李 博， 孫麗華

(包頭師范學(xué)院 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014030)

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中國(guó)大型真菌野外采集及分類(lèi)研究分析方法簡(jiǎn)述

李 博， 孫麗華

(包頭師范學(xué)院 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014030)

指出了大型真菌是菌物中的一個(gè)重要類(lèi)群，我國(guó)相關(guān)研究開(kāi)展較晚，但也已摸索出一套野外采集及分類(lèi)研究分析的方法。從野外采集工作包括野外采集策略、準(zhǔn)備工作、野外工作和實(shí)驗(yàn)室工作包括形態(tài)觀察、顯微觀察、DNA提取、PCR擴(kuò)增及分子數(shù)據(jù)分析等分子生物學(xué)研究?jī)纱蟛糠謱?duì)大型真菌的研究方法進(jìn)行了詳細(xì)地闡述。

大型真菌；野外采集；顯微觀察；分子生物學(xué)研究

1 引言

真菌是一個(gè)古老的生物類(lèi)群，4億多年前泥盆紀(jì)時(shí)期的化石中就發(fā)現(xiàn)有真菌。大型真菌是菌物中的一個(gè)重要類(lèi)群，指菌物中子實(shí)體大型的一類(lèi)真菌，泛指廣義上的Mushroom 或Macrofungi，即譯為蘑菇或蕈菌[1]，地球上的大型真菌資源非常豐富，很多種類(lèi)是十分美味的食用菌，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值，是目前菌物中最有開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景的一類(lèi)，但是也有很多種類(lèi)具有劇毒，所以受到廣泛的關(guān)注。

自16世紀(jì)以來(lái)，各國(guó)科學(xué)家就廣泛開(kāi)展了對(duì)大型真菌的研究。1735年，在林奈建立的兩界分類(lèi)系統(tǒng)(動(dòng)物界和植物界)中，把真菌列入植物界；1860年Hogg和1866年Haeckel在先后建立的三界分類(lèi)系統(tǒng)(原生生物界、動(dòng)物界和植物界)中，把真菌列入原生生物界；在Copeland(1938)建立的四界分類(lèi)系統(tǒng)(菌界、原生生物界、動(dòng)物界和植物界)中，把真菌列入原生生物界；在1969 在Wittaker建立的五界分類(lèi)系統(tǒng)(原核生物界、原生生物界、植物界、真菌界和動(dòng)物界)中，才把真菌單獨(dú)作為一界處理。1851～1950年間是近代真菌學(xué)全面發(fā)展的時(shí)期，20世紀(jì)50年代以來(lái)，現(xiàn)代真菌學(xué)飛速發(fā)展，有關(guān)真菌的研究著作層出不窮。據(jù)估計(jì)，全球共有真菌150萬(wàn)種以上，而目前僅知其中的4.6%，約7萬(wàn)種，其中大型真菌約有 1萬(wàn)種[2～3]。我國(guó)相關(guān)研究開(kāi)展較晚，但在廣大真菌學(xué)者研究的基礎(chǔ)上，也已摸索出一套野外采集及分類(lèi)研究分析的方法。20世紀(jì)40年代開(kāi)始對(duì)大型真菌進(jìn)行研究，已記載了大型真菌1200屬、5000多種[4～6],我國(guó)目前已知的各類(lèi)大型真菌約3萬(wàn)多種，其中食、藥用菌近1000種，已經(jīng)人工栽培的約100余種[7]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展,真菌分類(lèi)學(xué)已經(jīng)從表型分型進(jìn)入了基因分型的新時(shí)代，為方便廣大真菌愛(ài)好者及初學(xué)者迅速掌握大型真菌野外采集及研究方法，本文將在中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所期間所學(xué)到的研究方法介紹如下。

2 野外采集

2.1 采樣策略

大型真菌的分布和它們的生長(zhǎng)習(xí)性息息相關(guān)，例如有些子實(shí)體有著朝生暮死的特性，這為研究帶來(lái)很多不確定性，在一年中的某些時(shí)候，采樣地點(diǎn)的很多物種并不會(huì)結(jié)實(shí)，因此單次采集所得的結(jié)果并不可靠，為了對(duì)采樣地點(diǎn)的大型真菌生態(tài)學(xué)特性做出正確的估計(jì)，在每年結(jié)實(shí)期內(nèi)的多次采集是必不可少的[1]。再例如有些子實(shí)體如乳牛肝菌等與針葉樹(shù)有嚴(yán)格的共生關(guān)系，故在采樣前可依照中國(guó)植物志[8]針葉樹(shù)的分布進(jìn)行有針對(duì)性的設(shè)計(jì)路線(xiàn)。中國(guó)的大型真菌分布較廣，根據(jù)南北不同的出菇季節(jié)，可每年進(jìn)行多次出菇采集。

2.2 大型真菌野外采集的準(zhǔn)備

自制子實(shí)體干燥烘箱(包括聯(lián)創(chuàng)牌PCT取暖器、定制鐵板防風(fēng)罩和網(wǎng)眼托盤(pán))、吸水紙、自封袋、硅膠、裝有Buffer 的離心管、酒精燈、鑷子、小勺、GPS 定位儀、數(shù)碼相機(jī)、腳架、采集刀、記錄筆、記錄紙、反光板、遮陽(yáng)傘、采集籃、記錄紙。

