林 輝，孫萬春，王 飛，王斌，翁 穎，馬軍偉*，符建榮

（1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境資源與土壤肥料研究所，杭州3 10021；2.寧波市種植業(yè)管理總站，浙江 寧波 315012；3.鄞州區(qū)農(nóng)林局，浙江 寧波 315100；4.慈溪市農(nóng)業(yè)監(jiān)測(cè)中心，浙江 寧波 315310）

有機(jī)肥中重金屬對(duì)菜田土壤微生物群落代謝的影響

林 輝1，孫萬春1，王 飛2，王斌3，翁 穎4，馬軍偉1*，符建榮1

（1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境資源與土壤肥料研究所，杭州3 10021；2.寧波市種植業(yè)管理總站，浙江 寧波 315012；3.鄞州區(qū)農(nóng)林局，浙江 寧波 315100；4.慈溪市農(nóng)業(yè)監(jiān)測(cè)中心，浙江 寧波 315310）

基于慈溪掌起鎮(zhèn)的蔬菜施肥試驗(yàn)，結(jié)合常規(guī)理化分析和MicroRESPTM方法，在2年4次施肥后，分析不施肥（CK）、重金屬達(dá)標(biāo)商品有機(jī)肥（T1）和Pb-As-Cu-Zn添加有機(jī)肥（T2）施用土壤的基本理化性質(zhì)、重金屬累積以及微生物群落代謝特征，探討重金屬對(duì)施用有機(jī)肥土壤微生物群落代謝特征的影響。結(jié)果表明，T1和T2顯著提高了旱地蔬菜輪作土壤有機(jī)質(zhì)和部分養(yǎng)分含量，且二者無顯著差異。但從重金屬含量上看，T2土壤Cu、Zn全量以及有效態(tài)Cu、Zn、As含量顯著高于T1和CK土壤?；贛icroRESPTM的微生物群落代謝特征分析指出，與CK相比，T1顯著促進(jìn)了土壤基礎(chǔ)呼吸作用和微生物代謝功能多樣性，T2卻無類似的促進(jìn)效果，可見T2土壤Cu、Zn和有效態(tài)As含量的大幅增加削弱了有機(jī)肥中有機(jī)質(zhì)等養(yǎng)分對(duì)土壤微生物的促進(jìn)作用。主成分和聚類分析進(jìn)一步表明，T1與T2土壤的微生物群落水平生理指紋圖譜（CLPP）存在明顯差異，T2土壤中重金屬及其有效性的增加誘導(dǎo)檸檬酸、蘋果酸和草酸等羧酸代謝利用增強(qiáng)。綜上，畜禽糞便有機(jī)肥對(duì)菜田土壤微生物群落代謝的作用同時(shí)受到有機(jī)肥本身及其殘留重金屬的影響，有機(jī)肥中過高的重金屬殘留會(huì)改變有機(jī)肥養(yǎng)分對(duì)土壤微生物代謝的影響。

畜禽糞便；有機(jī)肥；菜田土壤；重金屬；土壤微生物群落功能

現(xiàn)代養(yǎng)殖生產(chǎn)中，飼料添加劑的大量使用，使得大規(guī)模集約化養(yǎng)殖的畜禽糞便與傳統(tǒng)分散養(yǎng)殖的畜禽糞便在成分、性質(zhì)等方面都有了較大的改變，甚至導(dǎo)致有機(jī)肥料質(zhì)量發(fā)生根本性的轉(zhuǎn)變，其中畜禽養(yǎng)殖源有機(jī)肥料中重金屬污染值得高度關(guān)注[1-2]。2005年，劉榮樂等[3]、黃鴻翔等[4]對(duì)我國(guó)8省市有機(jī)肥中重金屬的調(diào)研報(bào)告指出，與20世紀(jì)90年代初相比，當(dāng)前部分有機(jī)廢棄物中的重金屬含量增加顯著，例如雞糞和豬糞中Zn、Cu、Cr、Cd、As、Hg以及牛糞中Zn、Cu、As、Hg，豬雞糞中的Cu、Zn含量甚至增加了將近12倍[5]。伴隨有機(jī)肥的施用，這些重金屬可以在土壤中累積、遷移。在通常情況下，土壤中的重金屬保持在一定濃度范圍內(nèi)，并不表現(xiàn)出對(duì)環(huán)境或者作物的明顯影響，但是重金屬含量超過土壤的承載能力時(shí)，就會(huì)表現(xiàn)出一系列的危害，例如在作物中累積，降低土壤質(zhì)量等[6-8]。

