李 麗 谷 穎 王玉堃 （山東迅達康獸藥有限公司 山東 濟南 250300）

試驗研究

中藥提取物抗雞傳染性支氣管炎病毒的體外活性研究

李 麗 谷 穎 王玉堃 （山東迅達康獸藥有限公司 山東 濟南 250300）

將4種中藥提取物稀釋成安全濃度范圍內(nèi)的高、中、低3種濃度，分別與IBV以3種方式加入到培養(yǎng)成單層的雞胚成纖維細胞(CEF)的培養(yǎng)體系中，用MTT法測定IBV感染細胞能力的變化。結果表明，B提取物在先加中藥、后加中藥，與病毒一起加，其A570值均高于病毒組，B具有較好的預防和治療傳染性支氣管炎病毒的作用。

中藥提取物 雞胚成纖維細胞 傳染性支氣管炎病毒

傳染性支氣管炎(IB)是由病毒引起的一種僅發(fā)生于雞的急性、高度接觸性的呼吸道疾病[1]。以呼吸道癥狀、產(chǎn)蛋下降、腎臟病變等為特征。自1988年以來，IB在我國大部分地區(qū)相繼流行，其發(fā)病率高達100%，死亡率10%～30%。國內(nèi)每年由此病造成的經(jīng)濟損失超過10億元[2]。在對病毒性疾病的治療中，西藥和中藥都各自有其優(yōu)缺點。西藥雖然見效快但毒副作用大，易產(chǎn)生耐藥性?，F(xiàn)代藥理學研究表明，許多中草藥及其多種成分都有很好的抗病毒作用，且具有作用獨特，抗病毒譜廣、毒副作用小、療效顯著等優(yōu)點正日益成為抗病毒新藥研究的熱點。為研究具有較好抗病毒能力的中藥復方制劑，前期篩選確定了具有抗病毒活性最強的4味中藥(板藍根、大青葉、黃連、淫羊藿)，將4味中藥以不同比例配伍提取濃縮得到提取物A、B、C、D。本試驗以傳染性支氣管炎病毒

(IBV)為研究對象，在測定A、B、C、D 4種提取物對雞胚成纖維細胞(chickembryo fibroblast，CEF)生長均呈促進作用的基礎上選取安全濃度范圍內(nèi)的高中低3種濃度，分別與IBV以3種方式加入到培養(yǎng)24h已長成單層的CEF中，測定他們對IBV病毒感染細胞能力的影響，選擇藥材的最佳配比，為研制抗IBV病毒的中藥復方制劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗藥品 板藍根、大青葉、黃連、淫羊藿購自濟南中藥批發(fā)市場，以上4味藥材以(1∶1∶1∶1；1∶2∶1∶1；

1∶2∶2∶1；1∶1∶2∶1)不同比例，加水煎煮2次，2h/次，合并煎液，濾過，濾液濃縮至相對密度為1.20～1.25(70～80℃測)的清膏，冷至40℃時緩緩加入乙醇，充分攪拌，使含醇量為60%，靜置12h使沉淀，濾取上清液，遺留沉淀再加60%乙醇適量，充分攪拌，靜置12h，濾取上清液，合并二次上清液，回收乙醇至無醇味，濃縮至1ml含1g生藥，收集濃縮液，濾過，灌裝，滅菌，即得。以上不同比例中藥提取濃縮得樣品為A、B、C、D。根據(jù)對CEF細胞安全濃度的測定結果[3]，用細胞維持液分別將A、B、C、D稀釋成高、中、低3種濃度。

1.2 雞胚 9d SPF雞胚，購于山東家禽研究所。

1.3 病毒 IBV-M41株由中國農(nóng)業(yè)大學某教授提供，本實驗室自行傳代保存。將病毒按常規(guī)方法接種9日齡SPF雞胚，37℃恒溫培養(yǎng)72h，收獲尿囊液，連續(xù)雞胚傳代得IBV。按Reed-Muench法[4]測定IBV對CEF半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(TCID50)為1×10-6/0.1ml，用細胞維持液配成100 TCID50濃度備用。