2.3 野外工作

在野外采集過(guò)程中，為了更準(zhǔn)確的反映真菌的生境及子實(shí)體的新鮮特征，對(duì)子實(shí)體進(jìn)行拍照時(shí)建議使用腳架固定數(shù)碼相機(jī)，以保證照片的清晰度，光線(xiàn)不足時(shí)使用反光板，光線(xiàn)太明亮?xí)r使用遮陽(yáng)傘，拍照時(shí)盡量連同生境一同體現(xiàn)，同時(shí)還要用采集刀挖出完整的子實(shí)體進(jìn)行拍照，注意動(dòng)作要輕，不能把菌根或者假菌根挖斷以保證子實(shí)體基部及菌根的完整性，以方便對(duì)其描述和研究的完整性和準(zhǔn)確性。另外，菌蓋上的附著物如落葉、小蟲(chóng)等也不要彈掉，可判定是否有毒；菌蓋上的鱗片、絨毛等應(yīng)保持完整，蓋緣的菌幕殘片也要注意保護(hù)，作為鑒定的重要依據(jù)；菌柄上的絨毛、鱗片等均要保持其完整；腹菌類(lèi)基部有菌索深入土中，要注意采取；肉質(zhì)、膠質(zhì)和蠟質(zhì)的菌類(lèi)，保持各部完整[9]。隨后用GPS 定位儀定位海拔并記錄，同時(shí)記錄子實(shí)體所處的生態(tài)環(huán)境，如果是共生型真菌要盡可能詳盡地記錄共生樹(shù)種，土壤等條件。因?yàn)橐巴獠杉瘯r(shí)間有限，更詳細(xì)的記錄需要回到營(yíng)地進(jìn)行補(bǔ)充，另外，建議兩人一組，當(dāng)發(fā)現(xiàn)目標(biāo)，一人進(jìn)行拍攝，另一人記錄信息，以節(jié)省時(shí)間和精力。最后，將挖出的完整子實(shí)體置于不沾的吸水紙中，輕輕包裹好后編號(hào)置于采集籃中帶回。

當(dāng)日采集結(jié)束后要及時(shí)打開(kāi)吸水紙將菌物取出通風(fēng)，按照編號(hào)在記錄紙上對(duì)子實(shí)體新鮮狀態(tài)作詳細(xì)的記錄，主要包括：菌蓋的形狀、大小、顏色，是否粘，有無(wú)斑點(diǎn)或疣突，菌蓋中部及邊緣的特征；菌蓋菌肉的厚度、顏色、味道、氣味、受傷是否變色；菌褶的形狀、大小及著生方式，有無(wú)分泌物如乳滴，有無(wú)殘留菌幕；菌褶與菌柄的連接方式，柄受傷或觸摸后顏色的變化，上下部的顏色過(guò)渡，是否中空或半中空，柄內(nèi)菌肉的的顏色，有無(wú)腺點(diǎn)及菌環(huán)，基部是否膨大或有假根，菌柄的長(zhǎng)短粗細(xì)等，這些都是極其重要的分類(lèi)依據(jù)，尤其需要注意顏色的變化。同時(shí)，還要記錄采集地、采集人、采集時(shí)間、種名等信息。

記錄完成后進(jìn)行標(biāo)本的制作，首先將自制子實(shí)體干燥烘箱準(zhǔn)備好：將鐵板防風(fēng)罩支好，插入網(wǎng)眼托盤(pán)，將烘干用的PCT取暖器置于底層，風(fēng)口向上，圍上布簾，但注意留上部通風(fēng)。用酒精燈滅過(guò)菌的鑷子從每一號(hào)標(biāo)本上撕取或用小刀切取子實(shí)層的一小塊，再用裁好的吸水紙包好后置于盛有硅膠干燥劑的2號(hào)自封袋中制作成分子材料，或者同樣的方法獲得一小塊置于盛有Buffer的離心管中保存，此兩種方法用于進(jìn)一步的分子系統(tǒng)學(xué)研究。剩下的子實(shí)體縱向剖開(kāi)掛上標(biāo)簽(與記錄紙上的號(hào)必須一致)后置于網(wǎng)眼托盤(pán)上，打開(kāi)熱風(fēng)開(kāi)關(guān)進(jìn)行烘干，一般為6～8 h，之后通風(fēng)回潮20 min左右，根據(jù)大小裝入合適的自封袋中，野外采集任務(wù)結(jié)束后帶回存放于標(biāo)本館中作為憑證標(biāo)本。存放之前為每一份標(biāo)本制作一個(gè)貼有標(biāo)簽的標(biāo)本袋，標(biāo)簽上需登記標(biāo)本館號(hào)、標(biāo)本名稱(chēng)、采集地、采集日期、采集人、采集號(hào)及鑒定人等完整信息，并在標(biāo)本袋中附上標(biāo)本記錄紙的復(fù)印件，然后將標(biāo)本袋整理裝箱，用特大號(hào)自封袋將箱子連同里面的標(biāo)本一并密封放入標(biāo)本館的冰柜中冷凍兩個(gè)星期，目的是殺死蟲(chóng)卵，最后從冰柜中取出去掉自封袋放置一天進(jìn)行回潮，待回潮完畢將標(biāo)本按照標(biāo)本館號(hào)存入標(biāo)本庫(kù)中永久保存。同時(shí)，要在標(biāo)本館的登記簿上登記相應(yīng)的入館信息。特別注意的是，定學(xué)名和顏色時(shí)，可以參考《中國(guó)的真菌》( 鄧叔群，1963) 、《中國(guó)大型真菌》( 卯曉嵐，2000)[7]、《中國(guó)大型真菌原色圖鑒》( 黃年來(lái)，1998)[10]、《中國(guó)藥用真菌圖鑒》( 應(yīng)建浙)[11]、《中國(guó)野生大型真菌彩色圖鑒》( 劉旭東)[12]、《Farver I Farver》(Andrea kornerup og Johan Henrik Wanscher)色譜[13]等工具書(shū)。

