劉立峰，李俠，潘玉濤，陳滌，劉養(yǎng)洲，普星宇，王喆，李增春

（同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院創(chuàng)傷骨科，上海 200120）

不同濃度褪黑素對人骨肉瘤MG?63細(xì)胞增殖的影響

劉立峰，李俠，潘玉濤，陳滌，劉養(yǎng)洲，普星宇，王喆，李增春

（同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院創(chuàng)傷骨科，上海 200120）

目的檢測不同濃度褪黑素對體外培養(yǎng)的人骨肉瘤細(xì)胞系MG?63細(xì)胞增殖的影響，為更好地應(yīng)用褪黑素輔助治療骨科疾病提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法在體外培養(yǎng)的MG?63細(xì)胞中，外源性加入1 nmol/L～10 mmol/L濃度褪黑素，用CCK?8的方法檢測不同濃度褪黑素對細(xì)胞增殖的影響，用PI染色流式細(xì)胞術(shù)檢測其對細(xì)胞周期分布的影響。結(jié)果CCK?8分析發(fā)現(xiàn)4～10 mmol/L濃度的褪黑素可以以一種時間依賴性和劑量依賴性的方式顯著抑制MG?63細(xì)胞的增殖，而1 nmol/L～2 mmol/L濃度的褪黑素對MG?63細(xì)胞的增殖沒有顯著影響。無論將MG?63細(xì)胞周期同步還是非同步，流式細(xì)胞儀的檢測顯示，4～10 mmol/L濃度褪黑素可以顯著增加細(xì)胞周期G0/G1期的比例，同時減少S和G2/M期的比例；而1 nmol/L～2 mmol/L濃度褪黑素對MG?63細(xì)胞周期的分布沒有顯著影響。結(jié)論褪黑素可以以一種時間依賴性和劑量依賴性方式抑制骨肉瘤MG?63細(xì)胞的增殖，這種抑制效應(yīng)與細(xì)胞周期分布的改變和G0/G1期停滯有關(guān)。

褪黑素；骨肉瘤；增殖；細(xì)胞周期

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骨肉瘤是一種最常見的原發(fā)惡性骨腫瘤。研究［1?2］顯示骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展與青春期骨骼的快速生長和骨骼的成熟度密切相關(guān)。褪黑素是一種主要由松果體合成分泌的激素［3］，骨的代謝與體內(nèi)褪黑素水平密切相關(guān)［4］，對成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞都具有調(diào)節(jié)作用［5?7］，骨髓細(xì)胞也可以從頭合成［8］。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)褪黑素在許多腫瘤細(xì)胞中具有抗腫瘤效應(yīng)［9］，但PANZER等［10］認(rèn)為褪黑素的抗腫瘤效應(yīng)與細(xì)胞類型有關(guān)，對骨肉瘤細(xì)胞無效，鑒于褪黑素具有無毒、能增強(qiáng)許多化療藥物的抗腫瘤效應(yīng)和減少化療藥物的毒副反應(yīng)的特性［11］，故研究單獨(dú)應(yīng)用褪黑素或者聯(lián)合其他化療藥物治療骨肉瘤具有重要的理論和實(shí)踐意義。本研究的目的是檢測不同濃度褪黑素對人骨肉瘤MG?63細(xì)胞增殖的影響，探討褪黑素是否具有抑制人骨肉瘤MG?63細(xì)胞增殖的能力，為更好地應(yīng)用褪黑素輔助治療骨肉瘤等疾病提供一定的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

