王軻,王亮

(天津市濱海新區(qū)塘沽林業(yè)工作站,天津 300450)

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PCR技術(shù)在野生動(dòng)物疫源疫病檢測(cè)中的應(yīng)用

王軻,王亮

(天津市濱海新區(qū)塘沽林業(yè)工作站,天津 300450)

摘要：指出了野生動(dòng)物疫源疫病檢測(cè)工作在整個(gè)野生動(dòng)物疫源疫病監(jiān)測(cè)防控體系中占據(jù)著非常重要的作用,介紹了在疫源疫病檢測(cè)中常用的PCR方法,包括普通RT-PCR、免疫PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR等,以期為野生動(dòng)物疫源疫病的檢測(cè)提供參考。

關(guān)鍵詞：疫源疫病;PCR;檢測(cè),實(shí)時(shí)熒光定量

1引言

野生動(dòng)物疫源疫病監(jiān)測(cè)防控是當(dāng)前林業(yè)工作的一項(xiàng)重要任務(wù),包含了監(jiān)測(cè)、檢測(cè)、預(yù)警和防控等一系列工作,其中檢測(cè)工作在整個(gè)野生動(dòng)物疫源疫病監(jiān)測(cè)防控體系中發(fā)揮著非常重要的作用。野生動(dòng)物疫源疫病檢測(cè)分為常規(guī)檢測(cè)和疫情檢測(cè),常規(guī)檢測(cè)主要是在野生動(dòng)物疫源疫病流行高峰期,對(duì)救治的野生動(dòng)物和隨機(jī)捕捉的野生動(dòng)物進(jìn)行糞便、血液和羽毛采樣并檢測(cè);疫情檢測(cè)是對(duì)死亡的野生動(dòng)物進(jìn)行采樣檢測(cè),分析確定是否發(fā)生疫情。

野生動(dòng)物疫病種類繁多,危害性大,在野生動(dòng)物種群之間傳播速度快,且易傳染給人類,威脅社會(huì)公眾衛(wèi)生安全。如高致病性禽流感是危害野生候鳥最常見的高度接觸性、急性傳染病,近幾年我國(guó)出現(xiàn)多次人感染高致病性禽流感的案例,嚴(yán)重威脅社會(huì)安全。因此,完善野生動(dòng)物疫源疫病監(jiān)測(cè)防控體系,建立野生動(dòng)物疫源疫病檢測(cè)專業(yè)實(shí)驗(yàn)室,提高檢測(cè)水平,對(duì)于保護(hù)野生動(dòng)物資源和社會(huì)生態(tài)安全有著非常重要的作用。PCR技術(shù)是一種基于DNA變性與復(fù)性原理,高效擴(kuò)增體外特定DNA片段的技術(shù)[1],這種技術(shù)具有快速高效、操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、特異性強(qiáng)、批量檢測(cè)和痕量檢測(cè)等特征,目前被應(yīng)用于生物學(xué)基因鑒定、實(shí)驗(yàn)和疫源疫病檢測(cè)等領(lǐng)域。常規(guī)PCR是所有由PCR技術(shù)衍生出來的檢測(cè)方法的技術(shù),在野生動(dòng)物疫源疫病檢測(cè)中常用的有普通RT-PCR技術(shù)、免疫PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)等。

2普通RT-PCR

反轉(zhuǎn)錄PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)技術(shù)是將RNA的反轉(zhuǎn)錄和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增相結(jié)合,被廣泛應(yīng)用于基因診斷、病原微生物檢測(cè)等,相比傳統(tǒng)病毒分離鑒定試驗(yàn)靈敏度高,特異性強(qiáng),周期短,可以為病毒的早期診斷提供快速、準(zhǔn)確的方法。普通PCR技術(shù)已經(jīng)無法滿足多病原體的快速鑒別診斷,因此在常規(guī)RT-PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來雙重和多重RT-PCR技術(shù),這種技術(shù)能在單個(gè)反應(yīng)體系中同時(shí)檢測(cè)多重病毒[6],具有高特異性、高效率、低成本等特點(diǎn),適合大量樣本的檢測(cè)。