3 顯微觀察

3.1 顯微觀察準(zhǔn)備

顯微鏡(DM-2500 of LEICA in Germany，帶顯微鏡DFC-450C成像繪圖管，用于子實(shí)體的顯微形態(tài)觀察和繪圖)、刀片(上海吉列刀片有限公司“飛鷹牌”S-74 型不銹鋼雙面刀FC片)、電腦、拍照軟件(Leica Application suite V4.3.0)、載玻片、蓋玻片、鑷子、吸水紙、鉛筆。

3.2 顯微觀察用試劑

KOH：將5 g或10 g的氫氧化鉀溶解于95 mL或90 mL蒸餾水中至完全溶解，制成5%或10%的氫氧化鉀溶液，常溫放置，用于干燥的子實(shí)體標(biāo)本的組織恢復(fù)，便于顯微鏡觀察。

剛果紅：用鈍頭鑷子夾取少許剛果紅棕紅色粉末溶于盛有蒸餾水的滴瓶中，混勻置于棕色瓶中常溫放置(以防止時(shí)間長(zhǎng)了產(chǎn)生沉淀影響觀察)，用于子實(shí)體組織的染色，便于觀察和顯微繪圖。

蒸餾水：均為蒸餾兩次的ddH2O。

3.3 顯微觀察

顯微觀察是系統(tǒng)分類(lèi)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，切片時(shí)，左手持干標(biāo)本，右手握刀片，用手臂的力量帶動(dòng)刀片切取要觀察的組織結(jié)構(gòu)，切取的組織盡可能要薄，以方便觀察。觀察內(nèi)容主要包括：擔(dān)子的形狀、大小、化學(xué)特征；擔(dān)子小梗的大?。粨?dān)孢子的形狀，大小；側(cè)生囊狀體、緣生囊狀體和柄生囊狀體的有無(wú)、形狀、大小、是否含有內(nèi)含物及在KOH溶液和梅試劑中的成色反應(yīng)；蓋表結(jié)構(gòu)和柄表結(jié)構(gòu)；菌髓菌絲等。將切取的待觀察組織塊放入載玻片上滴有5%或10%KOH溶液的液滴中，趕走組織塊中的氣泡，浸泡1～2 min使其組織恢復(fù)后，蓋上蓋玻片。然后在載玻片的一端滴一滴剛果紅溶液，用吸水紙從另一側(cè)吸引，使組織塊染色，或者在蓋蓋片之前，在有組織塊的KOH溶液旁邊滴一滴剛果紅溶液，用刀尖使其混勻，這樣可以使要觀察的組織塊更為均勻地染色。連接電腦與顯微鏡，觀察時(shí)先用10×低倍鏡進(jìn)行觀察，然后在10×100 油鏡下觀察并詳細(xì)記錄各部位的特征，再用Leica Application suite V4.3.0軟件分別對(duì)蓋表皮、菌肉、孢子、擔(dān)子、囊狀體、柄表皮等進(jìn)行拍照和測(cè)量，如果需要手繪圖的，可以按比例借助繪圖管繪制圖像，繪制完成后再用硫酸紙印描一遍，掃描至電腦中，用Adobe photoshop CS3修圖后方可在文中使用。具體操作如下。

以切蓋表皮為例，如果是完整的子實(shí)體，先將子實(shí)體沿縱軸剖開(kāi)，但是為方便烘干，多數(shù)情況在野外已將子實(shí)體縱向剖為兩半，然后在蓋緣至中心的1/2 處可將刀片與菌蓋表面垂直，沿菌蓋徑向做切片，盡可能越薄越好，一次可多切幾片組織塊，或者用鑷子在蓋表皮上撕取，注意撕取時(shí)鱗片和表皮分開(kāi)撕取。先在5%KOH中觀察，然后用剛果紅染色后進(jìn)行繪圖或者拍照。根據(jù)菌物的不同，可適當(dāng)延長(zhǎng)組織塊復(fù)水時(shí)間，保證觀察效果。蓋表皮菌絲及一些簇生或叢生的結(jié)構(gòu)一般會(huì)比較聚集不方便觀察，可以用橡皮或筆輕壓臨時(shí)裝片，使其結(jié)構(gòu)散開(kāi)，方法是按住蓋玻片的兩個(gè)對(duì)角，以穩(wěn)定待觀察的組織塊，右手用橡皮或筆末端輕敲玻片。由于菌絲長(zhǎng)度一般較長(zhǎng)無(wú)法測(cè)得，可進(jìn)行拍照并測(cè)量菌絲的寬度，將比例尺調(diào)至10 μm，需要測(cè)得一個(gè)最粗菌絲的寬度，再測(cè)一個(gè)最細(xì)的寬度，最后測(cè)10個(gè)均勻大小的菌絲的寬度，算出均值。其他部位的觀察類(lèi)似，可以測(cè)量長(zhǎng)度的結(jié)構(gòu)需要同時(shí)測(cè)量長(zhǎng)度和寬度。注意擔(dān)孢子在測(cè)量時(shí)因隨機(jī)尋找至少10-20個(gè)靜止不動(dòng)的成熟孢子，選取孢子的側(cè)面觀(看到孢子的臍突位于孢子頂端，孢子兩端都清晰)，測(cè)量其長(zhǎng)和寬并繪圖或拍照，注意臍突不在測(cè)量范圍內(nèi)，孢子的大小以長(zhǎng)乘以寬表示：(a)b-c(d)；Q 表示擔(dān)孢子的長(zhǎng)寬比，Q = a±b，a 表示擔(dān)孢子長(zhǎng)寬比的算術(shù)平均值，b 為標(biāo)準(zhǔn)差；[n/m/p]表示測(cè)量了p 份標(biāo)本的m 個(gè)子實(shí)體上的n個(gè)擔(dān)孢子。