人類骨肉瘤MG?63細(xì)胞系被培育在添加10%胎牛血清（HyClone公司）的DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司）中，在含有5%CO2和37℃的條件下培養(yǎng)，每隔1 d更換1次培養(yǎng)基。MG?63細(xì)胞以104/cm2的密度接種到培養(yǎng)皿中，24 h后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。褪黑素的母液用含有100%的DMSO（Sigma公司）制備，隨后根據(jù)待檢測的濃度用培養(yǎng)基做1個梯度稀釋；在最后檢測時，保證對照組和實(shí)驗(yàn)組的培養(yǎng)基中含有相同濃度的0.2%DMSO和10%胎牛血清。褪黑素和CCK?8試劑盒購買于Sigma公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞增殖分析：用CCK?8染色的方法檢測不同濃度褪黑素對骨肉瘤MG?63細(xì)胞增殖的影響。將MG?63細(xì)胞以4 000個/孔的密度接種到96孔板上，24 h后培養(yǎng)基換成含有1 nmol/L～10 mmol/L濃度褪黑素的培養(yǎng)基（對照組換成含有0.2%DMSO的培養(yǎng)基），再分別培養(yǎng)24 h、48 h和72 h。然后根據(jù)說明書指示，每孔加入20 μL的CCK?8溶液，并設(shè)立空白對照組（加了相應(yīng)量細(xì)胞培養(yǎng)液、褪黑素和CCK?8溶液但沒有加入細(xì)胞的孔），在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育2 h，然后在450 nm測定吸光度。數(shù)據(jù)以對照組細(xì)胞OD值的百分比表示。

1.2.2細(xì)胞周期分析：將MG?63細(xì)胞以1×105/孔的密度接種到6孔板上，24 h后培養(yǎng)基被換成含有1 nmol/L～10 mmol/L濃度褪黑素的培養(yǎng)基（對照組換成含有相同0.2%DMSO的培養(yǎng)基），再培養(yǎng)24 h。然后細(xì)胞用胰酶消化離心，用冰冷的PBS溶液沖洗2次，固定在75%乙醇中，4℃條件下過夜。過夜后，細(xì)胞再次用PBS漂洗，懸浮在0.5 mL的PBS溶液中（還含有100 μg/mL PI、0.1%Triton X?100、0.003 7% EDTA和0.2 mg/mL DNase?free RNase），樣品在避光下室溫放置30 min，隨后每10 000個細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測，用Modfit LT 3.0軟件（BD公司）檢測樣品中G0/G1、S和G2/M期細(xì)胞的比例。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。雙因素方差分析用來評價褪黑素的劑量、暴露的時間和二者之間的相互作用造成的不同是否有意義，Bonferroni檢驗(yàn)和Dunnett T3檢驗(yàn)用來評價隨后的兩兩比較，polynomial contrast用來進(jìn)行趨勢分析。單因素方差分析用來評價各個處理組之間的不同是否有意義。所有的數(shù)據(jù)用至少3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的x±s表示。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1不同濃度褪黑素對增殖的影響

用CCK?8染色的方法檢測不同濃度（1 nmol/L～10 mmol/L）褪黑素對骨肉瘤MG?63細(xì)胞增殖的影響。褪黑素在MG?63細(xì)胞上誘導(dǎo)了一種劑量依賴性和時間依賴性的抗增殖效應(yīng)，這種效應(yīng)與二者的相互作用有關(guān)（P均＜0.01），見圖1。

圖1　不同濃度褪黑素對骨肉瘤MG?63細(xì)胞增殖的影響Fig.1　Effect of melatonin at various concentrations on the MG?63 cell proliferation

在4～10 mmol/L濃度時，褪黑素顯著地抑制了骨肉瘤MG?63細(xì)胞的增殖（雙因素方差分析為所有P＜0.01。單因素方差分析為24 h，所有P＜0.05；48 h，所有P＜0.01；72 h，所有P＜0.05），而1 mmol/L和2 mmol/L濃度褪黑素輕微的抑制了骨肉瘤MG?63細(xì)胞的增殖（雙因素方差分析為1 mmol/L，P=0.748；2 mmol/L，P=0.113。單因素方差分析為24 h，1 mmol/L，P=0.135，2 mmol/L，P=0.110；48 h，1 mmol/L，P= 0.301，2 mmol/L，P=0.112；72 h，1 mmol/L，P=0.181，2 mmol/L，P=0.071）。

1 nmol/L～100 μmol/L濃度的褪黑素對骨肉瘤MG?63細(xì)胞的增殖沒有影響（P均＞0.05）。在檢測的24 h與48 h和72 h時間點(diǎn)之間，MG?63細(xì)胞的增殖表現(xiàn)出一種顯著的差異（P均＜0.05），且隨著細(xì)胞暴露到褪黑素時間的增加，其抑制效應(yīng)增強(qiáng)（P＜0.01）。

