韓冬雪，李晶晶，張瑞紅，俞龍浩

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，大慶163319）

發(fā)酵牛肉火腿中ACE抑制肽的穩(wěn)定性研究

韓冬雪，李晶晶，張瑞紅，俞龍浩

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，大慶163319）

研究了發(fā)酵牛肉火腿中提取的ACE抑制肽的熱處理、室溫儲存和模擬胃腸道消化穩(wěn)定性。結(jié)果表明，發(fā)酵牛肉火腿中提取的ACE抑制肽，在50、72、85和100℃下處理5 min和100℃下5、10、20和40 min處理后，處理組和對照組ACE抑制活性無顯著差異。在室溫下儲存2 d，處理組和對照組ACE抑制活性無顯著差異（P＞0.05），但儲存至3 d，它的ACE抑制活性顯著低于對照組（P＜0.05），其后儲藏時間對提取物的ACE抑制活性無顯著影響。ACE抑制肽經(jīng)體外模擬胃腸道消化后，其活性與對照組無顯著差異。

發(fā)酵牛肉火腿；ACE抑制肽；常溫儲存；熱處理；胃腸消化

許多膳食蛋白質(zhì)在消化、發(fā)酵或加工熟化時都會釋放出多肽，其中有些多肽對生物機體的生命活動有益或具有生理作用，能夠改善人體健康，因此被稱為生物活性肽［1］。生物活性肽能夠發(fā)揮不同的生物活性，如抗氧化，抗血栓形成，抗高血壓，免疫調(diào)節(jié)，和類鴉片等作用。因此，多肽特殊的生物學(xué)性能使它們很可能成為功能性成分，改善人體健康［2］。

ACE能夠引起高血壓，它是一種二肽酰羧肽酶，它能促進血管緊張肽Ⅰ轉(zhuǎn)化為血管緊張肽Ⅱ，血管緊張肽Ⅱ是一種能夠引起高血壓，使抗高血壓肽失去活性的物質(zhì)，這種抗高血壓肽為血管舒緩激肽。近年來，ACE抑制劑因其能夠抑制高血壓而受到廣泛關(guān)注。ACE抑制劑包括ACE抑制肽和抑制ACE的藥物等。前人的研究指出ACE抑制肽來源于肌漿球蛋白、肌動蛋白和一些水溶性蛋白［3-4］。Katayama等［5］研究指出，ACE抑制肽不盡能由前面所述的蛋白質(zhì)產(chǎn)生，也可由調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)產(chǎn)生，如原肌球蛋白和肌鈣蛋白。目前國外已經(jīng)有關(guān)于西班牙干腌火腿［6］、牛肉肌漿蛋白水解產(chǎn)物［7］、金槍魚結(jié)構(gòu)蛋白酶解產(chǎn)物［8］和雞肉膠原蛋白水解產(chǎn)物等［9］肉源ACE抑制肽的研究報告。國內(nèi)對于植物源ACE抑制肽的研究較多，如大孔吸附樹脂吸附米糠蛋白得到的ACE抑制肽［10］和花生ACE抑制肽等［11］。另外還有關(guān)于乳源ACE抑制肽的研究，如α-S2-牛乳酪蛋白經(jīng)酶解產(chǎn)生的ACE抑制肽［12］和發(fā)酵乳中分離出的ACE抑制肽等［13］。但國內(nèi)關(guān)于肉類深加工產(chǎn)品中ACE抑制肽的研究很少。我們的前期研究表明，較常見的市售中國傳統(tǒng)火腿制品，如金華火腿、如皋火腿、安福火腿和宣威火腿，它們在加工過程中會發(fā)生蛋白質(zhì)水解，但是從這些火腿中提取的小肽并沒有顯示出ACE抑制活性，而從實驗室開發(fā)的發(fā)酵牛肉火腿提取的多肽，顯示出了ACE抑制活性，然而我們還不了解它在加工和食用后是否仍具有ACE抑制活性。

因此，對發(fā)酵牛肉火腿中多肽提取物的熱處理、室溫儲藏和體外模擬胃腸道消化穩(wěn)定性進行了研究，來確定實驗室開發(fā)的發(fā)酵牛肉火腿中ACE抑制肽的穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