4 分子生物學(xué)研究

4.1 研究材料及實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

研究所用的分子材料主要來(lái)自于野外采集時(shí)所保留的分子材料及標(biāo)本館的標(biāo)本。所用工具設(shè)備有記號(hào)筆、研磨棒、離心管、錐形瓶、石英砂、液氮、鑷子、酒精燈、移液槍、槍頭、冰浴盒、微波爐、高壓蒸汽滅菌、SCILOGEX離心機(jī)、METTLER TOLEDO pl203電子天平、SORVALL離心機(jī)、WD-9403C紫外成像儀、TaKaRa PCR熱循環(huán)儀、DRY BATH干式恒溫器、Thermo Gene company limited DNA檢測(cè)儀。

4.2 分子實(shí)驗(yàn)用試劑

1mol/LTris-Hcl：將12.11g Tris (三羥甲基氨基甲烷)充分溶解于90 mL ddH2O 中，加入濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值至所需值，加ddH2O定容至100 mL，使最終濃度為1 mol/L，1.034×105Pa 高壓蒸汽滅菌15min。

0.5 mol/L EDTA(pH8.0)：將46.5 g EDTA·Na·2H2O(二水乙二胺四乙酸二鈉)充分溶解于200 mL ddH2O中，用NaOH 調(diào)節(jié)溶液的pH 值至8.0，然后用ddH2O定容至250 mL，1.034×105Pa高壓蒸汽滅菌15 min。

50×TAE：將242 g Tris (三羥甲基氨基甲烷)溶于500 mL ddH2O中，加入57.1 mL冰醋酸，100 mL 0.5 mol/L EDTA(pH8.0)，然后用ddH2O定容至1000 mL。

4×CTAB 緩沖液: 將100 mL 1 mol/L Tris-HCl，40 mL 0.5 mol/L EDTA(pH8.0)，82 g NaCl，40 g CTAB充分溶于800 mLddH2O中，定容至1000 mL，1.034×105Pa 高壓蒸汽滅菌15 min。

去多糖Buffer：將100 mL 1 mol/L Tris-HCl，50 mL 0.5 mol/L EDTA(pH8.0)，7.305 g NaCl，充分溶于300 mL ddH2O中，定容至500 mL，1.034×105Pa 高壓蒸汽滅菌15 min，備用。

5 mol/L CH3COOK：將49.1 g KAc(醋酸鉀)充分溶解于90 mL ddH2O中，加ddH2O定容至100 mL，1.034×105 Pa 高壓蒸汽滅菌15 min。

1 mol/L CaCl2：將11.1 g CaCl2充分溶解于80 mL ddH2O中，定容至100 mL，-20 ℃保存。

50 mg/mL 氨芐青霉素：將5 g氨芐青霉素充分溶解于80 mL ddH2O中，然后加ddH2O定容至100 mL，用孔徑為0.22 μm濾器過(guò)濾除菌，分裝成1 mL小份貯存于-20 ℃。在使用時(shí)，每100 mL LB培養(yǎng)基加入貯存液100 μL，使工作濃度為50 μg/mL。

TE 緩沖液：80 mL ddH2O 中加入1 mol/L Tris-HCl(pH8.0)1 mL 和0.5 mol/LEDTA(pH8.0)200 μL，充分混勻，加ddH2O定容至100 mL，1.034×105 Pa 高壓蒸汽滅菌15 min，備用。

1%溴酚藍(lán)(1% bromophenol blue)：1 g溴酚藍(lán)溶于100 g水中。

4.3 分子研究方法

4.3.1 DNA 的提取(CTAB 法[14])

獲取高質(zhì)量的總DNA是進(jìn)行分子生物學(xué)研究的前提和基礎(chǔ)，大型真菌的細(xì)胞壁主要由幾丁質(zhì)和纖維素組成，以幾丁質(zhì)為主,幾丁質(zhì)具有保護(hù)作用,使得細(xì)胞壁堅(jiān)實(shí),不易裂解[15],因此在研磨過(guò)程中,需要把樣品磨至細(xì)粉狀，否則會(huì)影響DNA產(chǎn)量及質(zhì)量；但研磨時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，樣品會(huì)因長(zhǎng)時(shí)間研磨而發(fā)生褐變反應(yīng)，最終也會(huì)影響DNA產(chǎn)量及質(zhì)量，故操作時(shí)應(yīng)盡量在最短時(shí)間內(nèi)迅速把樣品研磨成細(xì)粉狀，以便提高DNA產(chǎn)量和質(zhì)量[16]，可以利用液氮快速冷凍進(jìn)行研磨，如果是比較容易研磨的樣品或者新鮮的樣品也可以不用液氮。下面介紹一種本實(shí)驗(yàn)室常用的DNA 提取法。

