張立豐，白春玉，張 迪，趙麗妮

（沈陽醫(yī)學(xué)院1.公共衛(wèi)生學(xué)院兒少衛(wèi)生與婦幼保健學(xué)教研室，2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，遼寧沈陽110034）

亞慢性鋁暴露對(duì)Wistar大鼠學(xué)習(xí)記憶及海馬CA1區(qū)c-Fos表達(dá)的影響

張立豐1，白春玉1，張 迪1，趙麗妮2

（沈陽醫(yī)學(xué)院1.公共衛(wèi)生學(xué)院兒少衛(wèi)生與婦幼保健學(xué)教研室，2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，遼寧沈陽110034）

目的探討亞慢性鋁暴露對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力和c-Fos表達(dá)的影響，探索鋁對(duì)大鼠認(rèn)知功能損害的毒性作用及機(jī)制。方法Wistar子代大鼠自出生之日起，分別通過乳汁或飲水染毒AlCl32.0，4.0和8.0 g·L-1連續(xù)3個(gè)月。Morris水迷宮法檢測(cè)子代大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，石墨爐原子吸收光譜法檢測(cè)子代大鼠海馬鋁含量，HE染色觀察海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)，RT-PCR法檢測(cè)子代大鼠海馬CA1區(qū)c-fos基因表達(dá)，免疫組化法檢測(cè)CA1區(qū)c-Fos蛋白表達(dá)。結(jié)果染AlCl3組子代大鼠學(xué)習(xí)記憶能力明顯低于對(duì)照組（P＜0.05，P＜0.01），海馬的鋁含量高于對(duì)照組（P＜0.01），其海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞呈現(xiàn)神經(jīng)纖維稀疏、神經(jīng)元細(xì)胞脫失甚至空泡樣變性等病理改變；染AlCl34.0和8.0 g·L-1組子代大鼠海馬c-fos mRNA表達(dá)水平分別低于對(duì)照組和染AlCl32.0 g·L-1組（P＜0.01）。染AlCl3組子代大鼠CA1區(qū)c-Fos蛋白表達(dá)水平低于對(duì)照組（P＜0.01）。結(jié)論亞慢性鋁暴露損害大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的機(jī)制可能與AlCl3造成海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞病理學(xué)改變、功能減弱以及c-Fos表達(dá)水平降低有關(guān)。

鋁；海馬；學(xué)習(xí)記憶；c-Fos

鋁在地殼中含量?jī)H次于氧和硅。人們通過鋁制炊具和容器、含鋁食品添加劑、含鋁水處理劑和含鋁藥物等途徑頻繁接觸鋁，其被攝取、吸收并在全身組織器官中分布。鋁是一種神經(jīng)毒物，腦是鋁的蓄積部位和主要靶器官，神經(jīng)細(xì)胞對(duì)于鋁的毒性十分敏感，鋁暴露可導(dǎo)致人的認(rèn)知能力和智力下降，甚至引起神經(jīng)元死亡［1-2］。由于鋁在各領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用和對(duì)廣大居民健康的影響，鋁暴露所導(dǎo)致的神經(jīng)系統(tǒng)損害已成為全球性公共衛(wèi)生問題［3-4］。鋁是智力低下性神經(jīng)疾病的一個(gè)重要環(huán)境致病因子。海馬是學(xué)習(xí)記憶的關(guān)鍵腦區(qū)，海馬區(qū)即刻早期基因（immediately early gene，IEG）c-fos及其蛋白表達(dá)在學(xué)習(xí)記憶信號(hào)傳導(dǎo)中起重要作用，但其在鋁的作用下有無變化尚未見報(bào)道。本研究考察3個(gè)劑量水平的氯化鋁（AlCl3）對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶的損害作用，從大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞病理改變、海馬c-fos基因及其蛋白表達(dá)方面，初步探索鋁對(duì)大鼠認(rèn)知功能損害的毒性作用機(jī)制，為深入研究鋁的毒性及其防治提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

