析時(shí)間短(<20 min)等優(yōu)點(diǎn)，可同時(shí)定位樣品中不同物質(zhì)的空間分布。本研究探討了影響質(zhì)譜成像圖清晰度的因素，優(yōu)化了實(shí)驗(yàn)條件，在最優(yōu)條件下，本方法的空間分辨率約300 μm，對(duì)加有尿素的不同字跡進(jìn)行初步質(zhì)譜分析，并對(duì)冬棗切片中硬脂酸和槲皮素衍生物的空間分布做了影像探索。此技術(shù)可以根據(jù)化學(xué)物質(zhì)的“指紋圖譜”區(qū)分不同的字跡, 也能夠很好地獲取樣品中不同營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的分布狀況，因此, 為字畫研究、藝術(shù)品鑒定、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)分布圖的獲取提供了一種新的方法。

微型輝光放電等離子體； 質(zhì)譜； 掃描； 成像

1 引 言

質(zhì)譜成像是一種分子成像技術(shù)，但是它不同于需要熒光標(biāo)記的激光共振聚焦、放射自顯影、免疫沉淀等方法，這種方法無需額外標(biāo)記或分子印染過程就能獲得獨(dú)特、精確的圖像，它使成像不局限于某些特異分子，而是面向大多數(shù)分子。經(jīng)過幾十年的發(fā)展，質(zhì)譜成像已成為法醫(yī)、食品分析、地質(zhì)檢測(cè)[1～4]等相關(guān)領(lǐng)域的重要分析手段，近年來，該技術(shù)廣泛應(yīng)用于生物組織及臨床研究[5～7]，并取得了較好的成果。質(zhì)譜成像是將樣品的空間信息與其化學(xué)信息一一對(duì)應(yīng)，可以對(duì)樣品x，y二維或x，y，z三維方向順次掃描，由此獲得對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，然后用不同的顏色代表不同組分的空間分布，并通過相關(guān)的軟件按其空間位置做出質(zhì)譜影像圖。

目前，用于質(zhì)譜成像的技術(shù)根據(jù)其工作條件和解吸機(jī)制的不同，主要分為以下幾類：(1)在真空條件下的基質(zhì)輔助激光解吸電離(Matrix assisted laser desorption ionization, MALDI)質(zhì)譜成像技術(shù)[8]、二次離子質(zhì)譜(Secondary ion mass spectrometry, SIMS)[9]等技術(shù)；(2)常壓下基于噴霧的電離技術(shù), 如解吸電噴霧電離(Desorption electrospray ionization, DESI)[10]、探針電噴霧電離(Probe electrospray ionization, PESI)[11]等技術(shù)；(3)基于激光電離技術(shù)，如激光燒蝕電噴霧離子化(Laser ablation electrospray ionization, LAESI)[12]、紅外激光消融亞穩(wěn)誘導(dǎo)化學(xué)離子化 (Infrared laser ablation metastable-induced chemical ionization，IR-LAMICI)[13]等技術(shù)；(4)基于等離子體的電離技術(shù)，如低溫等離子體探針(Low temperature probe, LTP)技術(shù)[14]、解吸大氣壓化學(xué)電離(Desorption atmospheric pressure chemical ionization, DAPCI)[15]等。近年來，隨著醫(yī)學(xué)診斷、地質(zhì)檢測(cè)等相關(guān)領(lǐng)域的需要，質(zhì)譜成像技術(shù)越來越受到人們的關(guān)注，尤其是常壓開源質(zhì)譜成像，該技術(shù)主要用于分析分子量低于2000 Da的分子，空間分辨率通常為幾十到幾百微米[16～18]?；诘入x子體的離子化技術(shù)由于其本身的限制，用于質(zhì)譜成像的還較少。由于本實(shí)驗(yàn)室研發(fā)的微型輝光放電等離子體離子源(MFGDP)[19]具有無污染、高靈敏度、特異性強(qiáng)、高通量等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)又是尺寸小、低溫的等離子體，因而在質(zhì)譜成像方面具有巨大的潛能，基于此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)MFGDP作為離子源用于成像分析作了初步的探索研究，通過對(duì)加有尿素的鋼筆墨跡以及冬棗切片的掃描，得到了字跡的具體輪廓和切片中不同營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)硬脂酸和槲皮素衍生物的質(zhì)譜影像圖，并取得了較好的結(jié)果，因而為字畫研究、藝術(shù)品鑒定、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)分布圖的獲取提供了一種新方法。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器、試劑與材料