土壤微生態(tài)是土壤的重要組成部分，也是土壤健康的主要內(nèi)容，是評(píng)價(jià)土壤質(zhì)量的生物學(xué)指標(biāo)之一。土壤微生物的代謝行為可以在一定程度上反映土壤活力和質(zhì)量，也與土壤生態(tài)系統(tǒng)平衡維系密切相關(guān)[9]。相對(duì)于土壤動(dòng)物和植物，土壤微生物對(duì)重金屬脅迫更加敏感[10]。重金屬對(duì)土壤微生物生物量[11-12]、生理生態(tài)參數(shù)[13-14]、呼吸強(qiáng)度[13]、微生物群落代謝功能[12]以及結(jié)構(gòu)[11，15]的影響均有報(bào)道，總的來講，重金屬對(duì)土壤微生物多樣性及代謝的影響多為抑制效應(yīng)。Sheik等[16]分析不同制革廠周邊采集的土壤樣品，發(fā)現(xiàn)重金屬污染土壤的細(xì)菌群落多樣性顯著低于對(duì)照土壤。值得注意的是，以往多數(shù)的重金屬土壤微生態(tài)效應(yīng)研究只是在重金屬單獨(dú)作用條件下得出的，較少考慮到其載體介質(zhì)如污泥、有機(jī)肥的作用。但是對(duì)于農(nóng)田土壤微生態(tài)系統(tǒng)而言，畜禽糞便及其有機(jī)肥的施用是農(nóng)田土壤重金屬的主要來源[17]。因此，伴隨有機(jī)肥進(jìn)入土壤的重金屬對(duì)土壤微生態(tài)的影響應(yīng)該是有機(jī)肥和重金屬的綜合效應(yīng)。有機(jī)肥對(duì)土壤微生物的積極作用一直是得到認(rèn)可的[18-19]。在Zhen等[20]的研究報(bào)道中，復(fù)合施用有機(jī)肥和微生物肥料能夠幫助提高被破壞的低等耕地土壤質(zhì)量，快速改善其土壤微生物結(jié)構(gòu)，增加土壤微生物多樣性。但是在目前畜禽糞便有機(jī)肥重金屬殘留量日益增加的情況下，有機(jī)肥的土壤微生物效應(yīng)又會(huì)發(fā)生何種改變卻少有報(bào)道。農(nóng)業(yè)部發(fā)布的有機(jī)肥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY525—2012明確規(guī)定了商品有機(jī)肥中As、Pb等5種重金屬的限量指標(biāo)，然而，重金屬達(dá)標(biāo)和超標(biāo)有機(jī)肥對(duì)農(nóng)田土壤微生態(tài)的影響及其差異卻不明確，國(guó)內(nèi)外也鮮有相關(guān)研究。事實(shí)上，以上結(jié)果的探明對(duì)于指導(dǎo)畜禽糞便有機(jī)肥的安全施用，評(píng)價(jià)其農(nóng)用的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)，甚至對(duì)有機(jī)肥產(chǎn)業(yè)未來的發(fā)展都具有重要意義和參考價(jià)值。