制定林業(yè)經(jīng)營(yíng)方案必須要對(duì)資源蓄積消長(zhǎng)情況作時(shí)間性分析比對(duì)。這些資源在每個(gè)時(shí)間段端點(diǎn)蓄積情況的精準(zhǔn)數(shù)據(jù)就來源于林業(yè)檔案記載。由此看來,林業(yè)檔案所反映的情況,必須要真實(shí)、可靠,既是對(duì)現(xiàn)實(shí)經(jīng)營(yíng)提供科學(xué)的依據(jù),更是為備考的歷史資料作保存。做好林業(yè)檔案工作是對(duì)歷史真實(shí)性的負(fù)責(zé)。

3.4為制定區(qū)域性林業(yè)發(fā)展、環(huán)境保護(hù)等戰(zhàn)略性規(guī)劃提供依據(jù)

隨著計(jì)算機(jī)大數(shù)據(jù)庫的發(fā)展,林業(yè)檔案資料實(shí)施電子化管理,建立網(wǎng)絡(luò)化資源共享平臺(tái),讓人類社會(huì)對(duì)林業(yè)事業(yè)的發(fā)展有著共同的認(rèn)識(shí),讓林業(yè)檔案中的林業(yè)文化事業(yè)為社會(huì)經(jīng)濟(jì)繁榮發(fā)展作出重大貢獻(xiàn)。

4結(jié)語

(1)林業(yè)檔案是林業(yè)單位或管理部門不可缺少的寶貴財(cái)富資源和有價(jià)值的、歷史的文化遺產(chǎn),其價(jià)值不可估量。每個(gè)林業(yè)單位或管理部門都要投入必要的人力、物力、財(cái)力去完成。林業(yè)檔案工作必須要具有專業(yè)性、事業(yè)性強(qiáng)的人員才能勝任。

(2)林業(yè)檔案建設(shè)的目的在于其價(jià)值的利用。如何建立計(jì)算機(jī)大數(shù)據(jù)庫,建設(shè)網(wǎng)絡(luò)化平臺(tái),還有待于我們?nèi)ミM(jìn)一步研究。

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周建紅[5]等應(yīng)用普通RT-PCR技術(shù)對(duì)40分禽類樣品進(jìn)行H5亞型禽流感病毒檢測(cè),實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該方法可基本滿足當(dāng)前的檢測(cè)需要。張應(yīng)國(guó)[4]等利用多重RT-PCR技術(shù)在3～4 h內(nèi),完成對(duì)36株禽流感及其他病毒分離物檢測(cè),結(jié)果顯示該方法可以快速、特異和敏感的鑒別和監(jiān)測(cè)A型及H9N2、H5N1亞型禽流感病毒。劉婧君[7]分別用單-RT-PCR和雙重RT-PCR技術(shù)對(duì)樣品中的禽流感病毒(AIV)和新城疫病毒進(jìn)行檢測(cè),研究表明盡管該雙重RT-PCR方法比單～的RT-PCR檢測(cè)方法的敏感性下降了10倍,但建立的雙重RT-PCR技術(shù)仍具有極高的敏感性,特異性和快捷性,具有很高的實(shí)用價(jià)值。在H3N2亞型禽流感病毒檢測(cè)研究方面,劉婷婷[9]通過設(shè)計(jì)篩選2對(duì)引物和優(yōu)化反應(yīng)條件,建立了一種雙重RT-PCR方法,能夠有效檢測(cè)臨床樣品。