2.2細(xì)胞周期非同步時不同濃度褪黑素對細(xì)胞周期分布的影響

為了檢測褪黑素在細(xì)胞增殖上的影響是否與細(xì)胞周期分布的改變有一定關(guān)系，本研究用流式細(xì)胞術(shù)檢測了MG?63細(xì)胞周期的分布情況。流式細(xì)胞儀分析顯示，在細(xì)胞暴露到不同濃度的褪黑素24 h以后，與對照組細(xì)胞相比，4～10 mmol/L濃度的褪黑素顯著地增加了細(xì)胞周期中G0/G1期細(xì)胞的比例，而同時減少了S期和G2/M期細(xì)胞的比例（P均＜0.01）。此外，1～2 mmol/L濃度的褪黑素誘導(dǎo)了一種抑制細(xì)胞周期進(jìn)展效應(yīng)，但是這種效應(yīng)差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見圖2。此外，1 nmol/L～100 μmol/L濃度的褪黑素對骨肉瘤細(xì)胞周期的分布沒有影響。

圖2　不同濃度褪黑素在未同步化的骨肉瘤MG?63細(xì)胞周期分布上的影響Fig.2　Effect of melatonin at various concentrations on cell cycle distribution in the unsynchronized MG?63 cells

2.3細(xì)胞周期同步后不同濃度褪黑素對細(xì)胞周期分布的影響

為了更好地觀察不同濃度褪黑素對人骨肉瘤MG?63細(xì)胞增殖的影響，本研究把人骨肉瘤細(xì)胞通過無血清培養(yǎng)36～48 h，使MG?63細(xì)胞被同步到G0期，再重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，上述的變化更明顯，見圖3。

圖3　不同濃度褪黑素在同步化的骨肉瘤MG?63細(xì)胞周期分布上的影響Fig.3　Effect of melatonin at various concentrations on cell cycle distribution in the synchronized MG?63 cells

3　討論

褪黑素可以在許多生物調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮作用，如生物周期節(jié)律、睡眠、衰老、生殖、骨生理和腫瘤的生長等［12］。越來越多的證據(jù)顯示，褪黑素水平的下降與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和惡化密切相關(guān)。另外，褪黑素可以減緩化療藥物所誘導(dǎo)的無力、口腔炎、神經(jīng)毒性和心臟毒性等副作用。1個隨機(jī)對照的meta分析［11］指出，褪黑素作為一種輔助治療可以明顯延緩腫瘤的進(jìn)展、提高1年生存率和減緩放化療所引起的副反應(yīng)。研究［1?4］顯示，體內(nèi)褪黑素水平的下降可能是引起骨肉瘤發(fā)生和發(fā)展的原因之一。但有研究［10］已經(jīng)指出，褪黑素對骨肉瘤MG?63細(xì)胞的生長、形態(tài)和細(xì)胞周期分布沒有影響。本研究發(fā)現(xiàn)雖然1 nmol/L～2 mmol/L濃度的褪黑素不能有效地抑制骨肉瘤MG?63細(xì)胞的增殖，但4～10 mmol/L濃度的褪黑素可以顯著地誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯。本研究的結(jié)果指出了探索用褪黑素輔助治療骨肉瘤的可能性。

與先前研究［10］一致的是，1 nmol/L～10 μmol/L濃度的褪黑素沒有顯著影響骨肉瘤MG?63細(xì)胞的生長和細(xì)胞周期的分布；而4mmol/L～10 mmol/L濃度的褪黑素對骨肉瘤MG?63細(xì)胞誘導(dǎo)了一種顯著的劑量依賴性和時間依賴性抑制效應(yīng)，表明褪黑素具有抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖的能力，與其使用的濃度有關(guān)。關(guān)于引起這種有趣現(xiàn)象的原因，筆者認(rèn)為當(dāng)褪黑素的濃度達(dá)到某個閾值時，一些潛在的信號通路被激活，導(dǎo)致骨肉瘤MG?63細(xì)胞增殖被抑制。褪黑素的這種抑制骨肉瘤MG?63細(xì)胞增殖的可能潛在機(jī)制是值得進(jìn)一步深入研究的。