馬尿酰組胺酰亮氨酸（HHL）和血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）都購買于德國Sigma公司；HCl、乙醇、乙酸乙酯均為分析純；牛肉發(fā)酵火腿由實驗室制作提供。

1.2 實驗儀器

離心機CR21G（Hitachi，Japan）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)氣；無菌均質(zhì)機Scientz-04（寧波新芝科技）；紫外分光光度計Specord210 Plus（analytikjena，Germany），電熱恒溫水浴鍋DK-S24型（上海森信實驗儀器有限公司）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱DGG-9030A型（上海森信實驗儀器有限公司），pH計S40（METTLER TOLEDO，USA）。

1.3 實驗方法

1.3.1 發(fā)酵牛肉火腿中多肽的提取

根據(jù)Elizabeth Escudero等［6］在發(fā)酵火腿中多肽提取方法，取發(fā)酵牛肉火腿20 g，放入均質(zhì)袋中，加50 mL 0.01N的HCl均質(zhì)9 min，移入離心管中在4℃、3 000 r·min-1離心20 min，紗布過濾，濾去殘渣取上清液，加3倍體積乙醇在4℃靜置20 min，然后4℃、12 000 r·min-1離心20 min取上清液，用0.45 μm尼龍膜過濾器過濾，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸發(fā)至干燥，加10 mL 0.01N HCl重溶，在-20℃儲存待用。

1.3.2 體外ACE抑制活性的測定

根據(jù)Yamamoto等［14］的馬尿酸方法對樣品的ACE抑制活性進行測定。在10 mL試管中加入200 μL的HHL和80 μL樣品，在37℃保溫3 min，隨后加入20 μL的ACE溶液，漩渦混合均勻后，在37℃保溫30 min。加250 μL的1.0 1 mol·L-1HCl溶液終止反應(yīng)。再加1.7 mL乙酸乙酯，振蕩20 s后靜置5 min。吸取1.0 mL乙酸乙酯層，120℃烘箱烘干。加入3.0 mL蒸餾水，混勻后在波長228 nm處測定吸光度值。

ACE抑制率計算公式如下：

式中：A：含樣品和ACE的吸光度值；

B：不含樣品，含ACE的吸光度值；

C：不含樣品和ACE的吸光度值。

1.3.3 發(fā)酵牛肉火腿ACE抑制肽熱處理穩(wěn)定性測定

為了測定不同溫度相同時間處理對發(fā)酵火腿中ACE抑制肽穩(wěn)定性的影響，取發(fā)酵牛肉火腿多肽提取液在50、72、85和100℃溫度下分別處理5 min，然后冷卻至常溫后與原提取液作為對照組進行活性比較。

為了相同溫度不同時間處理對發(fā)酵火腿中ACE抑制肽穩(wěn)定性的影響，取發(fā)酵牛肉火腿多肽提取液，在100℃，分別處理0、5、10、20和40 min，然后冷卻至常溫后與原提取液作為對照組進行活性比較。

1.3.4 發(fā)酵牛肉火腿ACE抑制肽常溫儲存穩(wěn)定性測定

發(fā)酵牛肉火腿ACE抑制肽溶液，在常溫下分別存放1、2、3、4 d，然后按照上述方法，對其ACE抑制活性進行測定。ACE抑制活性測定方法同1.3.2的體外ACE抑制活性測定方法一致。

1.3.5 發(fā)酵牛肉火腿ACE抑制肽的消化穩(wěn)定性測定

發(fā)酵牛肉火腿ACE抑制肽的體外消化穩(wěn)定性測定，根據(jù)Laparra等［15］的方法稍作修改進行，即用胃蛋白酶和胰蛋白酶模擬胃腸道消化，將胃蛋白酶溶解在6 M HCl（pH 2.0）中，之后添加到發(fā)酵牛肉火腿提取物中，胃蛋白酶和提取物的比例為1∶100。在37℃消化2 h后用1M NaHCO3將pH調(diào)節(jié)至7.2使酶滅活。隨后添加胰蛋白酶，胰蛋白酶和提取物的比例為1∶50。在37℃消化3 h后加熱至95℃保持10 min使酶滅活。將其凍干后，用去離子水使其溶解后測定ACE抑制活性。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用SAS軟件（Institute 2000）對測定的數(shù)據(jù)進行差異性分析，確定測得數(shù)據(jù)的平均值、標準差和變量。采用Duncan多重檢驗確定各平均值間的顯著差異（P＜0.05）。實驗中對每個樣品均做了三重復(fù)測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 溫度和時間對發(fā)酵牛肉火腿ACE抑制肽活性的影響

