田朝暉，張 彪

（1.呼倫貝爾職業(yè)技術(shù)學(xué)院教務(wù)處，內(nèi)蒙古呼倫貝爾021000；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京海淀100083）

添加劑

板藍(lán)根、黃芪和青蒿提取物抗PRRSV作用比較

田朝暉1*，張 彪2

（1.呼倫貝爾職業(yè)技術(shù)學(xué)院教務(wù)處，內(nèi)蒙古呼倫貝爾021000；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京海淀100083）

本試驗(yàn)對(duì)板藍(lán)根、黃芪的提取物以及青蒿素的萃取液抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）的作用機(jī)制進(jìn)行研究。采用光學(xué)顯微鏡觀察各細(xì)胞株形態(tài)上的變化，同時(shí)根據(jù)試驗(yàn)收集到的不同中草藥提取物在不同濃度下（1、2、4、6 μg/mL）的細(xì)胞保護(hù)率，采用SPSS18.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。分析結(jié)果表明：不同濃度的中草藥提取物抑制PRRSV所導(dǎo)致的細(xì)胞變性效果有顯著差異，濃度越高，抑制效果越好。同時(shí)，不同的中草藥提取物對(duì)PRRSV的抑制效果也存在顯著差異，板藍(lán)根提取物具有一定的減少病毒造成細(xì)胞病變的作用，而青蒿素提取物保護(hù)細(xì)胞的能力效果最佳，有效降低PRRS病毒復(fù)制與抑制病毒導(dǎo)致細(xì)胞變性效果，阻斷病毒的復(fù)制以降低感染的機(jī)會(huì)。

豬繁殖與呼吸綜合征病毒；板藍(lán)根；黃芪；青蒿素；提取物；抑制

豬生殖與呼吸綜合征（PRRS）為一種豬群的新興疾?。ê返?，2016），其致病源PRRSV屬于具封套的單股正鏈RNA病毒，病毒大小50～65nm，基因體大小約15.1 kb，屬于動(dòng)脈病毒科，在臨床病癥上除了同時(shí)期的豬只會(huì)有呼吸道疾病發(fā)生外，對(duì)于懷孕母豬，更會(huì)有流產(chǎn)、早產(chǎn)、胎兒木乃伊化。感染后幸存的豬只也常常會(huì)引起二次感染，造成養(yǎng)豬業(yè)重大的損失。我國(guó)于2006年6月開(kāi)始暴發(fā)高致病性豬生殖與呼吸綜合征，豬的發(fā)病率達(dá)100%，死亡率為25%～50%（徐麗華等，2015）。我國(guó)的高致病性豬生殖與呼吸綜合癥臨床征狀包括高燒40～42℃、呼吸促迫、呼吸困難以及紅斑性皮疹等。目前PRRSV已有商品化疫苗的上市，但是疫苗的保護(hù)力度不夠，所以PRRSV至今還在全球肆虐（王君瑋，2014）。

目前有少數(shù)商品化的減毒疫苗，此外也有數(shù)種不同的試驗(yàn)性DNA疫苗或是以桿狀病毒、腺病毒、偽狂犬病病毒、腸炎弧菌作為載體所發(fā)展的PRRSV單位疫苗（肖珊珊，2013），但由于PRRSV本身在宿主所誘發(fā)的免疫反應(yīng)極為復(fù)雜，加上其本身又具有規(guī)避宿主免疫系統(tǒng)捕捉的機(jī)制，導(dǎo)致發(fā)展有效對(duì)抗該病的疫苗仍具有一定難度（劉依，2012）。國(guó)內(nèi)有部分學(xué)者從我國(guó)傳統(tǒng)的中草藥入手，研究對(duì)抗PRRSV的抗體，這些抗病毒藥物大部分為平時(shí)常見(jiàn)的清熱解毒類中草藥，研究發(fā)現(xiàn)，這些藥物中包含的板藍(lán)根、黃芪等對(duì)PRRSV具有一定的抗病毒作用（楊帆等，2014，王麗萍等，2013，秦華珍等，2012）。為此，本試驗(yàn)展開(kāi)進(jìn)一步研究，針對(duì)板藍(lán)根、黃芪的提取物以及青蒿素的萃取液抗PRRSV的作用機(jī)制，并對(duì)抗PRRSV效果對(duì)比分析。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與病毒PRSSV相關(guān)的病毒細(xì)胞由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)專業(yè)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室保留。