1.4 主要儀器和試劑 MEM細胞培養(yǎng)液，Gibco公司產(chǎn)品，按說明書配制，再加入犢牛血清(Gibco公司產(chǎn)品)，達5%為細胞生長液、2%為細胞維持液，再按常規(guī)量加入谷胺酞氨和雙抗；胰蛋白酶，進口分裝，用PBS(pH值7.4)配制成0.25%溶液，0.22μm混合纖維素酯微孔濾膜過濾除菌，分裝后-20℃保存?zhèn)溆?；MTT(四唑溴鹽)溶液，Sigma公司產(chǎn)品，按說明書配制，使終濃度為5mg/ml，0.22μm微孔濾膜過濾除菌，分裝后4℃冰箱保存，1周內(nèi)用完。MCO-15AC型CO2培養(yǎng)箱，37×B?型生物倒置顯微鏡，DG-5031型酶聯(lián)免疫檢測儀，BT125D型電子分析天平，MH-1型微量振蕩器，24孔、96孔細胞培養(yǎng)板，細胞培養(yǎng)瓶等。

1.5 試驗方法 根據(jù)文獻[4]介紹的方法制備CEF，將細胞數(shù)調整至1×106個/ml后加入到96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔100μl，37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24h，細胞長成均勻單層后，翻轉細胞板于滅菌紗布上傾去生長液，用D-Hank′s液洗兩次，按以下3種方式[5]開始分組加藥。（1）先加中藥后接種病毒(藥物預防試驗)：相當于先加入中藥對細胞進行預防，能否提高細胞抗病毒能力。于各孔中加入高、中、低3種不同濃度的中藥100μl，每種濃度重復4孔，繼續(xù)培養(yǎng)24h后，棄去各孔中藥，再每孔加入100TCID50病毒液100μl；每種濃度分別設病毒對照組(細胞維持液100μl、病毒液100μl)、細胞對照組(只加200μl細胞維持液)和空白對照組(無細胞，僅在培養(yǎng)細胞時加100μl細胞生長液，后分別加細胞維持液100μl、細胞維持液100μl)，繼續(xù)培養(yǎng)，以加入病毒液后開始計算時間，每隔12h觀察1次CPE變化，詳細記錄結果，直至病毒對照組出現(xiàn)典型的CPE病變記錄為終點(一般為72h)，用MTT法[6]測定570nm處A570值。（2）接種病毒后加中藥(藥物治療試驗)：每孔加入100TCID50病毒液100μl，先每種稀釋濃度重復4孔，同時設空白對照組、病毒對照組和細胞對照組，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h后，棄去各孔病毒液，再加入高、中、低不同濃度中藥100μl/孔。（3）中藥和病毒同時加入(直接作用試驗)：將100TCID50病毒液與各濃度中藥成分4℃條件下感作2h，每孔100μl，做對照的病毒液以及細胞維持液4℃相同處理，同時設空白對照組、病毒對照組和細胞對照組。此外，設僅加維持液的無細胞孔作為測定時調零孔。（4）當藥物的A570值顯著大于病毒對照組時，表明有顯著的抵抗傳染性支氣管炎病毒感染細胞的作用。

1.6 數(shù)據(jù)處理 計算4孔平均值和標準差，數(shù)據(jù)以Means±SD表示，用SPSS統(tǒng)計分析軟件進行方差分析和多重比較。病毒抑制率通過方差分析比較不同加藥方式間的差異性，顯著性水平P＜0.05。

2 結果

2.1 A組的變化 先加中藥、后加病毒，125μg/ml和250μg/ml濃度A570值顯著高于病毒對照組(P＜0.05)；先加病毒、后加中藥，250μg/ml濃度A570值顯著高于病毒對照組(P＜0.05)；中藥與病毒同時加，250μg/ml濃度A570值顯著高于病毒對照組(P ＜0.05)(表1)。

