谷 穎 李 麗 王玉堃 （山東迅達(dá)康獸藥有限公司 山東 濟(jì)南 250300）

10種中藥提取物體外抗傳染性支氣管炎病毒效果的研究

谷 穎 李 麗 王玉堃 （山東迅達(dá)康獸藥有限公司 山東 濟(jì)南 250300）

采用體外細(xì)胞培養(yǎng)法，研究板藍(lán)根、大青葉、黃連、菊花、淫羊藿、人參、茯苓、黃芪、山藥和當(dāng)歸10種中藥提取物在雞胚成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)中的最大安全濃度，借助光學(xué)倒置顯微鏡，肉眼觀察提取物對細(xì)胞形態(tài)的影響。在安全濃度范圍內(nèi)分別考察各味中藥對傳染性支氣管炎病毒標(biāo)準(zhǔn)株M41型（IBV-M41）的防治效果，確定4種抗病毒力最強(qiáng)的4種中藥進(jìn)行后續(xù)的試驗(yàn)。結(jié)果表明，板藍(lán)根、大青葉、黃連和淫羊藿對IBV-M41的抗病毒效果最好。

中藥提取物 雞胚成纖維細(xì)胞 安全濃度 傳染性支氣管炎病毒

病毒感染是一大類嚴(yán)重威脅畜禽健康的疾病，且由于疫苗和抗病毒西藥的大規(guī)模使用，很多病毒的毒力和抗原性發(fā)生了抗藥性，使得防治病毒性疾病的難度增大。近年來，由于多種中草藥及其成分有很好的抗病毒作用，且具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能、抗病毒譜廣、很少產(chǎn)生抗藥性、療效顯著等優(yōu)點(diǎn)，正日益成為抗病毒新藥的研究熱點(diǎn)。將抗病毒中藥應(yīng)用到動物身上具有很大的市場前景。

雞傳染性支氣管炎(IB)是由傳染性支氣管炎病毒(IBV)引起的一種急性、高度接觸傳染性呼吸道疾病，其特征是病雞咳嗽、噴嚏以及氣管發(fā)出啰音[1]。IBV變異性強(qiáng)，血清型多，各血清型間沒有或僅有部分交互免疫，這給該病的防治帶來很大的困難，而中草藥抗病毒優(yōu)勢眾多，因此中草藥防治IBV成為很好的選擇。對于備選的板藍(lán)根、大青葉、黃連、菊花、淫羊藿、人參、茯苓、黃芪、山藥和當(dāng)歸這10種中藥材，分別篩選確定了提取工藝并得到各單味中藥的提取物。為了研究它們的抗病毒效果，必須首先排除這些藥物對細(xì)胞的直接損傷。因此，本試驗(yàn)將單味中藥提取物稀釋成一系列的濃度，然后將其和雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)共同培養(yǎng)，篩選出各自作用于雞胚成纖維細(xì)胞的最大安全濃度。本研究針對的是由IBV-M41引起的腎型傳染性支氣管炎[2]，在最大安全濃度范圍內(nèi)探討各個中藥提取物對此病毒的防治效果，為治療IB提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)藥品 （1）板藍(lán)根、大青葉、黃連、菊花、淫羊藿、人參、茯苓、黃芪、山藥和當(dāng)歸購自濟(jì)南中藥批發(fā)市場。（2）雞胚(11日齡，SPF胚)，購自山東家禽研究所。（3）強(qiáng)毒IBV-M41株由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)提供，經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室SPF雞胚傳代，收獲尿囊液，于-70℃冰箱中保存，用前經(jīng)CEF傳代3次。按Reed-Muench法[3]測定IBV-M41對CEF半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(TCID50)為10-6/0.1ml，用細(xì)胞維持液配成100TCID50濃度備用。

1.1.2 試驗(yàn)試劑 （1）小牛血清購自杭州四季青，56℃30min滅活，分裝后于-20℃保存；胰蛋白酶(購自碧云天)消化液、D-Hanks'均自己配制。（2）MEM培養(yǎng)液：按照說明書，將9.4g MEM(Hyclone，SH40012-6)溶于1000ml雙蒸水中，分裝，高壓滅菌。臨用前，用10% NaHCO3調(diào)節(jié)pH至7.2～7.4，并加入5%滅活小牛血清和1%谷氨酰胺；（3）細(xì)胞維持液：同MEM培養(yǎng)液，但不加小牛血清。