1.2 板藍(lán)根、黃紙、青蒿素等中草藥活性成分的提取

1.2.1 板藍(lán)根多糖的提取將干燥板藍(lán)根用閉式提取器處理，所得提取液先用武火加熱，沸騰后文火加熱0.5～1 h，紗布過(guò)濾；藥渣加10～20倍水煎煮兩次，合并紗布過(guò)濾以及兩次水煎煮的藥液，離心、過(guò)濾、濾液濃縮至19 mL；緩緩向上述液體中加入90%乙醇至乙醇濃度為55%～65%，冷藏8～9 h，2000～4000 r/min離心15～25 min后倒去上清液，沉淀用去離子水溶解至原體積，用乙醇沉淀2次，乙醇濃度分別為65%～75%、75%～85%，沉淀用去離子水溶解至原體積，加入1/4～1/6體積8%～12%的三氯乙酸溶液充分混勻后靜置3～5 min，2000～4000 r/min離心15～25 min后去沉淀得上清液，將既得上清液抽濾，烘干，即可得板藍(lán)根多糖。

1.2.2 黃芪多糖的提取選擇晾干的黃芪，粉碎后過(guò)40～80目篩，得黃芪粉，在黃芪粉中加水?dāng)嚢杈鶆?，黃芪粉與水的重量比例為1∶5～1∶10，在水中浸泡8～16 h，加入纖維素酶，纖維素酶的添加量為0.5%～0.9%、酶解溫度45℃、pH值5，將上述原料置于超聲波提取設(shè)備中提取，聲波的功率為400～600 W，頻率為800 Hz，酶解0.1～0.5 h；再加入堿性蛋白酶和菠蘿蛋白酶，堿性蛋白酶的加入量為0.2%～0.6%，菠蘿蛋白酶的加入量為0.2%～0.5%，酶解溫度50℃、pH值為6.8～7.5，將上述原料置于微波提取設(shè)備中提取，微波的功率為400～600 W，頻率為80 Hz，酶解0.1～0.5 h，酶解后在100～105℃下滅酶5～10 min，得酶解液。將上述的酶解液置于真空濃縮器中濃縮，減壓低溫濃縮酶解液至原體積的1/3，得黃芪粗多糖濃縮液。在黃芪粗多糖的濃縮液中加入活性炭，活性炭占黃芪粗多糖濃縮液重量的2%～6%，攪拌0.2～0.5 h，過(guò)濾濾出活性炭，繼續(xù)離心10～20 min，離心轉(zhuǎn)速為4500 r/min，將上清液與沉淀分別收集，取上清液過(guò)濾去渣，過(guò)濾后得到的濾液在60～70℃下濃縮，濃縮至其濃度為60%～70%，濃縮液按1∶4的比例加入95%乙醇，沉淀靜置10～20 h，離心10～20 min，離心轉(zhuǎn)速為4500 r/min，收集沉淀并用乙醇反復(fù)清洗2～3次，冷凍干燥至含量為4%～6%后，再在-1～4℃下進(jìn)行粉碎，得可溶性多糖。上述加酶量均為酶占超散粉碎后黃芪重量百分比。