1 mmol/L濃度的褪黑素誘導(dǎo)了正常成骨細(xì)胞系hFOB 1.19細(xì)胞周期的停滯［5］，但是沒有顯著地抑制骨肉瘤MG?63細(xì)胞的增殖，表明在正常成骨細(xì)胞和異常成骨細(xì)胞之間有顯著的不同。引起這種現(xiàn)象的原因目前還不清楚，值得進(jìn)一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)4 mmol/L濃度的褪黑素可以通過調(diào)控細(xì)胞周期的G0/G1、S和G2/M期的分布誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯。同樣，當(dāng)細(xì)胞暴露到4 mmol/L及更高濃度的褪黑素中，G0/G1期細(xì)胞的比例被明顯地增加，而S和G2/M期細(xì)胞的比例被相應(yīng)減少。

本研究結(jié)果表明，褪黑素具有抑制骨肉瘤MG?63細(xì)胞增殖的能力。褪黑素對某些腫瘤細(xì)胞沒有抑制作用的原因可能是由于其使用的濃度不恰當(dāng)。因此，褪黑素的抗腫瘤效應(yīng)很大程度上取決于其使用濃度，并且更高濃度的褪黑素也應(yīng)該在其他腫瘤細(xì)胞中被檢測。

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（編輯于溪）

Influence of Melatonin at Different Concentrations on Cell Proliferation in Human MG?63 Osteosarcoma Cells

LIU Lifeng，LI Xia，PAN Yutao，CHEN Di，LIU Yangzhou，PU Xingyu，WANG Zhe，LI Zengchun

（Department of Trauma Orthopaedics，Shanghai East Hospital，Tongji University School of Medicine，Shanghai 200120，China）

ObjectiveTo investigate the in vitro effect of melatonin at various concentrations on cell proliferation in human MG?63 osteosarcoma cells，so as to provide an experimental basis for the better application of melatonin in the treatment of diseases in Department of orthopedics.Meth?odsMelatonin at 1 nmol/L?10 mmol/L concentrations was exogenously added to in vitro cultured MG?63 cells，and the CCK?8 method was used to analyze the effect of melatonin at various concentrations on cell proliferation and flow cytometry with PI staining was used to detect their effect on cell cycle distribution.ResultsCCK?8 analysis indicated that melatonin at 4?10 mmol/L significantly inhibited the proliferation of MG?63 cells in a time?and dose?dependent manner，and melatonin at 1 nmol/L?2 mmol/L has no significant action on the proliferation of MG?63 cells.Flow cytom?etry assay showed that melatonin at 4?10 mmol/L significantly increased the proportion of G0/G1phase of the cell cycle while simultaneously re?duced the proportion of the G2/M and S phases；however，melatonin at 1 nmol/L?2 mmol/L has no significant effect on MG?63 cell cycle distribution regardless after MG?63 cell cycle synchronization or non?synchronization.ConclusionMelatonin can inhibit the proliferation of MG?63 cells in a time?dependent and dose?dependent manner，which is related to the change of cell cycle and the G0/G1phase arrest of cell cycle.

melatonin；osteosarcoma；proliferation；cell cycle

R816.8

A

0258-4646（2016）11-1017-05

10.12007/j.issn.0258?4646.2016.11.014

上海市浦東新區(qū)衛(wèi)生系統(tǒng)優(yōu)秀青年醫(yī)學(xué)人才培養(yǎng)（PWRq2013?15）；上海市衛(wèi)生局面上項(xiàng)目（20134212）；同濟(jì)大學(xué)青年優(yōu)秀人才培養(yǎng)行動計劃（1507219028）

劉立峰（1978-），男，講師，博士.

李增春，E-mail：drlizc@163.com

2016-04-27

網(wǎng)絡(luò)出版時間：