1.1.3 試驗(yàn)儀器 分光光度計(jì)、超凈工作臺、CO2培養(yǎng)箱、高壓蒸汽滅菌鍋、離心機(jī)、光學(xué)倒置顯微鏡等；鑷子、紗布塊、小燒杯、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板、24孔細(xì)胞培養(yǎng)板、0.22μm微孔濾器、100ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)準(zhǔn)備 （1）中藥提取液的制備：采用常規(guī)水煎煮法制備10種中藥的提取液，最終使提取液濃縮成1g/ml的藥液(1ml溶液相當(dāng)于1g生藥)，3000r/ml離心20min，得上清液，藥液用0.22μm微孔濾膜過濾。分裝，高壓蒸汽滅菌，4℃冷藏備用。（2）中藥提取液的稀釋：分別吸取10種中藥提取物1ml至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板第1孔中，然后各用等體積的細(xì)胞維持液做連續(xù)的2倍倍比稀釋，從第1孔直到15孔，藥物的稀釋倍數(shù)分別為21～215。（3）雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)制備：參考文獻(xiàn)[4-7]中方法制備CEF。取11日齡雞胚一個于滅菌的超凈工作臺中，用碘酒棉球消毒蛋殼的氣室部分，用鑷子打開氣室。取出雞胚，剪去頭，爪和內(nèi)臟，將其置于培養(yǎng)皿中，用Hanks,液洗去血污。將組織塊置于小燒杯中剪成碎塊(越碎越好)，再用Hanks,液清洗2～3次。加入10ml 胰蛋白酶液在37℃水浴中消化，每隔幾分鐘取出搖勻，共處理30min(組織塊變松散，沉降較慢時表示消化足夠)。加入5ml Hanks液終止消化，混勻，靜置，待沉降后倒出上清。加入5ml MEM培養(yǎng)液，混勻靜置，待沉降后倒出上清，用8層紗布過濾。用MEM培養(yǎng)液將細(xì)胞懸浮計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞密度為5×105個/ml，再分裝于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置37℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。（4）單層CEF細(xì)胞的培養(yǎng)。將細(xì)胞懸液加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100μl，置CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24h，待細(xì)胞均勻鋪滿單層后取出，把MEM培養(yǎng)液析出，用D-Hanks'液洗1遍，吸去D- Hanks'。

1.2.2 中藥提取物在CEF上的安全濃度測試 （1）中藥提取物對單層CEF細(xì)胞的影響：試驗(yàn)組各孔分別加入各濃度中藥提取物100μl和細(xì)胞維持液100μl，每種藥各濃度各重復(fù)4孔，同時設(shè)不加藥物的對照孔4孔。用透明膠帶密封，置37℃繼續(xù)培養(yǎng)，于72h時觀察細(xì)胞單層完好程度，以四孔都不發(fā)生病變的濃度為最大安全濃度。（2）單層CEF細(xì)胞形態(tài)記錄方法：參考文獻(xiàn)，“+++++”表示細(xì)胞生長最好，細(xì)胞折光性好，全部行成完整單層，無空隙；“++++”表示細(xì)胞生長較好，形成單層，基本無空隙；“+++”表示細(xì)胞生長一般，未形成單層，有較多空隙和極少圓細(xì)胞；“++”表示細(xì)胞生長較差，有大量圓細(xì)胞和空隙；“+”表示細(xì)胞很差，基本為圓細(xì)胞，極少貼壁細(xì)胞；“-”表示細(xì)胞極差，全部為未貼壁圓細(xì)胞或細(xì)胞破碎不完整或輪廓不清。

1.2.3 中藥提取物對IBV的預(yù)防和治療作用 （1）中藥提取物濃度處理：以10種中藥提取物最大安全濃度為起始濃度，用細(xì)胞維持液分別2倍倍比稀釋成4個稀釋度(21、22、23、24)。（2）先加中藥提取物再加病毒：在長滿單層CEF細(xì)胞的96孔板的各孔中加入中藥提取物100μl，每個稀釋度重復(fù)4孔，繼續(xù)培養(yǎng)24h后，棄去各孔藥液，再每孔加入100TCID50病毒液100μl。同時設(shè)病毒對照組、細(xì)胞對照組和空白對照組(沒有細(xì)胞，僅在培養(yǎng)細(xì)胞時加100μl MEM培養(yǎng)液，后加細(xì)胞維持液100μl)各4孔。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔12h觀察致細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)變化，當(dāng)病毒對照組CPE達(dá)到百分之七八十時，病變記錄為終點(diǎn)，用MTT法[8]測定570nm下的吸光度(A570)，作為中藥提取物抵抗IBV感染的指標(biāo)。A570值與活細(xì)胞的生長呈正比，A570值越大，表明細(xì)胞生長越旺盛，抗感染效果越好。（3）先加病毒提取物再加中藥：在含有單層CEF細(xì)胞的96孔板的每孔加入100TCID50病毒液100μl，同時設(shè)病毒對照組、細(xì)胞對照組和空白對照組，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h后，棄去各孔病毒液，每個中藥提取物稀釋度重復(fù)4孔，100μl/孔。（4）數(shù)據(jù)處理：取4孔的平均值，數(shù)據(jù)以“Means±SD”表示，并用SPSS軟件進(jìn)行多重分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 中藥提取物對單層CEF細(xì)胞的影響