Wistar大鼠，合格證號(hào)：SCXK（遼）2015-0001，由沈陽醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體質(zhì)量為250～270 g，雌雄比例2∶1。維持環(huán)境溫度18～23℃，相對(duì)濕度45%～55%，適應(yīng)環(huán)境1周后用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要試劑和儀器

AlCl3（分析純，國藥沈陽化學(xué)試劑有限公司），RT-PCR kit（TaKaRa BIO），兔抗大鼠c-F os抗體（美國Santa Cruz公司），山羊抗兔IgG二抗（武漢博士德公司）。原子吸收光譜儀（日本島津公司），Morris水迷宮（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院），9700PCR儀（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司），EC250-90電泳儀（美國Thermo公司），凝膠成像分析系統(tǒng)（美國UVP公司），顯微圖像分析系統(tǒng)（日本Olympus公司）。

1.3 動(dòng)物分組和染毒

隨機(jī)將Wistar雌性大鼠40只，分為對(duì)照組、AlCl32.0，4.0和8.0 g·L-1組，雌∶雄=2∶1同籠進(jìn)行交配，次日晨發(fā)現(xiàn)陰栓或陰道分泌物鏡檢有精子者定為受孕。分娩首日對(duì)照組母鼠飲用蒸餾水，AlCl3組母鼠分別飲用含AlCl32.0，4.0和8.0 g·L-1蒸餾水溶液。各AlCl3組子代大鼠在斷乳前經(jīng)由吸吮母乳染鋁，斷乳后自行飲含AlCl32.0，4.0和8.0 g·L-1的蒸餾水?dāng)z入鋁；對(duì)照組的子代大鼠斷乳前吸吮對(duì)照組母乳，斷乳后自行飲蒸餾水。染毒時(shí)限從子代大鼠出生后首日連續(xù)3個(gè)月，然后進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定。

1.4 Morris水迷宮法測(cè)定子代大鼠學(xué)習(xí)記憶能力

學(xué)習(xí)記憶訓(xùn)練和測(cè)試在Morris水迷宮內(nèi)進(jìn)行。各組子代大鼠每天訓(xùn)練4次，連續(xù)5 d。記錄子代大鼠找到水下平臺(tái)時(shí)間，如子代大鼠在60 s內(nèi)找到平臺(tái)，可允許其在平臺(tái)上停留約15 s；如未到達(dá)平臺(tái)，引導(dǎo)其到達(dá)平臺(tái)并停留15 s。訓(xùn)練5 d后，間隔1周將子代大鼠置于同樣環(huán)境開展定位航行實(shí)驗(yàn)，評(píng)估子代大鼠逃避潛伏期和路徑總長(zhǎng)度；空間探索實(shí)驗(yàn)，記錄其進(jìn)入目標(biāo)象限次數(shù)和在目標(biāo)象限停留時(shí)間。

1.5 石墨爐原子吸收光譜法測(cè)定子代大鼠海馬鋁含量

準(zhǔn)確稱取各組子代大鼠海馬0.2 g于石英燒杯中，加5～8 mL混合酸（濃硝酸∶高氯酸=4∶1，V/V），同時(shí)做空白對(duì)照。低溫加熱至試樣全部溶解，繼續(xù)加熱蒸發(fā)至近干，加2%硝酸溶解殘留物并定容至50 mL，用石墨爐原子吸收光譜法測(cè)定鋁含量，結(jié)果表示為每克濕重樣本鋁的含量。

1.6 HE染色法觀察海馬神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)

將各組子代大鼠腦組織進(jìn)行石蠟包埋，冠狀切片（厚度為20μm），每3張取1張，37℃條件下HE染色，中性樹膠封片，顯微照相系統(tǒng)攝片，觀察各組海馬神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)。