實驗中對提取物ACE抑制肽處理50、72、85和100℃加熱5 min結(jié)果，其活性分別為56.53、48.53、54.89、52.03%，與對照組活性58.95%比較沒有顯著差異（Fig.1）。這一結(jié)果提示，在不同溫度下較短時間處理對發(fā)酵牛肉火腿ACE抑制肽活性沒有影響。Hwang［16］研究發(fā)現(xiàn)，在不同溫度下烹調(diào)的金槍魚汁中的ACE抑制肽都有很好的穩(wěn)定性，且在處理前后成分幾乎相同。Tidarat［17］研究指出，羅非魚肉泥用桿菌屬的SK1-3-7蛋白酶水解后顯示出ACE抑制活性，且其水解產(chǎn)物在100和121℃都顯示出很好的熱穩(wěn)定性。楊鋒［18］的研究表明醋蛋中ACE抑制肽在5、30、50、70℃下保溫60 min后，它的抑制活性仍較穩(wěn)定。

對發(fā)酵牛肉火腿ACE抑制肽提取物100℃加熱5、10、20、40 min處理結(jié)果，其活性分別為81.38%、76.69%、82.41%、80.98%，與對照組活性85.58%比較也沒有顯示顯著差異（圖2）。這一結(jié)果提示，在100℃不同時間處理對發(fā)酵牛肉火腿ACE抑制肽活性也沒有影響。Wu和Ding報告［19］，來源于大豆蛋白的ACE抑制肽在20、40、60、80和100℃保溫2 h后，這五個處理組間的ACE抑制活性無顯著差異。于志鵬［25］的研究指出，蛋清蛋白經(jīng)堿性蛋白酶Alcalase酶解后，獲得的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽具有耐熱性。

由此得出，發(fā)酵牛肉火腿ACE抑制肽對不同溫度和時間處理具有較好的穩(wěn)定性，至少對100℃處理40 min時還表現(xiàn)出較好的熱穩(wěn)定性。

2.2 室溫儲存對發(fā)酵牛肉火腿ACE抑制肽活性的影響

對發(fā)酵牛肉火腿ACE抑制肽分離提純時發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵牛肉火腿ACE抑制肽如果長時間暴露在室溫下會對其ACE抑制活性產(chǎn)生影響。但是到目前為止還未見到較長的室溫儲存時間對ACE抑制肽活性影響的報告。因此我們對發(fā)酵火腿中ACE抑制肽的室溫儲存穩(wěn)定性進行了研究。

發(fā)酵牛肉火腿ACE抑制肽提取物室溫下處理1、2、3和4 d結(jié)果，其活性分別為62.73%、62.58%、44.63%、44.44%。在儲存1和2 d時，與對照組活性63.25%比較沒有顯著差異（圖3），當儲存至3和4 d時，與對照組活性比較下降了約30%。這一結(jié)果提示，在室溫下儲存2 d時，對發(fā)酵牛肉火腿ACE抑制肽活性沒有影響，而儲存至3 d時，對發(fā)酵牛肉火腿ACE抑制肽活性影響顯著，此后儲藏時間對提取物的ACE抑制活性無顯著影響。

圖1 不同溫度處理5 min對發(fā)酵牛肉火腿中ACE抑制肽活性的影響Fig.1Effects of ACE inhibitory peptides activity of fermented beef ham at different temperature treatment for 5 min

圖2100 ℃處理不同時間對發(fā)酵牛肉火腿中ACE抑制肽活性的影響Fig.2Effects of ACE inhibitory peptides activity of fermented beef ham at 100℃treatment for different times

圖3 室溫儲存不同天數(shù)對發(fā)酵牛肉火腿中ACE抑制肽活性的影響Fig.3Effects of ACE inhibitory peptides activity of fermented beef ham at room temperature store for different days