由表1可以看出，黃芪提取物對單層CEF細(xì)胞的影響是最小的，最大安全濃度為26，即15.63mg/ml；其次是人參、山藥，它們的最大安全濃度都是29(即1.95mg/ml)。茯苓、當(dāng)歸、板藍(lán)根、大青葉、黃連、菊花和淫羊藿的最大安全濃度分別是0.976、0.976、0.976、0.976、0.488、0.488、0.244mg/ml。

表1 72h觀察中藥提取物對單層CEF細(xì)胞的影響結(jié)果

2.2 中藥提取物對IBV的預(yù)防和治療作用

2.2.1 中藥提取物對IBV的預(yù)防作用 由表2可知，10種中藥提取物在高濃度區(qū)的A570值顯著高于病毒對照組(P＜0.05)，表明在安全濃度范圍內(nèi)中藥提取物濃度越高，細(xì)胞生長越旺盛，抗感染的效果越好。在高稀釋度下，中藥提取物抗感染的效果不明顯。結(jié)果表明，板藍(lán)根、大青葉、黃連、菊花、淫羊藿、人參、茯苓、黃芪、山藥和當(dāng)歸這10種中藥的提取物對IBV均有一定的抵抗病毒感染的作用。

2.2.2 中藥提取物對IBV的治療作用 由表3可知，板藍(lán)根、大青葉、黃連、淫羊藿在高濃度區(qū)的A570值顯著大于病毒對照組(P＜0.05)，其它稀釋度的差異不顯著；其它中藥提取物的A570值與對照組相比差異并不顯著。結(jié)果表明板藍(lán)根、大青葉、黃連、淫羊藿這4種中藥提取物對IBV感染的細(xì)胞有比較明顯的殺毒作用。

表2 中藥提取物各稀釋度的A570

表3 中藥提取物各稀釋度的A570

3 討論

（1）試驗(yàn)結(jié)果表明，中藥并不是完全無毒無害的，以上十種中藥提取物在高濃度時能抑制細(xì)胞的生長，都對CEF細(xì)胞表現(xiàn)出一定的毒性，隨著加入的提取物濃度的下降，毒性作用逐漸減弱。黃芪對細(xì)胞毒性作用特別小，最大安全濃度為15.63mg/ml；王志潔[9]測得黃芪對Hep-2細(xì)胞的最大無毒濃度為82.43mg/ml，高于本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，這可能是細(xì)胞種類不同，其耐受性不同所造成的。人參、山藥對細(xì)胞的毒性作用也很小。此試驗(yàn)結(jié)果與之前劉家國[10]所得出的黃芪、當(dāng)歸、人參對CEF細(xì)胞毒性小具有一致性，本試驗(yàn)測定安全濃度時通過觀察細(xì)胞形態(tài)的方法，此方法簡單易行，但是劃分等級粗糙，在判斷細(xì)胞病變程度時不可避免的存在著主觀因素。（2）體外研究抗病毒中草藥的活性時，一般分三個步驟，首先利用敏感細(xì)胞進(jìn)行毒種的傳代，連續(xù)傳代三代以上之后測定病毒對細(xì)胞的半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量（TCID50）；然后測定中草藥本身對細(xì)胞的毒性；最后進(jìn)行中草藥體外抗病毒試驗(yàn)[11]。（3）先加中藥后加病毒，目的是觀察中藥能否阻止病毒的吸附和侵入，這種方式在臨床中相當(dāng)于預(yù)防，可以阻止病毒吸附和進(jìn)入細(xì)胞[12]，其作用機(jī)理可能是中藥提取物與細(xì)胞共同作用一段時間后提高了細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，在加入病毒之后可以有效的阻止病毒的吸附和侵入。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，先加中藥后接種病毒時，板藍(lán)根、大青葉、黃連、菊花、淫羊藿、人參、茯苓、黃芪、山藥、當(dāng)歸這10種中藥提取物對IBV感染在高濃度時均有顯著的阻斷作用，提示這些中藥提取物都能夠抑制病毒感染，可以應(yīng)用于病毒性疾病的預(yù)防。（4）先加病毒后加中藥，相當(dāng)于先感染細(xì)胞，然后研究中藥提取物對已經(jīng)進(jìn)入細(xì)胞的病毒是否起作用。只有板藍(lán)根、大青葉、黃連、淫羊藿這4種中藥提取物對IBV感染有顯著的治療作用，其它中藥提取物的抑制作用不明顯。任宇皓等之前的研究表明，黃芪多糖和淫羊藿多糖在病毒之后加入時對NDV無明顯的抑制作用[13]，可能原因是病毒不同。張素梅[14]等報道黃芪對偽狂犬病毒無抑制作用，高海匯[15]等研究表明，黃芪多糖具有較強(qiáng)的免疫促進(jìn)作用，這些結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，即黃芪本身對病毒無殺滅作用，但它具有較強(qiáng)的免疫促進(jìn)作用。部分中藥治療效果不明顯可能是因?yàn)橄冉臃N的病毒已經(jīng)侵入破壞了細(xì)胞，其抗病毒感染的能力無法恢復(fù)。

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