由淑萍，趙 軍，馬 龍，木克熱木·吐地買提，張石蕾，劉 濤

（1.新疆醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院毒理學教研室，新疆烏魯木齊830011；2.新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所，新疆烏魯木齊830004）

肉蓯蓉乙醇提取物抗大鼠免疫性肝纖維化的作用及其機制

由淑萍1，趙 軍2，馬 龍1，木克熱木·吐地買提1，張石蕾1，劉 濤1

（1.新疆醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院毒理學教研室，新疆烏魯木齊830011；2.新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所，新疆烏魯木齊830004）

目的探討肉蓯蓉乙醇提取物肉蓯蓉苯乙醇樣糖苷（CPhG）對大鼠免疫性肝纖維化的作用及其作用機制。方法SD大鼠75只，隨機分為正常對照組、模型組、復方鱉甲軟肝片（0.6 g·kg-1）陽性藥對照組、CPhG 0.125，0.25和0.5 g·kg-1組，CPhG組每組13只，其他每組12只，皮下和尾靜脈注射牛血清白蛋白誘導大鼠肝纖維化模型，造模同時ig給予相應藥物，每日1次，共15周。測定大鼠肝指數(shù)，Masson染色法觀察肝組織纖維化，全自動化分析儀測定血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）、堿性磷酸酶（ALP）、總蛋白（TP）和白蛋白（ALB）含量變化，羥脯氨酸（HyP）測定試劑盒測定肝勻漿中HyP含量的變化；免疫組化法觀察肝組織中Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白表達的變化。結(jié)果與正常對照組比較，模型組大鼠肝指數(shù)顯著升高（P＜0.05）。模型組大鼠肝組織膠原纖維延伸連接，包繞整個肝小葉使正常肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，大方型假小葉形成；模型組大鼠血清中GPT，GOT，ALP，TP和ALB含量及肝勻漿中HyP含量顯著升高（P＜0.05，P＜0.01），Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白的表達均顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，CPhG 0.125，0.25和0.5 g·kg-1能降低肝纖維化大鼠肝指數(shù)（P＜0.05），肝組織形態(tài)與正常對照組接近，血清中GPT，GOT，ALP，TP和ALB含量及肝勻漿中HyP含量降低（P＜0.05，P＜0.01），且能抑制肝組織中Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白的表達（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)論CPhG能降低免疫性大鼠肝纖維化程度，其機制可能與降低Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白表達進而抑制肝星狀細胞活化、減少膠原生成有關(guān)。

肉蓯蓉；苯乙醇樣糖苷；肝纖維化；膠原蛋白

肉蓯蓉屬（Cistanche）植物是著名的名貴補益類中藥。因其療效確切，藥性溫和，所以自古就被視為強壯、滋補的中藥，有“沙漠人參”之美譽。近年來，肉蓯蓉以其顯著的生物活性備受人們的關(guān)注。化學及藥理學研究顯示，肉蓯蓉肉蓯蓉苯乙醇樣糖苷（Cistanche phenylethanoid glycosides，CPhG）是肉蓯蓉發(fā)揮藥效的主要物質(zhì)基礎(chǔ)之一［1-2］。CPhG具有抗氧化、抗抑郁、抗炎、抗病毒、抗腫瘤、抗菌和免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性［3-6］。Peter于1989年首次發(fā)現(xiàn)CPhG類化合物松果菊苷具有顯著的保肝護肝作用，隨后引起人們對CPhG進行抗肝纖維化研究的興趣。本課題組的前期研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，肉蓯蓉的肉質(zhì)莖部提取物類葉升麻苷和異類葉升麻苷，對于體外免疫性肝損傷模型和HepG2.2.15細胞模型均有較好的肝保護作用和抗乙肝病毒作用［7］，但對于CPhG抑制肝纖維化的進程及抗肝纖維化的具體機制還未明確。本研究對大鼠皮下和尾靜脈注射牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）制備免疫性肝纖維化模型，評價肝損傷及纖維化的程度，以探討CPhG保肝、抗肝纖維化的作用及其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