1.2.3 青蒿素液配制將青蒿原料粉碎，過(guò)10～80目篩，按照固液比1∶5～1∶70（m/V）加入咪唑類離子液體鹵化物鹽和水的混合液，在超聲功率1～100 W/cm2，超聲頻率20～80 kHz，溫度20～60℃條件下，提取5～60 min，經(jīng)液-固分離得到含青蒿素的提取液；將上一步得到的提取液按青蒿素提取液∶有機(jī)萃取劑比例為1∶1～20∶1（V/V）萃取1～5次，分離有機(jī)相得青蒿素萃取相，萃取相-離子液體循環(huán)使用；將得到的有機(jī)萃取相蒸發(fā)回收有機(jī)萃取劑后得青蒿素粗品；得到的青蒿素粗品再溶解，用柱層析重結(jié)晶進(jìn)一步精制得高純度青蒿素；得到的離子液體萃取液循環(huán)使用2～8次后，加入大孔吸附樹(shù)脂攪拌吸附0.5～10 h，過(guò)濾或離心分離樹(shù)脂，得到再生的離子液體提取液。

1.3 中藥成分體外抗PRRSV效果的測(cè)定將PRRSV培養(yǎng)于96孔盤(pán)中（5×103cell/well)，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼附于培養(yǎng)盤(pán)上，60%滿細(xì)胞剛好形成單層化，移除培養(yǎng)液，即可進(jìn)行病毒效價(jià)測(cè)定。首先將待測(cè)PRRS病毒株以培養(yǎng)液10倍連續(xù)稀釋，使病毒稀釋為10-1～10-8濃度（100 L/well），每個(gè)稀釋倍數(shù)進(jìn)行6次重復(fù)，培養(yǎng)于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱，3 d后以倒立顯微鏡觀察細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）現(xiàn)象，即細(xì)胞在感染病毒后產(chǎn)生剝落、變圓、萎縮等現(xiàn)象。以Reed-Muench法計(jì)算細(xì)胞所產(chǎn)生的CPE，由此可算出病毒的TCID50（能讓50%培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生CPE的病毒量）。下列公式為病毒評(píng)價(jià)的計(jì)算（王學(xué)兵等，2014）：

帶入不同稀釋倍數(shù)的病毒的數(shù)據(jù)，可得PRRSV的TCID50=10-4.336/0.1 mL。

1.4 細(xì)胞形態(tài)變化觀察板藍(lán)根、黃芪、青蒿素萃取物對(duì)于非洲綠猴腎臟細(xì)胞株（Marc-145）與豬肺泡巨噬細(xì)胞（PAM）形態(tài)變化觀察。以血球計(jì)數(shù)盤(pán)計(jì)數(shù)后將2×l06細(xì)胞培養(yǎng)于6 cm有蓋培養(yǎng)皿使細(xì)胞貼附，加入板藍(lán)根、黃芪、青蒿素萃取物，調(diào)整濃度分別為含1、2、4、6 μg/mL，分別處理各細(xì)胞株，培養(yǎng)時(shí)間為1 h，病毒評(píng)價(jià)為M.O.I=2的豬生殖與呼吸綜合癥病毒進(jìn)行感染24 h，再以光學(xué)顯微鏡觀察各細(xì)胞株形態(tài)上的變化。

1.5 數(shù)據(jù)處理及藥效評(píng)價(jià)根據(jù)試驗(yàn)收集到的不同中草藥提取物濃度下的細(xì)胞保護(hù)率，采用SPSS 18.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，比較板藍(lán)根、黃芪、青蒿等中藥提取物的細(xì)胞保護(hù)率，從而對(duì)各中藥提取物的抗病毒效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。

2 結(jié)果

2.1 中草藥提取物處理并感染PRRSV對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響將Marc-145細(xì)胞以2×106的細(xì)胞數(shù)量培養(yǎng)在12孔細(xì)胞培養(yǎng)盤(pán)，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)到七分滿時(shí)分別加入1、2、4、6 μg/mL的板藍(lán)根、黃紙、青蒿素提取物，于37℃含5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中作用1 h，再以病毒M.O.I=2攻毒細(xì)胞3 d，再經(jīng)由顯微鏡觀察細(xì)胞變化，主要表現(xiàn)為細(xì)胞折光性增加、變圓、黏連、破碎、脫落等狀態(tài)。