1.7 RT-PCR法測(cè)定子代大鼠海馬c-fos mRNA表達(dá)水平

取各組子代大鼠海馬制成勻漿，Trizol一步法提取總RNA，進(jìn)行定量與RNA純度鑒定。用TaKaRa RT-PCR試劑盒（AMV）Ver.2.1的二步法進(jìn)行PCR。內(nèi)參β肌動(dòng)蛋白引物序列：上游5′-TTC?CAGCAGATGTGGATCAG-3′，下游5′-AGAGAAGTGGGGTGGCTTTT-3′，PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度：406 bp。c-fos引物序列：上游5′-CCTCGAGGGGTTCCCGTAGA-3′，下游5′-ACAGACGTGGATATAGCGA-3′，PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度：497 bp。采用2-ΔΔCt法計(jì)算c-fos mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

1.8 免疫組化法測(cè)定子代大鼠海馬CA1區(qū)c-Fos蛋白表達(dá)

腦切片脫蠟，脫水，滅活內(nèi)源性酶，修復(fù)抗原，山羊血清封閉，常規(guī)ABC法對(duì)子代大鼠腦組織進(jìn)行免疫組化染色。加兔抗大鼠c-Fos單克隆抗體（一抗）（1∶200），漂洗后加山羊抗兔IgG（二抗），DAB顯色，中性樹膠封片并觀察。陰性對(duì)照用PBS代替一抗。光鏡（×400）下觀察。在相同放大倍數(shù)下，每張切片取3個(gè)不同的視野采集圖像，經(jīng)過Meta Morph，version 4.65顯微圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析。用平均積分吸光度值（average integrated absorbance，AIA）表示海馬CA1區(qū)c-Fos蛋白表達(dá)水平。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 鋁暴露對(duì)子代大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響

表1結(jié)果顯示，定位航行實(shí)驗(yàn)中，染鋁子代大鼠的平均逃避潛伏期長(zhǎng)于對(duì)照組（P＜0.05，P＜0.01），隨劑量增加而延長(zhǎng)，具有劑量相關(guān)性（r=0.994，P=0.006）。染鋁子代大鼠的游泳距離長(zhǎng)于對(duì)照組（P＜0.01），隨劑量增加而增加，具有劑量相關(guān)性（r= 0.971，P=0.029）?？臻g探索實(shí)驗(yàn)中，染鋁子代大鼠的停留時(shí)間低于對(duì)照組（P＜0.01），隨劑量增加而縮短（r=-0.962，P=0.038）。染鋁子代大鼠的穿越次數(shù)低于對(duì)照組（P＜0.01），隨劑量增加而減少（r=-0.920，P=0.080）。

Tab.1 Effect of AlCl3on spatiallearning and memory of offspring rats in Morris water maze

2.2 鋁暴露對(duì)子代大鼠海馬鋁含量的影響

各組染鋁子代大鼠海馬的鋁含量高于對(duì)照組（P＜0.01），隨劑量增加呈升高趨勢(shì)，具有劑量相關(guān)性（r=0.987，P=0.013）（表2）。

Tab.2Totalaluminumlevelinhippocampusof offspringratsexposedtoAlCl3

2.3 鋁暴露對(duì)子代大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)的影響

對(duì)照組神經(jīng)纖維排列整齊，神經(jīng)細(xì)胞清晰，染色較深，數(shù)目多，呈多層。鋁暴露各組隨染鋁劑量增加呈現(xiàn)受損樣改變。神經(jīng)纖維稀疏，間隙較大。神經(jīng)元細(xì)胞層次少而不清，細(xì)胞排列稀疏，染色逐漸減弱，數(shù)目減少（圖1）。

Fig.1EffectofAlCl3onhippocampusnervecellsin CA1areaofoffspringrats（HEstaining）.SeeTab.1for drugtreatment.Thearrowsshowrepresentativehippocampal nervecells.