管花肉蓯蓉（C.tabulosa）新鮮肉質(zhì)莖6.0 kg，70%乙醇熱回流提取3次，每次3 h，合并提取液。AB-8樹脂純化得到苯乙醇樣糖苷提取物即CPhG類化合物，經(jīng)新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所趙軍研究員用高效液相色譜法鑒定為CPhG，純度為70%。用0.5%羧甲纖維素鈉（CMC-Na）將藥物配制成不同濃度，置4℃冰箱保存待用。復方鱉甲軟肝片（compound Biejia-rangan tablets，BJRG）（內(nèi)蒙古福瑞科技股份有限公司，批號：20131006），BSA（美國Sigma公司產(chǎn)品，CAS：9048-46-8，原裝進口），羊毛脂（上海源葉生物科技公司），液體石蠟（天津市富宇精細化工有限公司），磷酸鹽緩沖液〔飛世爾生物化學制品（北京）有限公司，批號：NZD1132〕。肝組織羥鋪氨酸（hydroxyproline，HyP）檢測試劑（南京建成生物工程研究所，批號：20140526），兔抗Ⅰ型膠原抗體0.2 mL（美國Abcain公司，批號：140619），兔抗Ⅲ型膠原抗體0.2 mL（中國Bioss公司，批號：980788W）。電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司），立式壓力蒸汽滅菌器（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠），L-530多管架自動平衡離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司），全自動生化分析儀（邁瑞公司，系列號：A086A0182），化學發(fā)光分析儀（泰格科信，系列號：mp2808）。

1.2 動物、模型制備和給藥

雄性健康SD大鼠，SPF級，體質(zhì)量180～220 g，由新疆醫(yī)科大學實驗動物中心提供，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（新）2011-0004。SPF環(huán)境實驗動物使用許可證號：SYXK（新）2011-0004，飼養(yǎng)受控環(huán)境條件（25℃和12 h光/暗周期），大鼠自由進食與飲水，喂標準顆粒飼料，常規(guī)飼養(yǎng)3 d后使用。動物實驗的所有相關(guān)程序由新疆醫(yī)科大學第一臨床附屬醫(yī)院動物倫理委員會批準。

75只SD大鼠隨機分為6組，即正常對照組、模型組、BJRG陽性藥對照組（0.6 g·kg-1）、CPhG 0.125，0.25和0.5 g·kg-1組，CPhG組每組13只，其他每組12只。參照藥品說明書，進行人和大鼠間體表面積折算的等效劑量比值設(shè)定BJRG陽性藥對照組劑量，CPhG劑量參照文獻［8］及預實驗結(jié)果設(shè)置。除正常對照組外，大鼠采用朱啟貴等［9］方法制備免疫性肝纖維化模型，造模分為致敏階段和尾靜脈攻擊階段。致敏階段：除正常對照組每只注射0.5 mL生理鹽水以外，其余各組大鼠均多點sc給予含BSA 9 g·L-1弗氏不完全佐劑，每次0.5 mL，共5次。前2次注射間隔為14 d，后3次注射間隔為7 d。末次致敏注射后1周，每只大鼠于眼內(nèi)呲靜脈叢采血，采用雙向擴散法檢測大鼠血清抗BSA抗體。攻擊階段：抗體陽性大鼠作為模型組及給藥組，繼續(xù)尾靜脈注射BSA，每周2次，連續(xù)5周，注射劑量由每只2 mL逐漸遞增至每只4 mL；正常對照組尾靜脈注射生理鹽水。給藥：造模同時按設(shè)定劑量ig給藥（空白對照組和模型組ig給予蒸餾水）每日1次；造模結(jié)束后繼續(xù)治療4周，每日1次，實驗周期共計15周。

1.3 肝指數(shù)測定

各組于末次ig后禁食（不禁水）24 h，稱重，頸椎脫臼處死，取肝，用濾紙吸干臟器表面血液，剪去脂肪和系膜后稱重，計算肝指數(shù)。肝指數(shù)=器官質(zhì)量（g）/體質(zhì)量（g）×100。

1.4 Masson染色觀察肝組織纖維化

所有大鼠取同一部位肝組織，用10%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，切片并Masson染色，顯微鏡下觀察組織學變化。肝纖維化分級參照文獻［10］分為5級。0級：無纖維化；Ⅰ級：纖維結(jié)締組織僅限于匯管區(qū)或匯管區(qū)有擴大，有向小葉發(fā)展的傾向；Ⅱ級：纖維結(jié)締組織增生，超過小葉的2/3并伴有Ⅰ級改變；Ⅲ級：纖維結(jié)締組織進入肝小葉中央靜脈周圍；Ⅳ級：纖維結(jié)締組織在全小葉呈多處彌漫性增生，有假小葉形成，并有Ⅲ級改變。