2.3 體外消化對發(fā)酵火腿中多肽的ACE抑制活性的影響

蛋白酶在消化過程中會產(chǎn)生生物活性肽，但是這些活性肽存在于母源蛋白中時是沒有活性的。如果ACE抑制肽以活化型進入血液，便能夠在體內(nèi)發(fā)揮抗高血壓作用。所以，多肽在口服后要能夠抵抗胃腸酶和刷狀緣肽酶的水解作用并穿過小腸壁，才能夠保留它們的生物活性。在此過程中，多肽會被分解，這可能會激發(fā)它們的生物活性，或者使它們的生物活性消失。

實驗中經(jīng)胃蛋白酶消化處理的樣品ACE抑制活性仍然具有較高的活性與未經(jīng)處理組無顯著性差異（表1）。這表明發(fā)酵牛肉火腿提取物中存在的多肽，能夠抵抗胃腸的消化，或者它們中的一部分會被分解為更小的多肽，而且能夠保持抗高血壓生物活性。前人的研究指出，小肽經(jīng)消化后仍有ACE抑制活性［15］。賈俊強等［20］研究發(fā)現(xiàn)，蠶蛹源ACE抑制肽經(jīng)腸道酶消化后，部分ACE抑制肽會被分解成失活片段，或生成新的ACE抑制肽，最終使得蠶蛹源ACE抑制肽經(jīng)過體外消化后仍具有ACE抑制活性。這些結(jié)果表明，ACE抑制肽經(jīng)口服后，在胃部能保持它們完整的序列，或斷裂成更小具有ACE抑制活性的生物活性肽。

表1 體外模擬胃腸消化對發(fā)酵牛肉火腿中ACE抑制肽活性的影響Table 1Effects of ACE inhibitory peptides activity of fermented beef ham in vitro digestion by gastrointestinal proteases

3 結(jié)論

實驗室開發(fā)的發(fā)酵牛肉火腿中提取的多肽溶液在不同溫度下處理5 min和100℃處理不同時間后，其ACE抑制活性與對照組相比均無顯著差異。并且在室溫下儲存至2 d，其ACE抑制活性與對照組相比無顯著差異，但是儲存到3 d時，其ACE抑制活性與對照組相比顯著降低（P＜0.05），此后其ACE抑制活性趨于穩(wěn)定，儲存至4 d時的ACE抑制活性與對照組相比大約下降了30%。因此，對此類提取物進行分離和純化時，要注意控制溫度和時間，避免提取物長時間暴露在室溫下，以免影響其后的功能及結(jié)構(gòu)等分析測定。

［1］Korhonen H，Pihlanto-Leppala A，Rantamaki P，et al.Impact of processing on bioactive proteins and peptides［J］.Trends in Food Science&Technology，1998（8-9）：307-319.

［2］于婷，李雪，韓春姬，等.發(fā)酵技術(shù)改善中藥降血糖作用的研究進展［J］.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)學(xué)報，2015，37（1）：80.

［3］Arihara K，Nakashima Y，Mukai T，et al.Peptide inhibitors for angiotensin I-converting enzyme from enzymatic hydrolysates of porcine skeletal muscle proteins［J］.Meat Science，2001，57（3）：319-324.

［4］喬瀟，郎秀峰.功能化多肽的研究概述［J］.河北科技師范學(xué)院學(xué)報，2015，29（1）：70.

［5］Katayama K，F(xiàn)uchu H，Sakata A，et al.Angiotensin I-converting enzyme inhibitory activities of porcine skeletal muscle proteins following enzyme digestion［J］.Asian-Australasian Journal of Animal Sciences，2003，16（3）：417-424.

［6］Elizabeth E，Maria-Concepcion A，Hitoshi N，et al.Antihypertensive effect and antioxidant activity of peptide fractions extracted from Spanish dry-cured ham［J］.Meat Science，2012，91（3）：306-311.

［7］Jang A，Lee M.Purification and identification of angiotensin converting enzyme inhibitory peptides from beef hydrolysates［J］.Meat Science，2005，69（4）：653-661.