LCQ-Fleet型離子阱質(zhì)譜儀(Thermo Fisher, San Jose, CA)，配置Xcalibur (Version 1.4RS1)工作站；載物臺(tái)、2維電控位移臺(tái)及步進(jìn)電機(jī)控制器(北京卓立漢光儀器有限公司)；直流穩(wěn)壓電源(揚(yáng)州雙鴻電子有限公司)；質(zhì)量流量控制器(北京七星電子有限公司)；MFGDP離子源(實(shí)驗(yàn)室自主研發(fā))。

碳素鋼筆墨水與冬棗均從當(dāng)?shù)厣痰曩?gòu)得；分析純的尿素購(gòu)自于上海生工公司；普通氬氣(99.9%)由僑源氣體公司提供。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 樣品制備 配含有70 μg/mL尿素的碳素鋼筆墨水溶液，將鋼筆字跡“3”寫于陶瓷片，字跡的掃描面積為14 mm×12 mm；用刀片切下約0.5 mm厚的帶果皮的冬棗切片，并將切片置于干凈的載玻片上直接進(jìn)行成像分析。

2.2.2 MFGDP的參數(shù)及工作條件 MFGDP離子源本體結(jié)構(gòu)參數(shù)見原報(bào)道[19,20]。工作條件：維持MFGDP離子源的穩(wěn)定放電電壓為1520 V，電流11 mA，氬氣流速0.8 L/min；等離子氣出口端距電動(dòng)平移臺(tái)上的樣品約6 mm；離子源與質(zhì)譜儀進(jìn)樣口距離為約1 cm；樣品與質(zhì)譜儀進(jìn)樣口平齊；MFGDP-MSI的實(shí)際工作情況如圖1所示；電動(dòng)位移臺(tái)的移動(dòng)速度、移動(dòng)順序均由步進(jìn)電機(jī)控制。

圖1 MFGDP-質(zhì)譜成像的工作狀態(tài)Fig.1 Work state of microfabricated glow discharge plasma (MFGDP) mass spectrometry imaging

2.2.3 質(zhì)譜條件 MFGDP直接與一臺(tái)去掉廠方配置離子源的LCQ-Fleet型離子阱質(zhì)譜儀聯(lián)用，進(jìn)行質(zhì)譜分析檢測(cè)。 在正、負(fù)離子模式下均關(guān)閉質(zhì)譜儀的自動(dòng)增益(ACG)。 質(zhì)譜儀參數(shù)如下：毛細(xì)管溫度200℃； 毛細(xì)管電壓9.5 V； Tube lens 29 V； Multipole RF DAC 320 V； 最大離子注射時(shí)間50 ms； 微掃描次數(shù)(Microscan)3； 其余參數(shù)均為質(zhì)譜儀的自動(dòng)調(diào)諧值。

2.2.4 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)分析時(shí)將質(zhì)譜儀得到的原始raw文件先用imzML Converter軟件轉(zhuǎn)化為imzML文件，再通過Datacube Explorer獲得最終的質(zhì)譜影像圖。

3 結(jié)果與討論

3.1 質(zhì)譜成像的可行性評(píng)估

為了驗(yàn)證MFGDP離子源用于質(zhì)譜成像的實(shí)用性，本實(shí)驗(yàn)對(duì)含有70 μg/mL尿素的鋼筆墨跡進(jìn)行了一系列對(duì)比分析。對(duì)鋼筆寫下的“3”字進(jìn)行質(zhì)譜成像分析，圖像的掃描面積為14 mm×12 mm，單個(gè)像素點(diǎn)的尺寸為144 μm×150 μm，以尿素的質(zhì)子化分子離子峰m/z61作為檢測(cè)對(duì)象，對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜圖、質(zhì)譜成像圖和實(shí)際樣品圖如圖2所示。

圖2 (a)含有70 μg/mL尿素的墨跡對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜圖； (b)墨跡“3”的質(zhì)譜成像圖，vx=0.3 mm/s, dy=0.15 mm，掃描方向?yàn)閺挠业阶螅瑥南轮辽希?(c)墨跡“3”的實(shí)際圖Fig.2 (a) Mass spectrum of ink marks added 70 μg/mL urea; (b) Mass spectrometry imaging of the mark of "3", the speed in horizontal direction is vx=0.3 mm/s, the vertical interval is 0.15 mm, the scan direction is from right to left, from bottom to up; (c) Photograph of the "3"