1.5 血清生化指標的檢測

各組大鼠于末次給藥后禁食（不禁水）24 h，稱重，經(jīng)戊巴比妥鈉（30 mg·kg-1，ip）麻醉后取血，12 000×g離心10 min分離血清，采用全自動生化儀檢測血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（glutamic-pyruvic transferase，GPT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（glutamic-oxalacetic transferase，GOT）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、總蛋白（total protein，TP）和白蛋白（albumin，ALB）含量。

1.6 肝組織勻漿中羥脯氨酸含量的測定

精確稱取肝組織0.1 g（濕重）放入試管中，準確加水解液1 mL，混勻。嚴格按照肝組織HyP檢測試劑盒說明書操作測定肝組織HyP的含量。

1.7 免疫組化法測定肝組織纖維化Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白表達

組織切片用Nikon DIGITAL SIGHTDS-Fi2型生物顯微鏡進行觀察，并用K12320型顯微攝像系統(tǒng)在低倍鏡、高倍鏡下選取清晰視野拍照。采用Motic Med 6.0 CMIAS彩色圖像分析軟件，通過顯微攝像系統(tǒng)放大200倍，每片隨機選取3個視野，每個視野隨機選取5個2 cm×3 cm大小的區(qū)域，Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白免疫組化陽性反應產(chǎn)物為出現(xiàn)位于細胞漿的棕黃色細顆粒狀染色，測定其平均吸光度值，值越大表明組織中Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白含量越高。計算公式：吸光度值=膠原面積（cm2）/肝組織面積（cm2）。

1.8 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 肉蓯蓉乙醇提取物對BSA致肝纖維化大鼠體質(zhì)量和肝指數(shù)的影響

由表1可見，與正常對照組比較，模型組大鼠體質(zhì)量減輕，肝指數(shù)增加（P＜0.05）；與模型組比較，BJRG組及CPhG 0.125，0.25和0.5 g·kg-1組大鼠體質(zhì)量增加，肝指數(shù)下降（P＜0.05），表明注射BSA后大鼠肝細胞受損，CPhG對大鼠肝損傷具有一定的防護作用。

2.2 肉蓯蓉乙醇提取物對BSA致肝纖維化大鼠肝組織纖維化的影響

由圖1可見，正常對照組大鼠肝組織并無異常，未見炎細胞浸潤，肝小葉結(jié)構(gòu)完整清晰，肝細胞呈索狀分布，未見有不規(guī)則血竇，匯管區(qū)無擴大。模型組大鼠呈Ⅲ～Ⅳ級纖維化，膠原纖維延伸鏈接，包繞整個肝小葉使正常肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，假小葉形成，但以大方型假小葉為主。陽性藥BJRG組和CPhG組治療效果顯著，病理組織切片示形態(tài)基本上與正常對照組接近。

根據(jù)Masson染色的肝纖維化標準評分，與正常組比較，模型組肝纖維化程度顯著增加（P＜0.01）；陽性藥BJRG組和CPhG 0.125，0.25和0.5 g·kg-1組肝纖維化程度顯著低于模型組（P＜0.01）。Ridit分析表明，CPhG對免疫性肝纖維化有防治作用（表2）。

2.3 肉蓯蓉乙醇提取物對BSA致肝纖維化大鼠肝功能的影響

表3可見，與正常對照組比較，模型組大鼠血清GPT，GOT和ALP活性及TP含量顯著增加（P＜0.05，P＜0.01），ALB含量顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，BJRG組和CPhG組大鼠血清GPT，GOT和ALP活性及TP含量降低（P＜0.05，P＜0.01），ALB含量增加（P＜0.05，P＜0.01）。表明CPhG對BSA誘導的大鼠肝細胞損傷具有一定的防護作用。

Tab.1 Effect of Cistanche phenylethanoid glycosides（CPhG）on body mass and liver index in hepatic fibrosis rats induce by bovine serum albumin（BSA）

Fig.1 Effect of CPhG on histopathological changes of liver tissues in hepatic fibrosis rats（Masson）.Arrows show that fibrous tissue of the centralleaflet was proliferated into the liver parenchyma，and that collagen fibers extended their links around the entire lobule.