從細(xì)胞病變的結(jié)果中可以看到，不同濃度的中草藥提取物抑制PRRS病毒所導(dǎo)致的細(xì)胞變性效果有顯著差異，濃度越高，抑制效果越好，同時(shí)，不同的中草藥提取物對(duì)PRRS病毒的抑制效果也存在顯著差異，板藍(lán)根提取物具有一定的減少病毒造成細(xì)胞病變的現(xiàn)象，而青蒿素提取物保護(hù)細(xì)胞的能力效果最佳，有效降低PRRS病毒復(fù)制與抑制病毒導(dǎo)致細(xì)胞變性效果，阻斷病毒的復(fù)制以降低感染的機(jī)會(huì)。

2.2 中草藥提取物抗PRRSV的藥效結(jié)果對(duì)比由表1可見(jiàn)，三種中草藥提取物對(duì)PRRSV均有抑制作用，提取物的濃度越高，抑制作用越明顯，不同的中草藥提取物對(duì)PRRSV的抑制作用有明顯差距，其中青蒿素提取物對(duì)PRRSV的抑制作用最強(qiáng)，而板藍(lán)根的抑制作用一般，提取物濃度越低，不同中草藥之間的抑制作用差距越明顯。

表1 不同濃度中草藥提取物的體外抗PRRSV作用%

3 討論

許多中草藥具有提高自身免疫力的功效，因此，安全、高效、低毒的中草藥提取物日益被人們所關(guān)注?？茖W(xué)家們不斷發(fā)現(xiàn)多糖以及糖復(fù)合物在生物體中不但作為能源及構(gòu)成生物體的材料存在，而且它還存在于一切細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)中，參與各類細(xì)胞的生命運(yùn)動(dòng)，具有多樣化的生物功能，如抗病毒、抗菌消炎、免疫調(diào)節(jié)、抗內(nèi)毒素、抗癌等作用（王學(xué)兵等，2012）。

板藍(lán)根為十字花植物菘藍(lán)的干燥根，是板藍(lán)根的主要來(lái)源。臨床常用中草藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，味苦，性寒，有清熱解毒，涼血利咽功能。用于溫毒發(fā)斑、舌絳紫暗、痄腮、爛喉丹痧、大頭瘟疫、丹毒、癰腫等癥。近年來(lái)研究證明板藍(lán)根多糖是板藍(lán)根提取物中含量較多、生物活性較強(qiáng)的一類物質(zhì)。板藍(lán)根多糖具有免疫調(diào)節(jié)功能，對(duì)特異性免疫和非特異性免疫、體液免疫或細(xì)胞免疫具有一定的促進(jìn)作用。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)板藍(lán)根提取物對(duì)抑制PRRSV有特殊的功效，板藍(lán)根多糖在濃度達(dá)到6 μg/mL以上時(shí)，對(duì)PRRSV的抑制作用可以達(dá)到70%以上，抑制效果明顯（張紅英等，2013）。