2.4 鋁暴露對(duì)子代大鼠海馬c-fosmRNA表達(dá)水平的影響

AlCl34.0和8.0g·L-1組c-fosmRNA表達(dá)水平均低于對(duì)照組（P＜0.01），隨劑量增加而降低，具有劑量相關(guān)性（r=-0.979，P=0.021）。

2.5 鋁暴露對(duì)子代大鼠海馬CA1區(qū)c-Fos蛋白表達(dá)水平的影響

各染毒劑量組c-Fos蛋白表達(dá)水平低于對(duì)照組（P＜0.01），隨劑量增加而降低，具有劑量相關(guān)性（r=-0.943，P=0.057）（表3，圖2）。

Tab.3EffectofAlCl3onexpressionofc-fosmRNA andc-FosproteininCA1areaofhippocampusof offspringratsbyRT-PCRandimmunohistochemical analysis，respectively

Fig.2EffectofAlCl3onexpressionofc-Fosproteinin CA1areaofoffspringrathippocampusbyimmuno?histochemicalanalysis.SeeTab.1fordrugtreatment.The arrowsshowrepresentativehippocampalnervecells.

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，隨AlCl3染毒劑量增加，子代大鼠學(xué)習(xí)記憶能力受鋁損害加重，有劑量-效應(yīng)關(guān)系。相關(guān)研究也證實(shí)，染鋁子代大鼠表現(xiàn)為學(xué)習(xí)記憶等認(rèn)知功能障礙［5］。本研究觀察到染鋁子代大鼠的海馬鋁濃度增高，說明在此染鋁劑量下，鋁能穿越血腦屏障進(jìn)入子鼠腦內(nèi)并發(fā)生蓄積，這與相關(guān)報(bào)道一致［6-7］。本研究中子代大鼠生后3個(gè)月經(jīng)消化道染鋁直接導(dǎo)致其體內(nèi)鋁蓄積，與暴露劑量呈正相關(guān)，說明兩者之間存在因果聯(lián)系。推測(cè)鋁在腦內(nèi)逐漸蓄積，進(jìn)而對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)造成損害，鋁的神經(jīng)毒性與鋁在海馬內(nèi)的蓄積性有關(guān)。

突觸可塑性指突觸效能的改變，其效能的改變通常與突觸結(jié)構(gòu)的修飾有關(guān)［8］。微妙的突觸結(jié)構(gòu)變化能大大改變突觸的生物特性［9］。本研究顯示，染鋁大鼠海馬呈現(xiàn)神經(jīng)纖維稀疏、神經(jīng)元細(xì)胞脫失甚至空泡樣變性等特征性改變，隨著染鋁劑量增加而損傷明顯。此結(jié)果表明，染鋁造成海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)受損，或這些損傷弱化突觸活性或效能，可能是鋁降低大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的部分原因［10］。

海馬是學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的重要腦區(qū)，其中CA1區(qū)與學(xué)習(xí)記憶關(guān)系最為密切。IEG能被第二信使誘導(dǎo)，具有把短時(shí)程作用的細(xì)胞外信號(hào)和細(xì)胞功能的長(zhǎng)時(shí)程改變偶聯(lián)起來的功能。c-fos基因是典型的IEG，其編碼的Fos蛋白參與了中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)基因表達(dá)調(diào)控［11］。Fos蛋白作為核內(nèi)第三信使，通過激活異源二聚體復(fù)合物而激活后繼靶基因，較長(zhǎng)時(shí)間地改變神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)和功能，完成從第二信使到晚期基因表達(dá)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。本研究觀察到染鋁子代大鼠海馬c-fos mRNA和CA1區(qū)c-Fos蛋白表達(dá)水平明顯降低，且與劑量具有一定的負(fù)向劑量-效應(yīng)關(guān)系。揭示亞慢性鋁暴露造成海馬c-fos基因和其蛋白表達(dá)水平降低，激活后繼基因能力下降，進(jìn)而導(dǎo)致大鼠學(xué)習(xí)記憶能力受損。