(1)根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要準(zhǔn)備1. 5 mL離心管數(shù)個(gè)，用記號(hào)筆在離心管蓋上標(biāo)記樣品號(hào)。用滅過(guò)菌的鑷子夾取適量干燥的分子材料放入離心管中，用移液槍加入500 μL4×CTAB緩沖液浸泡半小時(shí)左右，再加入少量石英砂，用研杵充分研磨，或者先加入200 μL4×CTAB緩沖液和少量石英砂研磨至糊狀，再加入300 μL4×CTAB 緩沖液繼續(xù)研磨液直至材料細(xì)膩均勻；也可利用液氮快速冷凍進(jìn)行研磨；

(2)提前10 min將置于-20 ℃保存DDT取出，常溫下融化，每管30 μL加入離心管中，充分混勻；

(3)將離心管放入調(diào)至65 ℃的干式恒溫器中，放置3 h(老材料5 h)，期間不定時(shí)輕搖；

(4)取出離心管，在離心管中加入200 μL 3M的CH3COOK溶液，充分混勻，置于冰浴盒中冰浴30 min；

(5)冰浴后取出離心管，加入500ìL氯仿-異戊醇(V∶V=24∶1)，輕搖2～3 min，置于離心機(jī)中10000 r/min離心10 min，從離心機(jī)中輕輕取出離心管，避免劇烈震蕩，吸取上清液導(dǎo)入新的離心管中并用記號(hào)筆標(biāo)注對(duì)應(yīng)的號(hào)，盡量避免吸到下層沉淀；

(6)在離心管中加入等體積的氯仿-異戊醇(V∶V=24∶1)，輕搖2～3 min，置于離心機(jī)中10000 r/min離心10 min，從離心機(jī)中輕輕取出離心管，吸取上清液棄下清液導(dǎo)入新離心管，注意盡量不要取到下層的沉淀；

(7)向盛有上清液的離心管中加入2/3 體積-20 ℃下預(yù)冷的無(wú)水乙醇，輕搖，放于-20 ℃的冰箱中，沉降過(guò)夜；

(8)第二天從冰箱中取出離心管，置于離心機(jī)中10000 r/min 離心10 min，棄上清液，注意動(dòng)作要輕，防止DNA丟失；

(9)加入200 μL 70%的乙醇洗兩次,然后再用無(wú)水乙醇洗一次，每次加入酒精洗滌時(shí)都要置于離心機(jī)中13000 r/min離心2 min，注意棄酒精時(shí)避免DNA丟失；

(10)將開(kāi)口的離心管放于調(diào)至37 ℃的烘箱或干式恒溫器中約0.5 h，使乙醇徹底揮發(fā)，可以聞一下無(wú)酒精味證明酒精已揮發(fā)；

(11)干燥后，加入200 μL滅過(guò)菌的ddH2O溶解DNA，搖勻，制成原液，保溫30 min，置于冰箱-4 ℃冷藏備用。

4.3.2 DNA含量檢測(cè)

首先將DNA檢測(cè)儀與電腦連接上，然后點(diǎn)擊電腦桌面上的NaNoDrop 2000/2000C軟件，在打開(kāi)的窗口中點(diǎn)擊Nuclic Acid按鈕，進(jìn)入到測(cè)試頁(yè)面。浸泡于酒精中的酒精棉擠干，擦拭儀器的探頭，酒精揮發(fā)干后先用移液槍滴1 μL的ddH2O，蓋上蓋子，然后單擊對(duì)話(huà)框中的Blank按鈕，進(jìn)行調(diào)試，沒(méi)有問(wèn)題后可以開(kāi)始測(cè)DNA樣品的含量。注意每次測(cè)之前都要用酒精棉對(duì)探頭進(jìn)行擦拭以免污染，酒精揮發(fā)干凈后再在探頭上滴1 μL 的待測(cè)樣品，取樣前搖勻，每次換槍頭避免污染。測(cè)試后得到吸收曲線(xiàn)及DNA含量，做好記錄，含量和峰值均達(dá)標(biāo)的進(jìn)行下一步操作，反之摒棄。

4.3.3 PCR(Polymerase Chain Reaction)擴(kuò)增

(1)PCR原理。在DNA聚合酶的催化下，以特定的DNA為模板和特定的核酸片段即PCR引物為擴(kuò)增起點(diǎn)和終點(diǎn)，通過(guò)變性、退火、延伸等步驟，在體外體系中復(fù)制出大量與母鏈模板中所需的DNA片段互補(bǔ)的子鏈DNA的過(guò)程。