3免疫PCR

免疫PCR (I mmuno polymerase chain reaction)技術(shù)是一種檢測(cè)微量蛋白的高靈敏度技術(shù),它將抗原抗體反應(yīng)的特異性和PCR反應(yīng)的敏感性有機(jī)結(jié)合起來,能夠檢出濃度低至2 ng/L的抗原物質(zhì),能夠有效解決普通RT-PCR方法存在的不足和弊端,在醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域的使用研究取得了很好的效果。目前免疫PCR技術(shù)已經(jīng)開發(fā)出不同的種類,包括定量免疫PCR、雙相免疫PCR、磁性免疫PCR、免疫捕捉PCR、雙抗體夾心免疫PCR等。

目前盡管免疫PCR技術(shù)靈敏度非常高,正是由于其高敏感性和操作步驟的復(fù)雜性,使得免疫PCR技術(shù)在操作過程中容易受到交叉污染,影響檢測(cè)結(jié)果,因此如何簡(jiǎn)化步驟以實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化的快速檢測(cè)就成為免疫PCR 發(fā)展的重要探索方向[10]。鄧明俊[8]建立了4種免疫PCR檢測(cè)技術(shù),分別以H5亞型禽流感病毒和H5亞型血凝素蛋白為對(duì)象進(jìn)行檢測(cè),研究結(jié)果顯示它可以對(duì)活H5N1和H5亞型血凝素蛋白直接、大批量的檢測(cè)。

4實(shí)時(shí)熒光定量PCR

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(real- time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,real-time FQ～PCR)是分子生物學(xué)研究的重要工具,具有操作簡(jiǎn)便、快速高效、高敏感性、特異性、可重復(fù)性和定量濃度范圍大等優(yōu)點(diǎn),且具有定量分析、定性分析以及多重?cái)U(kuò)增等功能,靈敏度要高于常規(guī)的PCR技術(shù),目前被廣泛運(yùn)用于新型農(nóng)業(yè)、分子診斷、動(dòng)植物檢疫、國(guó)防軍事和食品安全檢測(cè)等領(lǐng)域。

傳統(tǒng)的野生動(dòng)物疫源疫病檢測(cè)方法依賴于癥狀觀察、病毒培養(yǎng)或菌落培養(yǎng)等技術(shù),近年來實(shí)時(shí)熒光定量PCR憑借其獨(dú)特的優(yōu)越性,被廣泛應(yīng)用于禽流感等病毒的檢測(cè)。如劉婷婷[2]等通過設(shè)計(jì)篩選TapMan探針和引物,優(yōu)化引物和探針的配比濃度,建立了一種可以同時(shí)檢測(cè)H3和H4亞型禽流感病毒的雙重實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法,能夠快速有效檢測(cè)H3和H4亞型禽流感病毒的病原含量。羅寶正[3]等為快速高效檢測(cè)H7N9亞型禽流感病毒,建立了多重?zé)晒釸T-PCR方法,該方法通過設(shè)計(jì)兩套特異性的引物和探針,能夠快速、痕量、精確的檢測(cè)H7N9亞型禽流感病毒,既不會(huì)對(duì)H7造成漏檢,也可以檢測(cè)判斷是否為新型N9亞型病毒。謝芝勛等建立二重?zé)晒舛縍T-PCR方法,設(shè)計(jì)了禽流感和新城疫病毒的檢測(cè)方法。

5結(jié)語

目前實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)憑借其快速、高靈敏度、高特異性、定性分析和定量分析等優(yōu)勢(shì),在禽流感病毒和新城疫病毒的檢測(cè)方面被廣泛應(yīng)用,為我國(guó)野生動(dòng)物疫源疫病檢測(cè)爭(zhēng)取了寶貴的快速反應(yīng)時(shí)間,采取必要措施切斷疫病的傳播,防治交叉感染,對(duì)保護(hù)野生動(dòng)物資源有著重要的意義。

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中圖分類號(hào)：S853

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1674-9944(2016)01-0065-02

作者簡(jiǎn)介：王軻(1989—)，男，山東聊城人,助理農(nóng)藝師,主要從事野生動(dòng)物保護(hù)工作。

收稿日期：2015-11-19