賈又山，龍歡，高國策，劉書暢，宋培勇

（遵義師范學院生物與農業(yè)科技學院，貴州遵義563002）

貴州西南部土壤放線菌資源及其抗菌活性

賈又山，龍歡，高國策，劉書暢，宋培勇

（遵義師范學院生物與農業(yè)科技學院，貴州遵義563002）

為了解貴州西南部土壤放線菌資源及其抗菌活性，從采集土樣中分離得到28株放線菌，對其中19株進行了形態(tài)學鑒定，其中4株還做了分子鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析，并檢測了其對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、齊整小核菌和擬盤多毛孢的抗菌效果。結果顯示，MLH17、MLH18、MLH24、HJ1、C12對金黃色葡萄球菌抑菌效果強，MLH9、MLH3、MLH21、MLH26對金黃色葡萄球菌抑菌效果弱；對大腸桿菌、齊整小核菌和擬盤多毛孢都沒有抑制效果。鑒定結果表明鏈霉菌為優(yōu)勢菌屬。

貴州西南部；土壤放線菌；鑒定；抗菌活性

放線菌屬于原核生物界、厚壁菌門、絲狀菌綱、放線菌目[1]。放線菌以產生抗生素聞名，如鏈霉素、卡那霉素、紅霉素、氯霉素、四環(huán)素、新生霉素、慶大霉素、絲裂霉素、馬杜拉霉素、阿維菌素、春雷霉素、慶豐霉素、井岡霉素、農抗120、多抗霉素、中生菌素、寧南霉素、梧寧霉素和武夷菌素等[1-3]?？股夭粌H常用于人畜的抗感染治療，對農作物的病蟲害防治也能起到重要作用。但是，隨著微生物耐藥性的增強，在臨床醫(yī)學和生產實踐中可選擇的抗生素越來越少，對新抗生素尤其是具有特殊抑抗機制抗生素的需求日益增加。在特殊生境中繁衍生息的微生物為適應外界多種逆境因子，經長期演化，逐步產生了獨特的防御和代謝系統(tǒng)，因此，從特殊環(huán)境的土著微生物或變異微生物培養(yǎng)液中發(fā)現(xiàn)新抗生素的幾率相對較高[4]，已成為發(fā)現(xiàn)新抗生素的重要策略。如董艷萍等[5]從塔克拉瑪干沙漠南麓17份土壤樣品中分離純化得到368株放線菌，從中就發(fā)現(xiàn)一株放線菌（SC8A-24）為潛在的新種。貴州馬嶺河大峽谷和花江大峽谷地處云貴高原西部，地形地貌獨特，是篩選新抗生素產生菌的生境之一。金黃色葡萄球菌是6種常見院內感染病原體（ESKAPE）之一。ESKAPE均為多重耐藥細菌，而其中更不乏所謂的“超級細菌”，如耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌（MRSA）、產ESBL的肺炎克雷伯菌、耐碳青霉烯類的鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌等[6]。大腸桿菌O157:H7是引起人腸出血性腹瀉的罪魁禍首，而齊整小核菌、擬盤多毛孢是植物常見的病原菌。所以本文選擇上述菌株作為拮抗對象，用于放線菌抗菌活性篩選。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1土樣

2014年5月，從貴州省黔西南布依族苗族自治州馬嶺河大峽谷和安順市花江大峽谷采集。

1.1.2培養(yǎng)基

高氏1號培養(yǎng)基、牛肉膏培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基均按文獻[7]介紹的方法進行配制。

1.1.3供試菌株

金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、齊整小核菌、擬盤多毛孢，由遵義師范學院微生物實驗室提供。

1.1.4主要試劑

1.1.5主要儀器

微波爐（三洋公司），離心機（Thermo Scientific），凝膠成像系統(tǒng)（北京六一），PCR擴增儀為DNA Engine peltier Thermal Cycler（Bio Rad）。

1.2方法

1.2.1放線菌分離

采集的土樣先在實驗室風干20d，碾碎。取l0-4、l0-5稀釋度土壤懸液，涂于高氏1號培養(yǎng)基上，每個平板200μL，培養(yǎng)6～10d，挑菌純化兩次，斜面保存。

1.2.2放線菌形態(tài)特征觀察

用插片法[7]將滅菌蓋玻片插于接有放線菌的高氏I號平板，每個平板插2片，倒置后在28～30℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7d，美藍染色，顯微鏡下觀察拍照。