(2)所需引物。在對(duì)大型真菌進(jìn)行分子系統(tǒng)學(xué)研究時(shí)，引物的主體通常是一段5’→3’的與靶序列嚴(yán)格互補(bǔ)的寡核苷酸短鏈，根據(jù)實(shí)驗(yàn)的不同目的，所選取的基因片段不同，一般可以選取ITS、mtLSU、mtSSU、nLSU、1 EF1a 等多基因片段進(jìn)行篩選和分析。由于ITS的序列分析能實(shí)質(zhì)性地反映出屬間、種間以及菌株間的堿基對(duì)差異，此外ITS序列片段較小，人們可以從不太長(zhǎng)的序列中獲得足夠的信息，易于分析，目前已被廣泛應(yīng)用于真菌屬內(nèi)不同種間或近似屬間的系統(tǒng)發(fā)育研究中[17]，并作為主要的分析方法應(yīng)用于大型真菌研究中。比較常用的ITS通用引物是：ITS1/ITS4；ITSF/ITS4；ITS5/ITS4。

(3)PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系。一般選用25 μL體系，包括10×Buffer(withMg2+)2.5 μL，2.5mM dNTPs 2.0 μL，0.1%BSA 2.5 μL，10 μM引物各1.5 μL，5U/μL 的TaqDNA聚合酶0.2 μL，DNA 模板5 μL，最后用ddH2O定容至25 μL。

(4)PCR 擴(kuò)增反應(yīng)熱循環(huán)參數(shù)。PCR反應(yīng)過(guò)程實(shí)際上是一個(gè)溫度循環(huán)變化的過(guò)程，一般包括變性—退火—延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟，其基本步驟如下：94 ℃變性5 min，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，連續(xù)35個(gè)循環(huán)；94 ℃變性1 min，48～53 ℃退火90 s，使寡核苷酸引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；72 ℃延伸2 min，在DNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈；循環(huán)結(jié)束后72 ℃延伸10 min，最后4 ℃或12 ℃保存。經(jīng)過(guò)一定數(shù)量的循環(huán)之后，待擴(kuò)目的DNA片段的數(shù)量將被擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。

4.3.4 瓊脂糖制膠電泳檢測(cè)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物步驟

(1)在電子天平中稱(chēng)量瓊脂糖粉0.5 g，倒入錐形瓶中；

(2)量取1×TAEBuffer 50 mL,倒入錐形瓶中，搖勻；

(3)將錐形瓶放入微波爐中，調(diào)至解凍檔加熱2～3 min使瓊脂糖粉充分溶解于1×TAE Buffer中；

(4)用棉手套從微波爐中取出錐形瓶，室溫冷卻至50～60 ℃，避免劇烈震蕩產(chǎn)生氣泡；

(5)向冷卻后的錐形瓶中加入Gold view核酸染料3 μL搖勻，避免產(chǎn)生氣泡；

(6)將膠液倒至電泳小槽底托中，在具有黑條帶的一側(cè)插入梳子，室溫冷卻凝固；

(7)凝固后拔出梳子，將底托連同凝膠一同移至電泳槽中；

(8)向電泳槽中加入1×TAE緩沖液直至沒(méi)過(guò)凝膠；

(9)依據(jù)需要擴(kuò)增的DNA樣的個(gè)數(shù)在塑料盒上點(diǎn)1%溴酚藍(lán)各1 μL，再將對(duì)照(DNA Marker D 2000)和擴(kuò)增產(chǎn)物分別取3μL 與溴酚藍(lán)混勻，注意用移液槍吸取DNA樣時(shí)需要更換槍頭，避免污染；

(10)混勻后點(diǎn)樣于制好的瓊脂糖凝膠上，先將DNA Marker 注入到長(zhǎng)方形小孔內(nèi)，再依次按順序點(diǎn)入待測(cè)樣，然后在電壓梯度4.5～5.5 V下電泳10～20 min；

(11)取出瓊脂糖凝膠置于紫外成像儀上觀察、照相并記錄結(jié)果，陽(yáng)性產(chǎn)物送樣測(cè)序。

4.3.5 產(chǎn)物測(cè)序

將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物或克隆后陽(yáng)性穿刺管送樣測(cè)序(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司、北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司)，測(cè)序儀為ABI3730 DNA 測(cè)序儀，測(cè)序引物分別為PCR 擴(kuò)增引物和克隆通用引物。