表1 A在先加、后加和與病毒同時加入時各組細胞A570值

2.2 B組的變化 先加中藥、后加病毒時，31.25μg/ml、62.5μg/ml和125μg/ml濃度組的A570值顯著高于病毒對照組(P＜0.05)；先加病毒、后加中藥時，31.25μg/ml和62.5μg/ml濃度組A570值顯著高于病毒對照組(P＜0.05)；與病毒同時加，125、62.5、31.25μg/ml濃度A570值顯著高于病毒對照組(P＜0.05)。31.25μg/ml A570值高于細胞對照組(表2)。

表2 B在先加、后加和與病毒同時加入時各組細胞A570值

2.3 C組的變化 先加中藥、后加病毒，16μg/ml濃度A570值顯著高于病毒對照組(P＜0.05)；先加病毒、后加中藥，32μg/ml濃度A570值高于病毒對照組，但不顯著，中、低濃度的A570值低于病毒對照組；中藥與病毒同時加，32μg/ml和8μg/ml濃度組的A570值稍高于病毒對照組(表3)。

2.4 D組的變化 先加中藥、后加病毒，250μg/ml和 125μg/ml濃度A570值顯著高于病毒對照組(P＜0.05)；先加病毒、后加中藥，125μg/ml濃度A570值高于病毒對照組，但不顯著；與病毒同時加，250μg/ml濃度A570值顯著高于病毒對照組(P＜0.05)(表4)。

表3 C在先加、后加病毒和與病毒同時加入時各組細胞A570值

表4 D在先加、后加和與病毒同時加入時各組細胞A570值

3 討論

3.1 中藥復方提取物對IBV感染CEF能力的影響 從試驗結果來看，先加藥物后加病毒時，A的高、中濃度，B的高、中、低濃度，C的中、低濃度，D的高、中、低濃度，療效都較好；先加病毒后加藥物時，A的高濃度，B的中、低濃度，C的中、低濃度，效果較好；藥物與病毒同時加，A的高濃度，B的高、中、低濃度，C的中濃度，D的高、中濃度效果較好?？梢姡珹、B、C、D在先加藥物后加病毒時療效較好，即對IBV有較好的抑制作用，B對IBV還具有較好的治療作用。先加藥后加病毒的方式，和臨床上的預防非常相似，故該試驗的結果可以作為臨床上預防用藥的參考。中藥復方不同提取成分都有不同程度的抗病毒作用，D值不但反應活細胞的多少，也反映細胞的病變程度，間接地反映病毒增殖的程度，細胞被病毒感染破壞或干擾了功能后，細胞受到損壞，線粒體的活性下降，可降低對四唑鹽在細胞內(nèi)形成晶體的能力，隨著病毒在細胞內(nèi)不斷增殖，死亡的細胞越多，生成的甲簪結晶就越少，其D值就越低[7]。

3.2 中藥提取物抑制病毒感染細胞能力與濃度關系 試驗結果發(fā)現(xiàn)，先加藥物后加病毒時，A的高、中濃度，B的高、中、低濃度，C的中、低濃度，D的高、中、低濃度，療效都較好；先加病毒后加藥物時，A的高濃度，B的中、低濃度，C的中、低濃度，效果較好；藥物與病毒同時加，A的高濃度，B的高、中、低濃度，C的中濃度，D的高、中濃度效果較好；說明中藥抗病毒需要有合適的濃度，并不是濃度越高療效越好。

3.3 作用機理 該試驗顯示，提取物A、B、C、D對先加入病毒時起到顯著的抑制作用，表明中藥成分是通過改變細胞膜表面的病毒吸附蛋白受體或作用于細胞內(nèi)而提高其抵抗能力，阻止病毒侵入細胞而發(fā)揮預防作用，或通過直接滅活病毒來保護細胞[8-9]，B在先接種病毒及與病毒同時加入時也起到了抑制作用，說明B在細胞受病毒感染后也能發(fā)揮治療作用。

本研究表明提取物B在預防和治療方式中，對IBV感染CEF均有很好的抑制效果，故選板藍根、大青葉、黃連、淫羊藿最佳比例為1∶2∶1∶1，為研制抗IBV病毒的中藥復方提供理論依據(jù)。

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S853.73+3

A

1007-1733(2016)11-0001-03

2016-08-10）