1.2.3抗菌活性篩選

放線菌對細菌的抗菌活性篩選：制備牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基2份，分別接種金黃色葡萄球菌和大腸桿菌，培養(yǎng)24h待其變渾濁后取出，無菌吸取5mL注入冷卻到約45～50℃未凝固的牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基中，立即趁熱將其搖勻，倒入滅菌的培養(yǎng)皿中，得到含菌培養(yǎng)基，待培養(yǎng)基凝固后，用直徑為0.5cm的打孔器打取高氏一號培養(yǎng)基中的放線菌，用滅菌的解剖針挑取菌塊放到含菌平板上，每個平板放置2個。28℃培養(yǎng)4d，取出觀察并測量抑菌圈大小，每個菌塊用十字交叉法測量2次，取平均值。根據(jù)抑菌圈的直徑判斷其抗菌活性：≤5 mm，無抑菌活性；6～15 mm，抑菌作用弱；>15 mm，抑菌作用強[8]。

放線菌對真菌的抗菌活性篩選[9]：無菌吸取3mL放線菌發(fā)酵液，注入到45～50℃的PDA培養(yǎng)基中，立即趁熱搖勻，倒入滅菌的培養(yǎng)皿中，待其凝固后，用直徑為0.5cm的打孔器打取真菌的菌餅，并將菌餅用滅菌的解剖針挑起后放置到放線菌平板上，每個平板放置2個菌餅，28℃培養(yǎng)5 d后，觀察并測量抑菌圈的直徑。每個菌落用十字交叉法測量兩次，取平均值。

1.2.4DNA提取

采用微波法[8,10]用無菌牙簽挑取綠豆大小的單菌落或菌苔于1.5 mL EP管中，加1 mL洗滌液，渦旋5s，5700 r/min離心1 min，棄上清。沉淀加50L裂解液，渦旋混勻，于微波爐中600 W處理45s，加入65℃預熱的抽提液400L，渦旋5s。加入450L酚:氯仿:異戊醇（25:24:1）抽提，1000 r/min離心10 min。取上清液加400L酚:氯仿:異戊醇（25:24:1）再抽提一次。取水相加等體積預冷的異丙醇，-20℃沉淀1h以上，12000r/min離心20min，棄上清，充分干燥，溶于20L 1×TE溶液中。取10L DNA溶液于0.8%瓊脂糖凝膠80V電泳1.5h，260nm紫外燈下觀察并照相。

1.2.516S rDNA PCR擴增

反應條件：94℃10 min;95℃30s，56℃30s，72℃90s，35個循環(huán)；72℃10min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。16SrDNA PCR擴增產物（未純化）交由南京金斯瑞生物科技有限公司測序。

1.2.6分子鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析

登陸NCBI官網(wǎng)輸入16SrDNA測序結果進行BLAST比對，查找相似性最高的菌株。利用MEGA4.1構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2　結果與分析

2.1放線菌形態(tài)特征

用高氏1號培養(yǎng)基從4份土壤樣品中共分離得到28株放線菌，根據(jù)菌落形態(tài)初步篩選19株進行形態(tài)鑒定（見表1）。MLH1和MLH3呈短螺旋狀，氣生菌絲及基內菌絲基本相同。MLH13和MLH23孢子絲形態(tài)為分枝斷裂狀，但MLH13氣生菌絲為粉紅色，中間為灰色，基內菌絲為白色。MLH12和MLH18孢子絲也呈分枝斷裂狀，氣生菌絲和基內菌絲基本相似。MLH22孢子絲與MLH28相同，MLH21孢子絲呈短緊螺旋狀，氣生菌絲為灰色，基內菌絲為白色或黑色。MLH9還產生了紫色色素。HJ1孢子絲呈螺旋形，氣生和基內菌絲顏色為紫色和紫褐色。MLH6、MLH7和MLH14的孢子絲呈鉤形，其氣生和基內菌絲顏色各不相同。MLH5和MLH15的孢子絲呈長松和短緊螺旋狀，菌絲顏色也不盡相同。從孢子絲形態(tài)看，多數(shù)為鏈霉菌。

表1　放線菌的形態(tài)特征

2.2抗菌活性

抗菌檢測結果表明（見表2），放線菌MLH18、HJ1、MLH9、MLH17、C12、MLH24、MLH3對金黃色葡萄球菌有不同程度的抑菌效果：其中MLH18、HJ1、MLH17、C12抑菌圈直徑均大于15mm，抑菌作用強；MLH3、MLH9、MLH21、MLH24、MLH6抑菌圈直徑在6～15mm，抑菌作用弱；各分離菌株對大腸桿菌、齊整小核菌、擬盤多毛孢均無抑制作用。據(jù)此推測MLH18、HJ1、MLH17、C12等產生的活性物質可能對病菌細胞壁肽聚糖的合成有抑制作用。

表2　放線菌抗菌活性

圖1　MLH18和HJ1對金黃色葡萄球菌的抑菌效果

2.3放線菌DNA提取及16S rDNA PCR擴增

選取抑菌效果好的5株菌株，用微波法提取放線菌基因組DNA，經0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測（見圖2），條帶清晰，說明微波法提取放線菌DNA是一種方便高效的方法。但MLH17、MLH24的DNA條帶有拖尾現(xiàn)象。