2.4 肉蓯蓉乙醇提取物對BSA致肝纖維化大鼠肝組織中HyP含量的影響

表4結(jié)果顯示，與正常對照組比較，模型組大鼠肝組織中HyP含量顯著增加（P＜0.01）；與模型組比較，CPhG 0.125，0.25和0.5 g·kg-1組和BJRG組HyP含量顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。表明CPhG減少了細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）在肝內(nèi)的沉積。

2.5 肉蓯蓉乙醇提取物對BSA致肝纖維化大鼠肝組織Ⅰ型和Ⅲ型膠原表達的影響

表5可見，與正常對照組相比，模型組肝組織Ⅰ型和Ⅲ型膠原表達升高（P＜0.01）。與模型組相比，陽性藥BJRG組和CPhG 0.125，0.25和 0.5 g·kg-1組大鼠肝組織中Ⅰ型和Ⅲ型膠原表達降低（P＜0.05，P＜0.01），其中以CPhG 0.5 g·kg-1組最為顯著。表明CPhG對大鼠肝纖維化具有預防及治療作用，能減輕大鼠膠原纖維增生程度，與肝組織形態(tài)觀察結(jié)果一致。

Tab.2 Effect of CPhG on levelof histopathologicalchanges of hepatic fibrosis rats induced by BSA

Tab.3 Effect of CPhG on serum glutamic-pyruvic transferase（GPT），glutamic-oxalacetic transferase(GOT)，alkaline phosphatase（ALP），totalprotein（TP）and albumin（ALB）of hepatic fibrosis rats induced by BSA

Tab.4 Effect of CPhG on hydroxyproline（HyP）content of hepatic fibrosis rats induced by BSA

Tab.5 Effect of CPhG on expression of collagens typeⅠand typeⅢin BSA-induced hepatic fibrosis rats

3 討論

肝纖維化是肝遭受反復或慢性損傷后的一種損傷與修復過程，主要與慢性炎癥和引起慢性肝損傷的化學因素相關(guān)［11-13］，已成為發(fā)病率和死亡率都很高的一個世界醫(yī)學難題，各種肝病多數(shù)經(jīng)肝纖維化最后發(fā)展為晚期的肝硬變，成為肝病死亡的主要原因［14］。本研究采用BSA免疫性肝纖維化大鼠模型，BSA免疫后大鼠經(jīng)10次尾靜脈攻擊注射BSA后，其肝組織結(jié)構(gòu)受到嚴重破壞，炎性細胞浸潤，由膠原纖維構(gòu)成的纖維間隔正在或已形成。據(jù)報道，BSA免疫損傷所致的肝纖維化與臨床上的慢性肝炎所致的肝纖維化在發(fā)病機制上更加接近，適用于抗原抗體復合物反應所致的肝纖維化機制、防治和中藥篩選研究，纖維化可＞260 d［15］。

本研究使用BSA誘導的大鼠免疫性肝纖維化模型的結(jié)果與明志君等［16］和張桂靈等［17］研究報道一致，提示本研究成功復制了免疫性肝纖維化模型。CPhG干預可降低血清GPT，GOT，ALP，TP和ALB水平，表現(xiàn)出抗大鼠肝纖維化的作用，長期使用CPhG不會對肝功能造成不良影響。

本研究結(jié)果表明，預防性地給予CPhG治療，能有效地抑制肝纖維化進程，減輕病變程度，且隨給藥劑量增大，改善更為明顯。提示CPhG對肝纖維化具有較好的防治作用，與BJRG陽性對照組效果相當。

肝纖維化也是向肝硬變發(fā)展的中心環(huán)節(jié)。據(jù)報道，細胞因子參與了門靜脈高壓和肝纖維化的形成［18］。肝纖維化的顯著特征是Ⅰ和Ⅲ型膠原及玻璃酸（透明質(zhì)酸）等ECM合成與降解失去平衡導致ECM沉積，特別是與Ⅰ和Ⅲ型膠原的沉積有關(guān)［19］，占ECM總量＞80%。正常肝ECM中Ⅰ型膠原與Ⅲ型膠原比值為1；肝纖維化時，肝內(nèi)膠原增加5～7倍以上，Ⅲ型膠原通常發(fā)生在纖維化早期，Ⅰ型膠原則在纖維化晚期增加最顯著，故Ⅰ和Ⅲ型膠原的增生與肝纖維化程度成正相關(guān)。而肝纖維化是ECM合成與降解失衡的動態(tài)過程［20］。本研究發(fā)現(xiàn)，CPhG減少了ECM在肝內(nèi)的沉積，進一步表明CPhG對實驗性肝纖維化有防治作用。