結(jié)果表明，質(zhì)譜成像圖中尿素的二維離子分布輪廓圖與實(shí)際圖中分布基本一致，但在質(zhì)譜圖能觀察到較為明顯的明暗條紋，這可能是由于采用較小的行距引起，其影響因素還需進(jìn)一步考察并驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)可以表明MFGDP離子源用于質(zhì)譜成像具有實(shí)用性，能夠提供目標(biāo)分子在樣品中的分布信息及其相對(duì)豐度。

3.2 MFGDP-MSI的條件優(yōu)化

與其它的等離子體常壓解吸源測(cè)試樣品一樣，用MFGDP離子源直接掃描樣品時(shí)儀器工作參數(shù)的設(shè)定會(huì)直接影響質(zhì)譜信號(hào)的強(qiáng)弱，進(jìn)而影響成像的質(zhì)量。為了優(yōu)化實(shí)驗(yàn)參數(shù)，繼續(xù)對(duì)含有70 μg/mL尿素的鋼筆字跡進(jìn)行對(duì)比分析，在MFGDP離子源本身結(jié)構(gòu)參數(shù)確定的條件下，MFGDP離子源工作電流、工作氣的流速、樣品與等離子體羽尾端之間的距離、樣品與質(zhì)譜儀入口之間的距離、等離子體羽的長(zhǎng)短、電動(dòng)位移臺(tái)的移動(dòng)速率、縱向間隔都會(huì)影響MFGDP-MSI的分辨率。本實(shí)驗(yàn)中MFGDP離子源工作電流、工作氣的流速、樣品與等離子體羽之間的距離、樣品與質(zhì)譜儀入口之間的距離、等離子體羽的長(zhǎng)短都采用了MFGDP離子源做質(zhì)譜分析時(shí)的最優(yōu)條件[19]，通過對(duì)影響質(zhì)譜信號(hào)的其它參數(shù)的優(yōu)化，選擇了最優(yōu)體系，結(jié)果表明，電動(dòng)位移臺(tái)的移動(dòng)速率、縱向間隔對(duì)圖案的輪廓清晰度以及縱向分辨率的影響最大。通過初步研究探索，確定電動(dòng)位移臺(tái)的最佳水平移動(dòng)速率為0.3 mm/s，縱向間隔dy為0.4 mm。由最佳條件下鋼筆墨跡“A”的影像圖(圖3)可見，影像圖與實(shí)際圖的輪廓一致，且清晰度較高。

圖3 (a)墨跡“A”的質(zhì)譜成像圖和(b)墨跡“A”的照片, 掃描方向?yàn)閺挠业阶螅瑥南轮辽螰ig.3 (a) mass spectrometry imagng of the "A" and (b) Photograph of the "A", the scan direction from right to left, from bottom to up. The speed in horizontal direction vx=0.3 mm/s, the vertical interval 0.4 mm

3.3 實(shí)際樣品分析

以冬棗切片為分析對(duì)象，研究不同營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)硬脂酸和槲皮素在棗內(nèi)的分布情況。用刀片切下厚約0.5 mm的帶果皮的冬棗切片，并置于干凈的載玻片上直接掃描，掃描面積12 mm×11.2 mm，在最佳條件下，掃描總時(shí)間不超過20 min。圖4為冬棗切片的實(shí)際樣品圖、以硬脂酸和槲皮素為目標(biāo)離子的質(zhì)譜成像圖。從圖4可見，整個(gè)冬棗切片中都含有硬脂酸，但主要分布于果肉中，而槲皮素主要以其衍生物的形式多存在于果皮中。

圖4 (a)冬棗切片的實(shí)際圖；(b)以硬脂酸為目標(biāo)離子所得質(zhì)譜成像圖；(c)以槲皮素為目標(biāo)離子所得質(zhì)譜成像圖(vx=0.3 mm/s, dy=0.4 mm, 掃描方向?yàn)閺挠业阶?，從下至?Fig.4 (a) Photograph of the winter jujube slice; (b) Mass spectrometry imaging of thestearic acid; (c) Mass spectrometry imaging of the quercetin. The speed in horizontal direction is vx=0.3 mm/s, the vertical interval is 0.4 mm, the scan direction is from right to left, from bottom to up.