圖2　放線菌基因組DNA

以所提取的基因組 DNA為模板，進行 16S rDNA PCR擴增，皆擴增出約1500bp左右的DNA條帶，且條帶清晰明亮（見圖3）。

圖3　放線菌16S rDNA PCR結果

2.4分子鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹分析

16SrDNA PCR擴增產物由南京金斯瑞生物科技有限公司測序。測序結果顯示，MLH24正反測序都出現(xiàn)雙峰，可能是由于提取樣品不純，致使測序結果不可靠。將其他4株的測序結果登陸NCBI官網(wǎng)，進行BLAST比對，結果見表3。根據(jù)相似性>97%作為種的劃分標準[11]，HJ1、C12、MLH17與同源菌株的相似性為99%，鑒定為鏈霉菌屬MLH18與同源菌株的相似性為99%，鑒定為放線菌屬

將4株菌株的16S rDNA序列用MEGA4.1軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹（見圖4），由圖4可知這8株放線菌分為兩大支，其中C12和鏈霉菌屬聚為一支，HJ1和鏈霉菌屬聚為一支；MLH17和鏈霉菌屬聚為一支，MLH18和放線菌屬聚為一支。從系統(tǒng)發(fā)育樹可知C12和HJ1的親緣關系比較近，而與MLH17和MLH18的親緣關系相對較遠，MLH17和MLH18的親緣關系比較近。

表3　部分放線菌分離菌株的分子鑒定

圖4　4株放線菌及其同原菌株基于16S rDNA序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹

3　結論

本文從貴州西南部土壤中分離得到28株放線菌，對其中的19株進行了形態(tài)學鑒定及抗菌活性篩選，并挑選了5株進行了分子鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析，結果表明：MLH18、HJ1、MLH17、C12對金黃色葡萄球菌抑菌作用強，MLH3、MLH9、MLH21、MLH24、MLH6對金黃色葡萄球菌抑菌作用弱。測試的19株放線菌分離株對大腸桿菌、齊整小核菌、擬盤多毛孢均沒有抑菌效果。分子鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析表明，MLH17、HJ1、C12為鏈霉菌屬；MLH18為放線菌屬。實驗結果說明貴州西南部土壤放線菌資源比較豐富，鏈霉菌為其優(yōu)勢菌屬。部分菌株還有很好的抗菌活性及產色素潛能，通過抗菌活性產物及生物色素的進一步鑒定，可能篩選出具有一定商業(yè)價值的優(yōu)良菌株。

[1]阮繼生,黃英.放線菌快速鑒定與系統(tǒng)分類[M].北京:科學出版社,2011.

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[3]蔣細良,謝德齡,倪楚芳,等.中生菌素的抗生作用[J].植物病理學報,1997,27(2):133-138．

[4]李文均,徐平,徐麗華,等.極端環(huán)境中的放線菌資源[J].微生物學通報,2003,30(4):125-127.

[5]董艷萍,郭琳,旭格拉·哈布丁,等.塔克拉瑪干沙漠南麓土壤放線菌資源勘探及抗菌活性篩選[J].中國抗生素雜志,2013, 38(4):241-247.

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（責任編輯：朱彬）

Soil Actinomycetes and Their Antimicrobial Activity in Southwest
of Guizhou

JIA You-shan，LONG Huan，GAO Guo-ce，LIU Shu-chang，SONG Pei-yong
（Collge of Biological and Agricultural science and technology,Zunyi Nomal College,Zunyi 563002,China）

In order to understand the soil actinomycetes resources and their antimicrobial activity in southwest of Guizhou,we carried out this research.28 strains of actinomycetes are isolated from the soil samples collected.The morphological identification was carried out to the 19 strains above.Molecular identification and phylogenetic analysis was carried out to 4 strains of the 19 actinomycetes above. Antimicrobial effect of theisolateswastestedagainst Staphylococcusaureus,Escherichia coil,Sclerotiumrolfsiiand Pestalotiopsis clavispora.The results show that antimicrobial effect of MLH17、MLH18、MLH24、HJ1 and C12 was strong on Staphylococcus aureus,yet MLH9,MLH3,MLH21 and MLH26 was weak.Except for Staphylococcus aureus,inhibity effect was found on the others.Identification results show that streptomyce was the domain genus.

southwest of Guizhou;soil actinomyces;identification;Antimicrobial activity

Q939.132

A

1009-3583（2016）-0102-05

2016-04-11

貴州省大學生創(chuàng)新訓練資助項目（201410664010）

賈又山，男，貴州遵義人，遵義師范學院生物與農業(yè)科技學院2012級植物生物技術專業(yè)本科學生。

作者通訊：py66song@126.com