IEG表達(dá)是在細(xì)胞內(nèi)突觸水平涉及長(zhǎng)時(shí)記憶鞏固的事件之一，在突觸可塑性修飾和記憶鞏固過程中起重要作用。c-F os具有使神經(jīng)元轉(zhuǎn)錄和翻譯長(zhǎng)時(shí)記憶相關(guān)蛋白的能力。據(jù)報(bào)道，ERK能通過pCREB上調(diào)c-Fos蛋白表達(dá)，并且激活ERK/ MAPK-CREB級(jí)聯(lián)反應(yīng)，包括ERK/MSK1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路［12-13］。因此，本研究中大鼠學(xué)習(xí)記憶能力低下與c-F os表達(dá)降低具有相關(guān)性，推測(cè)鋁可能影響上述c-F os相關(guān)的信號(hào)通路和關(guān)鍵分子。在未來工作中，需要從更深層次上進(jìn)一步研究證實(shí)。

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Effectofsubchronic aluminum exposure on learning and memory and c-Fos expression in CA1 area of hippocampus in Wistar rats

ZHANG Li-feng1，BAIChun-yu1，ZHANG Di1，ZHAO Li-ni2
（1.Department of Child and Adolescent Health and MaternalCare，Schoolof Public Health，2.Department of Pharmacology，Schoolof Basic MedicalSciences，Shenyang MedicalCollege，Shenyang 110034，China）

OBJECTIVE To study the effectof subchronic exposure to aluminum（Al）on learning，memory，and immediate early gene expression in rats，and to explore the toxic mechanism of Al on cognitive impairment of rats.METHODS Wistar offspring rats were administered with 2.0，4.0 and 8.0 g·L-1AlCl3in milk and drinking water in sequence from the postnatalday 1 to 3 months.Then，learning and memory of offspring rats were measured by Morris water maze,the hippocampal Alconcentration was quantitated by the atomic absorption spectrophotometer,the CA1 area of the hippocampus was collected for HE observation,and the c-fos gene and c-Fos protein expression in CA1 area ofthe hippo?campus in offspring rats were detected by RT-PCR and immunohistochemistry.RESULTS Learning and memory of offspring rats in AlCl3groups were significantly lower than those in control group（P＜0.01，P＜0.05）.The hippocampal Al concentrations of offspring rats in AlCl3groups were higher than those in controlgroup（P＜0.01）.The morphology in CA1 area of offspring rats′hippocampus in AlCl3groups exhibited sparse nerve fibers,depigmentation and even vacuolar degeneration in neurons and other pathologicalchanges after Altreatment；c-fos mRNA expression in the hippocampus in 4.0 and 8.0 g·L-1AlCl3group rats was significantly lower than in control and 2.0 g·L-1AlCl3group，respectively（P＜0.01）.c-Fos protein expression in offspring rats′hippocampus in AlCl3exposed groups was significantly lower compared with controlgroup（P＜0.01）.CONCLUSION Alcan injure learning and memory ofrats，which is related to hippocampalneuronaldysfunction in CA1 area induced by pathological changes，low levels of c-fos gene and c-Fos protein expression subsequently.

aluminum；hippocampus；learning and memory；c-Fos

The project supported by Science and Technology Research Project of Education Bureau in Liaoning Province（L2015544）；and Science and Technology Fund of Shenyang MedicalCollege（20153043）

ZHANG Li-feng，E-mail：zgykdxzlf@163.com

R995

A

1000-3002-（2016）05-0553-05

10.3867/j.issn.1000-3002.2016.05.011

2016-01-19接受日期：2016-03-18）

（本文編輯：沈海南）

遼寧省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（L2015544）；沈陽醫(yī)學(xué)院科技基金（20153043）

張立豐，男，副教授，醫(yī)學(xué)博士，主要從事金屬毒理和神經(jīng)毒理及兒童少年與婦幼衛(wèi)生保健研究。

張立豐，E-mail：zgykdxzlf@163.com