［8］Lee S H，Qian Z J，Kim S K.A novel angiotensin I converting enzyme inhibitory peptide from tuna frame protein hydrolysate and its antihypertensive effect in spontaneously hypertensive rats［J］.Food Chemistry，2010，118（1）：96-102.

［9］Iwai K，Zhang Y，Kouguchi T，et al.Blood concentration of food-derived peptides following oral intake of chicken collagen hydrolysate and its angiotensin-converting enzyme inhibitory activity in healthy volunteers［J］.Nippon Shokuhin，2009，56（6）：326-330.

［10］張焱，翟愛華.大孔樹脂吸附分離米糠中ACE抑制肽工藝［J］.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報，2013，25（5）：41-47.

［11］江利華，王璋，許時嬰，等.花生ACE抑制肽的分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定及體內(nèi)降血壓功能研究［J］.食品工業(yè)科技，2009，30（10）：94-100.［12］Tauzin J，Miclo L，Gaillard J L.Angiotensin-I-converting enzyme inhibitory peptides from tryptic hydrolysate of bovine α-S2-casein［J］.FEBS Letters，2002，531（2）：369-374.

［13］吳瓊英，馬海樂.發(fā)酵乳中血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑的分離與鑒定［J］.食品科學(xué)，2006，27（7）：81-85.

［14］Yamamoto S，Toida I，Iwai K.Re-examination of spectrophotometric assay for serum Angiotensin 1converting enzyme［J］.Nihon Kyobu Shikkann Gakkai Zasshi（in Japanese），1980，18：297-302.

［15］Laparra J M，Vélez D，Montoro R，et al.Estimation of arsenic bioaccessibility in edible seaweed by an in vitro digestion method［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2003，51（20）：6080-6085.

［16］Hwang J S.Impact of processing on stability of angiotensin I-converting enzyme（ACE）inhibitory peptides obtained from tuna cooking juice［J］.Food Research International，2010，43（3）：902-906.

［17］Tidarat T，Sittiruk R，Jirawat Y.Characterization and identification of angiotensin I-converting enzyme（ACE）inhibitorypeptidesderivedfromtilapiausing Virgibacillus halodenitrificans SK1-3-7 proteinases［J］. Journal of Functional Foods，2015，14：435-444.

［18］楊鋒，馬千里，黃永春.醋蛋中ACE抑制肽的分離及穩(wěn)定性研究［J］.食品科學(xué)，2009，30（24）：77-79.

［19］Wu J，Ding X.Characterization of inhibition and stability of soy-proteinderived angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptides［J］.Food Research International，2002，35（4）：367-375.

［20］賈俊強，吳瓊英，徐金玲，等.蠶蛹源ACE抑制肽的穩(wěn)定性和抑制ACE動力學(xué)［J］.食品與生物技術(shù)學(xué)報，2012，32（8）：875-881.

Stability of ACE Inhibitory Peptides in Fermented Beef Ham

Han Dongxue，Li Jingjing，Zhang Ruihong，Yu Longhao
（College of Food Science，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319）

The study aimed to investigate the stability of ACE inhibitory peptides in fermented beef ham after heat treatment，room temperature storage and simulated gastrointestinal digestion.The results indicated that ACE inhibitory activity of treatment and control groups had no significant difference when ACE inhibitory peptides in fermented beef ham was incubated at 50，72，85 and 100℃for 5 min and 100℃for 5，10，20 and 40 min.Stored at room temperature for 2 days，ACE inhibitory activity of treatment and control groups had no significant difference（P＞0.05），but ACE inhibitory activity of the treatment group was significant inferior to the control group（P＜0.05）in 3 day，then there was no significant influence on ACE inhibitory activity for further storage.ACE inhibitory activity of the peptides was treated by simulated gastrointestinal digestion that compared with the control group，which had no significant difference.

fermented beef ham；ACE inhibitory peptides；room temperature storage；heat treatment；gastrointestinal digestion

S351.1

A

1002-2090（2016）04-0041-04

10.3969/j.issn.1002-2090.2016.04.010

2015-05-15

黑龍江省科技廳資助項目（WB09B201-2）。

韓冬雪（1987-），女，黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院2012級碩士研究生。

俞龍浩，男，教授，碩士研究生導(dǎo)師，E-mail：yu2058@sohu.com。