3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果討論

從“A”字的成像圖中可以看出，成像圖雖與實(shí)際圖較符合，但還是存在明顯的拖尾現(xiàn)象，其主要是受等離子體羽本身的形狀、尺寸大小的限制，也可能與質(zhì)譜儀的記憶效應(yīng)有關(guān)。在冬棗的成像圖中，觀察到有明顯黑白相間的寬條紋，主要因?yàn)镸FGDP產(chǎn)生的等離子羽在x軸方向?yàn)楸∑趛軸方向相對(duì)較厚。初步實(shí)驗(yàn)證明，MFGDP質(zhì)譜成像在不需要對(duì)分析物標(biāo)記，也不需要對(duì)分析樣品復(fù)雜預(yù)處理的前提下，不僅能提供樣品中目標(biāo)物質(zhì)的空間分布，還能提供其分子的結(jié)構(gòu)信息；更重要的是，因其整個(gè)掃描過程具有耗時(shí)短、操作簡(jiǎn)易、等離子體羽低溫等特點(diǎn)，使其有望成為生物化學(xué)、藥物定位、刑偵鑒定等領(lǐng)域的有力工具。目前其空間分辨率還不是很理想,本實(shí)驗(yàn)中分辨率大約為300 μm,主要受到了MFGDP離子源本身的制約，還需進(jìn)一步調(diào)整MFGDP離子源的結(jié)構(gòu),現(xiàn)階段我們正在改進(jìn)放電通道的結(jié)構(gòu)，以得到尺寸更小的等離子體羽。

4 結(jié) 論

利用新型MFGDP離子源與常規(guī)離子阱質(zhì)譜儀聯(lián)用實(shí)現(xiàn)了對(duì)不同樣品的成像分析, 此方法無需復(fù)雜的預(yù)處理，具有無污染、耗時(shí)短、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，比較適合定位小分子物質(zhì)在組織樣品中的分布。經(jīng)初步探索研究，雖取得較好的結(jié)果，但目前其空間分辨率、靈敏度還有待進(jìn)一步提高，還需進(jìn)一步調(diào)整MFGDP離子源本身的參數(shù)，通過改進(jìn)MFGDP的結(jié)構(gòu)和設(shè)計(jì)可以獲得更微型化的等離子羽，從而進(jìn)一步提高成像的分辨率。

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(Received 10 October 2015; accepted 4 November 2015)

Preliminary Study of Microfabricated Glow Discharge Plasma Used for Mass Spectrometry Imaging

TIAN Cai-Yan1,2, DING Xue-Lu1,2, YIN Jin-Wei1,2, DUAN Yi-Xiang*1,2,3

(CollegeofLifeScience1,ResearchCenterofAnalyticalInstrumentation2,KeyLaboratoryofBio-resourceandEco-environmentMinistryofEducation3,SichuanUniversity,Chengdu610064,China)

To evaluate the ability of microfabricated glow discharge plasma (MFGDP) as ion source used for mass spectrometry imaging, the different handwritings with urea added were analyzed, and the spatial distribution of stearic acid and the ramification of quercetin in a slice of winter jujube were explored. The MFGDP was independently researched and developed by our lab, and acted as ion source to absorb and ionize the sample. The mass spectra of the excited sample ions entered into mass spectrometer were converted into corresponding image by special software. The results showed that the MFGDP source was feasible and valuable for mass spectrometry imaging. The method proposed here has remarkable features such as simple device, easy operation, low temperature plasma and time saving (<20 min) and it could be used to locate the distribution of the different substances in a sample. The factors influenced the definition of image were discussed and the experimental conditions were optimized, and the resolution was about 300 μm under the optimum conditions. The technology can distinguish different handwritings according to the "fingerprints" of chemical substance, and obtain commendably the distribution of different nutrients in the real sample; therefore, it provides a new method for the study of the calligraphy and painting, identification for artwork and acquisition for nutrients distribution.

Micro-fabricated glow discharge plasma; Mass spectrometry; Scan; Imaging

10.11895/j.issn.0253-3820.150787

2015-10-10收稿；2015-11-04接受

* E-mail: yduan@scu.edu.cn