黃芪具有補(bǔ)氣固表，利尿托毒，排膿，斂瘡生肌的功效。用于氣虛乏力，食少便溏，中氣下陷，久瀉脫肛，便血崩漏，表虛自汗，癰疽難潰，久潰不斂，血虛萎黃，內(nèi)熱消渴?！侗窘?jīng)》記載：“主癰疽，久敗瘡，排膿止痛。補(bǔ)虛，小兒百病。”《日華子本草》記載：“助氣壯筋骨，長(zhǎng)肉補(bǔ)血黃芪多糖可顯著增強(qiáng)非特異性免疫功能和體液免疫功能，顯著增強(qiáng)動(dòng)物巨噬細(xì)胞的吞噬功能，促進(jìn)血清溶血素形成，提高空斑形成細(xì)胞的溶血功能和明顯的碳離廓清作用和明顯增加脾重量，黃芪多糖是一種干擾素誘導(dǎo)劑，其抗病毒原理：刺激巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞的功能，使E環(huán)形成細(xì)胞數(shù)增加，誘生細(xì)胞因子，促進(jìn)白細(xì)胞介素誘生，而使動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生內(nèi)源性干擾素，從而達(dá)到抗病毒的目的。在本試驗(yàn)中，黃芪多糖對(duì)PRRSV有明顯的抑制作用，在黃芪多糖的濃度達(dá)到6 μg/mL以上時(shí)，抑制率達(dá)到了75%以上，對(duì)PRRSV的抑制作用顯著，并且黃芪多糖在各個(gè)濃度下對(duì)PRRSV的抑制作用都優(yōu)于板藍(lán)根提取物。

青蒿（Artemisia annua L.）又稱黃花蒿，為菊科一年生草本植物，廣泛分布于我國(guó)各地。青蒿入藥最早見(jiàn)于馬王堆三號(hào)漢墓出土（公元前168年左右）的帛書(shū)《五十二病方》，后在《神農(nóng)本草經(jīng)》《本草綱目》等書(shū)中均有記載，青蒿含有多種揮發(fā)性和非揮發(fā)性藥用成分，其中揮發(fā)性成分主要為揮發(fā)油，非揮發(fā)性成分主要有青蒿素、青蒿甲素、乙素、丙素及青蒿酸、香豆素、黃酮、豆菌醇等（李青等，2008）。在本試驗(yàn)中，青蒿素抑制PRRSV的作用最顯著，在各個(gè)濃度下都較顯著，當(dāng)青蒿素提取物的濃度達(dá)到6 μg/mL以上時(shí)，抑制率達(dá)到了85%以上，效果非常顯著，本研究進(jìn)一步擴(kuò)展了青蒿素的用途。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)對(duì)板藍(lán)根、黃芪的提取物以及青蒿素的萃取液抗PRRSV的作用機(jī)制進(jìn)行研究，通過(guò)相關(guān)試驗(yàn)比較抗PRRSV的效果，從試驗(yàn)結(jié)果可以看出，三種中草藥提取物對(duì)PRRSV均有抑制作用，提取物的濃度越高，抑制作用越明顯，不同的中草藥提取物對(duì)PRRSV的抑制作用有明顯差異，其中青蒿素提取物對(duì)PRRSV的抑制作用最強(qiáng)，而板藍(lán)根的抑制作用一般，提取物濃度越低，不同中草藥之間的抑制作用差異越明顯。試驗(yàn)的研究結(jié)果對(duì)治療和預(yù)防PRRSV有一定的參考價(jià)值。

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In this test，the action of radix，astragalus and artemisinin extract against porcine reproductive and respiratory syndrome virus（PRRSV）and their mechanism were studied.An optical microscope was used to observe morphological changes in each cell line，and according to test cytoprotective rate collected from different concentrations（1，2，4，6 μg/mL）of herbal extracts，SPSS18.0 statistical software was used for data polarity analysis.The results showed that：the different concentrations of herbal extracts inhibiting cell degeneration by PRRS virus caused a significant difference，the higher the concentration，the inhibitory effect was better.At the same time，the effect of different herbal extracts on PRRS virus inhibitory was significantly different，radix extract had a certain reduction in viral causing cytopathic phenomenon，and artemisinin extract had the best cells protection，reduced the PRRS virus replication and inhibition effect of the virus that caused the degeneration of cells,block viral replication in order to reduce the chance of infection.

PRRSV；radix；astragalus；artemisinin；extracts；inhibition

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20161705

S852.65

A

1004-3314（2016）17-0016-04

*通訊作者