5 序列比對(duì)及分子數(shù)據(jù)分析

測(cè)序后，獲得多條相關(guān)序列，打開(kāi)Text文本建成“>種名_標(biāo)本館號(hào)序列”的格式并保存。在電腦中下載BioEdit軟件，可將這些序列建成FASTA格式文本備用。從網(wǎng)頁(yè)搜索Blast ( http: // blast. ncbi. nlm. nih. gov/Blast. Cgi )，打開(kāi)后點(diǎn)擊BASIC BLAST下的Nucleotide Blast選項(xiàng),彈出新對(duì)話(huà)框，在Enter Query sequence的選項(xiàng)內(nèi)粘貼FASTA格式文本中的一條序列，點(diǎn)擊Blast按鈕，彈出對(duì)話(huà)框中就會(huì)顯示多條Genbank中相關(guān)序列的信息，點(diǎn)擊列表中的Ident選項(xiàng)進(jìn)行相似度的排序，選取相似度在100%至97%的相關(guān)序列并逐條復(fù)制這些信息，同樣的方式粘貼至新建的Text文本中；或者另外一種方法是打開(kāi)BioEdit軟件，點(diǎn)擊Sequence選項(xiàng),在下拉菜單中點(diǎn)擊New sequence，在彈出對(duì)話(huà)框中輸入“>種名_標(biāo)本館號(hào)”，再將需要增加的序列粘貼到對(duì)話(huà)框中，點(diǎn)擊Apply就將Genbank中相關(guān)序列最終加入到了實(shí)驗(yàn)得到的序列中，這樣便豐富了相關(guān)序列的信息，便于更全方面的研究。所有自測(cè)序列和從Genbank中獲得的序列整合在一個(gè)Text文檔之后，即構(gòu)建了一個(gè)矩陣，再在BioEdit軟件中打開(kāi)，點(diǎn)擊Accessory Application,在下拉菜單中單擊Clustalw Multiple alignment,在新對(duì)話(huà)框中的Number of bootstraps中輸入100-1000，單擊Run clustalw按鈕即可，系統(tǒng)會(huì)自動(dòng)排序。但是系統(tǒng)排序的結(jié)果還需要進(jìn)一步進(jìn)行手動(dòng)排序，原則是在“Edit”狀態(tài)下通過(guò)刪除“D”(Delete gaps with right mouse click)或增加“I”(Insert gaps with right mouse click)選項(xiàng)手動(dòng)刪除或添加空格以達(dá)到縱向?qū)R的效果，還要對(duì)照序列圖譜人工檢查自測(cè)序列每一個(gè)堿基的準(zhǔn)確性，必要時(shí)進(jìn)行簡(jiǎn)并堿基替換，方法是在原始序列中查看對(duì)應(yīng)的曲線(xiàn)峰圖，對(duì)照峰圖檢查堿基是否異常，如果出現(xiàn)錯(cuò)誤則回到自己的序列中進(jìn)行更正。雙向獲得的序列同Chroma人工核對(duì)拼接后再用于比對(duì)。核對(duì)完成之后，以ITS 序列為例, 18s區(qū)的“GGAAGGATCATTA”堿基向前的部分和28s區(qū)的“TGACCTCAGGCA”以后的部分應(yīng)該被刪掉，有些序列不足夠長(zhǎng)的需在末尾用空格補(bǔ)齊，所有序列做到頭尾完全對(duì)齊后，點(diǎn)擊鎖定按鈕將序列鎖定后保存為FASTA格式或者PHILIP格式備用。跑樹(shù)一種方法是點(diǎn)擊Clustalx軟件彈出對(duì)話(huà)框，在File選項(xiàng)中點(diǎn)擊Load sequence選項(xiàng)加載核對(duì)好的“FAS.”格式序列，再點(diǎn)擊File選項(xiàng)下的Save sequences as選項(xiàng),在彈出對(duì)話(huà)框中選擇NEXUS，然后保存成NEXUS 格式文本文件，雙擊該文件，在對(duì)話(huà)框最底部粘貼編輯好的“命令”，保存并點(diǎn)擊Start按鈕開(kāi)始跑樹(shù)，即最大簡(jiǎn)約性分析(Most parsimony：MP)分析。另一種方法是將PHILIP格式文本文件連同raxml-command軟件和raxmlHPC程序存放入同一個(gè)文件中，選中軟件點(diǎn)擊右鍵彈出對(duì)話(huà)框，在編輯對(duì)話(huà)框中更改設(shè)置，保存后雙擊該軟件即開(kāi)始跑樹(shù)，即最大似然性分析(Maximum Likelihood：ML)。除此之外，比較常用的還有貝葉斯分析(Bayesian Analysis)，與最大簡(jiǎn)約性分析相比，貝葉斯分析的優(yōu)點(diǎn)是所需要的運(yùn)算時(shí)間短，可用于快速構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)和獲得檢驗(yàn)概率。

6 結(jié)語(yǔ)

自然界中真菌種類(lèi)繁多、形態(tài)各異，依靠形態(tài)、生化等表型特征來(lái)鑒定真菌，既需要豐選項(xiàng)的的鑒定工作經(jīng)驗(yàn)又需要較長(zhǎng)的檢驗(yàn)時(shí)間，困難較大，尤其是我國(guó)有著豐富的植被類(lèi)群，地理生態(tài)環(huán)境復(fù)雜，故大型真菌種類(lèi)豐富多樣，對(duì)于那些生長(zhǎng)條件特殊、形態(tài)相似的菌株要通過(guò)傳統(tǒng)的表型特征鑒定方法來(lái)加以鑒別顯得非常困難，因此，本文結(jié)合形態(tài)觀察、顯微觀察及分子生物學(xué)方法在大型真菌的分子生物學(xué)鑒定中的應(yīng)用作初步的介紹與分析。做好大型真菌的分類(lèi)，除了對(duì)分類(lèi)學(xué)研究具有重要的意義外，還可以更好的服務(wù)于人類(lèi)。例如，大型真菌里很多種類(lèi)都是美味的野生食用菌，所以很多地區(qū)都有采集野生菌食用的傳統(tǒng)[18，19]，常見(jiàn)的有香菇、金針菇、平菇、木耳、銀耳、羊肚菌等，目前很多種類(lèi)均已人工馴化成功，并投入生產(chǎn)出現(xiàn)在老百姓日常的餐桌，它們既是一類(lèi)重要的大型食用真菌，又是食品和制藥工業(yè)的重要資源；一些大型真菌能夠分解枯死植物，對(duì)維持自然界物質(zhì)循環(huán)、生態(tài)平衡有重要的作用；此外，很多野生大型真菌都是有毒的，每年全世界都有大型真菌中毒致死事件發(fā)生，誤食后會(huì)出現(xiàn)腹瀉、嘔吐、精神錯(cuò)亂等癥狀，嚴(yán)重者會(huì)出現(xiàn)肝臟、腎臟受損或心力衰竭而導(dǎo)致死亡，出現(xiàn)誤食的原因往往是由于對(duì)野生真菌的了解相對(duì)缺乏；一些大型真菌能引起樹(shù)木病害或損害多種木質(zhì)產(chǎn)品，對(duì)此類(lèi)病原真菌的認(rèn)識(shí)的加強(qiáng)，有利于預(yù)防和減少危害的發(fā)生。因此，對(duì)大型研究的是十分重要的，相關(guān)知識(shí)的普及也尤為重要。