采用免疫組化檢測肝組織Ⅰ和Ⅲ型膠原含量變化可以客觀、直接觀察到CPhG抗肝纖維化的治療效果。本研究顯示，CPhG組大鼠肝組織中Ⅰ和Ⅲ型膠原僅見于中央靜脈周圍及匯管區(qū)，著色減少且淺，呈細絲狀，免疫組化染色呈弱陽性，提示CPhG能減少膠原生成，抑制肝纖維化進程，其機制可能是通過抑制肝星狀細胞的激活，減少ECM合成，從而發(fā)揮抗纖維化作用。

綜上所述，CPhG抗大鼠肝纖維化的作用機制可能為抑制膠原生成，促進膠原降解，降低肝纖維化大鼠肝組織中膠原及HyP含量，從而抑制ECM的合成、起到抗肝纖維化的作用，具體的作用機制還有待深入研究。

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Effect and mechanism of Cistanche phenylethanoid glycosides on rats with immunologicalliver fibrosis

YOU Shu-ping1，ZHAO Jun2，MA Long1，Mukaram TUDIMAT1，ZHANG Shi-lei1，LIU Tao1
（1.Department of Toxicology，College of Public Health，Xinjiang MedicalUniversity，Urumqi830011，China；2.Institute of Materia Medica，Xinjiang Uygur Autonomous Region，Urumqi 830004，China）

OBJECTIVE To study the anti-fibrotic effect of Cistanche phenylethanoid glycosides（CPhG）in bovine serum albumin（BSA）-induced liver fibrosis in rats and its possible mechanism METHODS Seventy-five SD rats were randomly divided into six groups：normalcontrol（distilled watertreated），model（BSA-treated），positive drug〔BSA-treated+compound Biejiarangan tablets（BJRG）0.6 g·kg-1〕，and BSA-treated+CPhG（0.125，0.25 and 0.5 g·kg-1）groups.There were thirteen rats ineach BSA-treated+CPhG（0.125，0.25 and 0.5 g·kg-1）group and twelve rats in othergroups.Subcutaneous injection and tailvein injection of BSA immunity were used to induce the ratliverfibrosis model.Meanwhile，differenttherapeutic drugs were ig adminstered to rats.After the experimentalperiod，rats were fasted for 12 h prior to 10%chloralhydrate administration and immediately euthanized.The liver was weighed to calculate the liver index.Glutamic-pyruvic transaminase（GPT），glutamic-oxalactic transaminase（GOT），alkaline phosphatase（ALP），totalprotein（TP）and albumin（ALB）were evaluated by the Mind-R ay automatic biochemicalanalyzer.The density of hydroxyproline（HyP）in liver tissues was determined using a spectrophotometric method according to the kit′s instructions.Histopathologicalchanges and expressions oftypeⅠand typeⅢcollagens in liver tissues were also determined by immunohisto?chemicalstaining.RESULTS Compared with the normalcontrolgroup，collagen fibers of liver tissues in the model group extended their links and enveloped the entire lobule，causing lobular structural damage and the formation ofpseudolobules.The liver index（P＜0.05），GPT，GOT，ALP，TP and ALB serum levels（P＜0.05），HyP content（P＜0.01）were significantly increased，so was the expression oftypeⅠcollagens and typeⅢcollagens（P＜0.01）in the modelgroup.Compared with modelgroup，various doses（0.125，0.25 and 0.5 g·kg-1）of CPhG significantly reduced the BSA-induced elevation of the liver index；GPT，GOT，ALP，TP and ALB serum levels（P＜0.05），and HyP contentdecreased（P＜0.01）；the morphology of the pathologicaltissue sections was close to that of the normalcontrolgroup，and CPhG significantly reduced the expression of two types of collagens（P＜0.01）.CONCLUSION CPhG can significantly reduce the degree of BSA-induced liver fibrosis in rats.The mechanism may be associated with down-regulation oftwo types ofcollagens and suppression ofthe activation ofhepatic stellate cells.

Cistanche；phenylethanoid glycosides；liver fibrosis；bovine serum albumin；type collagen

The projectsupported by NationalNatural Science Foundation of China（81260624）

LIU Tao，E-mail：xjmult@163.com，Tel：（0991）4365561

R285.5

A

1000-3002-（2016）05-0504-07

10.3867/j.issn.1000-3002.2016.05.004

2015-06-23接受日期：2016-04-10）

（本文編輯：賀云霞）

國家自然科學基金資助項目（81260624）

由淑萍，女，博士研究生；劉濤，女，教授，碩士研究生導師，主要從事食品毒理學研究。

劉濤，E-mail：xjmult@163.com，Tel：（0991）4365561