致謝

感謝導(dǎo)師孫麗華教授的指導(dǎo)和幫助；感謝中國(guó)科學(xué)院昆明植物所劉培貴教授提供的科研平臺(tái)；感謝實(shí)驗(yàn)室王向華博士在野外采集及科研過(guò)程中給予的指導(dǎo)和幫助，感謝時(shí)小菲博士前期的工作奠定的基礎(chǔ)；感謝實(shí)驗(yàn)室的同學(xué)們?cè)趯?shí)驗(yàn)中提供十分有價(jià)值的討論和幫助，值此表示誠(chéng)摯的敬意和衷心的感謝！

[1]饒俊,李玉.大型真菌的野外調(diào)查方法[J].生物學(xué)通報(bào), 2012(5):1～6.

[2]Hawksworth D L. The fungal dimension of biodiversity: magnitude, significance, and conservation[J]. Mycological research, 1991(95): 641～655.

[3]Kohlmeyer J, Volkmann-Kohlmeyer B. The biodiversity of fungi on Juncus roemerianus[J]. Mycological research, 2001, 105(12): 1409～1412．

[4]劉培貴，王向華，于富強(qiáng)．中國(guó)大型真菌生物多樣性的關(guān)鍵類(lèi)群[J].云南植物研究，2003，25(3):285～296．

[5]HaRRIngton T J. Relatinonships between macrofungi and vegetation in the burren[J]. Biology and enviroment, 2003, 103 (3): 147～159．

[6]卯曉嵐.中國(guó)蕈菌[M].重慶:重慶出版社,2009．

[7]卯曉嵐.中國(guó)大型真菌[M].鄭州:河南科學(xué)技術(shù)出版社,2000．

[8]中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì).中國(guó)植物志[M].北京；科學(xué)出版社,2004.

[9]何炎炘，方 杰，吳旺寶，等.大型真菌野外實(shí)習(xí)的探索[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43(7) :385～386,388.

[10]黃年來(lái)．中國(guó)大型真菌原色圖鑒[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,1998．

[11]應(yīng)建浙，卯曉嵐，馬啟明，等．中國(guó)藥用真菌圖鑒[M].北京:科學(xué)出版社,1978．

[12]劉旭東．中國(guó)野生大型真菌彩色圖鑒[M]．北京: 中國(guó)林業(yè)出版社,2004．

[13]Andrea kornerup， Johan Henrik Wanscher.《Farver I Farver》[M], politikens forlag K BENHAVN, 1961.

[14]Doyle J J, Doyle J L. A rapid DNA isolation procedure for small qualities of fresh leaf tissue. Phytochemical Bulletin, 1987(19): 11～15.

[15]張明,趙呈裕.絲狀真菌高分子量DNA的提取研究[J].廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),1998,15(2): 41～43.

[16]周玲玲，梁俊峰.大型真菌DNA提取方法的改進(jìn)[J].廣東林業(yè)科技，2011,27(1)：13～16.

[17]Iwen PC, Hinrichs S H, Rupp M E.Utilization of the internal tran-scribed spacer regions as molecular targets to detect and identify human fungal pathoge[J].MedMycol, 2002(40): 87～109.

[18]應(yīng)建浙，趙繼鼎，卯曉嵐，等．食用蘑菇[M]．北京: 科學(xué)出版社，1982:1～235．

[19]臧 穆，黎興江，周遠(yuǎn)寬．云南食用菌的生物多樣性及其資源保護(hù)[J]．中國(guó)食用菌，2005，24(6) :3～4．

AnalysisMethod of Field Collection and Classification Research on Macrofungi in China

Li Bo,Sun Lihua

(FacultyofBiologicalSciencesandTechnology,BaotouTeachersCollege,Baotou,InnerMongolia014030,China)

Macrofungi is an important group of fungi.The relevant studies in China were late, but we have explored our ownanalysismethod of the field collection and classification research. Two parts of the analysis methods of macrofungi were described detailedly in this paper: one was the field collection part including field collection strategy, preparations for collecting and field work; the other was work the laboratory including morphology observation, microscopic observation, DNA extraction, PCR amplification and molecular data analysis etc.in molecular biological study.

macrofungi; field collection; microscopic observation; molecular biological study

2016-08-23

李 博(1983—)，女，包頭師范學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院碩士研究生。

孫麗華(1966—)，女，教授，主要從事塊菌方面的研究工作。

Q34

A

1674-9944(2016)18-0176-06