本文基于慈溪掌起鎮(zhèn)的旱地蔬菜試驗(yàn)，以經(jīng)過2年4季施肥處理的土壤為研究對(duì)象，結(jié)合土壤理化分析、重金屬測(cè)定和MicroRESPTM方法，以不施肥（CK）處理為對(duì)照，分析重金屬達(dá)標(biāo)商品有機(jī)肥（T1）和高重金屬殘留有機(jī)肥（T2）處理菜田土壤的基本理化性質(zhì)、重金屬含量以及微生物群落代謝特征變化，研究不同重金屬殘留水平有機(jī)肥施用土壤微生物群落代謝特征差異，旨在為畜禽糞便有機(jī)肥的安全施用和生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

施肥定位試驗(yàn)設(shè)在慈溪市掌起鎮(zhèn)綠佳果蔬農(nóng)場(chǎng)，該地屬于亞熱帶氣候。土壤屬于粉砂土，pH 8.04，電導(dǎo)率（EC）142.0 μS·cm-1，有機(jī)質(zhì)10.07 g·kg-1，全氮1.10 g·kg-1，有效磷15.61 mg·kg-1，速效鉀73.0 mg·kg-1。

試驗(yàn)始于2014年，本文涉及3個(gè)試驗(yàn)處理：不施肥處理（CK）；重金屬達(dá)標(biāo)商品有機(jī)肥，施用量7.50 t·hm-2（T1）；重金屬添加有機(jī)肥，施用量7.50 t· hm-2（T2）。每處理小區(qū)面積20 m2，隨機(jī)排列，每處理3個(gè)重復(fù)。蔬菜連作，1年2季：2014年為結(jié)球甘藍(lán)-糯玉米輪作；2015年為雪菜-結(jié)球甘藍(lán)輪作。每季蔬菜種植前，施入有機(jī)肥，所有有機(jī)肥均作基肥施用，均勻撒施到土壤耕層（0～20 cm）。按照當(dāng)?shù)厥┓柿?xí)慣和作物生長(zhǎng)情況，追施無機(jī)肥。

供試有機(jī)肥為慈溪市中慈生態(tài)肥料有限公司生產(chǎn)的商品有機(jī)肥和自制的重金屬添加有機(jī)肥。商品有機(jī)肥以雞糞為主要原料，其中Cu 85.44 mg·kg-1、Zn 478.45 mg·kg-1、Pb 5.4 mg·kg-1、As 2.4 mg·kg-1，低于有機(jī)肥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY 525—2012規(guī)定的最高重金屬限量值，為重金屬達(dá)標(biāo)有機(jī)肥。重金屬添加有機(jī)肥以添加了一定量重金屬的雞糞為主要原料，采用與商品有機(jī)肥相同的制備方法，經(jīng)過堆肥發(fā)酵、后熟和烘干等流程。重金屬添加方法為：在雞糞原料（干基計(jì)）中添加75 mg·kg-1Pb和30 mg·kg-1As，使得添加后雞糞中的Pb和As含量比商品有機(jī)肥重金屬限量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定提高1～2倍；考慮到在現(xiàn)代集約化畜禽養(yǎng)殖業(yè)中，超劑量使用Cu、Zn等微量元素添加劑非常普遍[5]，畜禽糞便已成為土壤中Cu、Zn的一個(gè)主要來源[17]，其對(duì)Cu、Zn在土壤中累積的年貢獻(xiàn)率可以達(dá)到40%和17%[17]，因此在雞糞中同時(shí)添加100 mg·kg-1Cu和500 mg·kg-1Zn，使得添加后雞糞中的Cu含量比未添加前增加1～2倍；制得重金屬超標(biāo)雞糞。以上述重金屬超標(biāo)雞糞制備獲得的有機(jī)肥含Cu 718.48 mg·kg-1、Zn 1 356.38 mg·kg-1、Pb 50.48 mg·kg-1、As 9.04 mg·kg-1，4種重金屬全量均顯著增加，對(duì)照NY 525—2012規(guī)定的重金屬限量要求，Pb略超標(biāo)，本文將其描述為重金屬添加有機(jī)肥（Pb-As-Cu-Zn添加有機(jī)肥）。

1.2 樣品采集及處理

經(jīng)2年4季作物栽培，在2015年結(jié)球甘藍(lán)收獲后，按照土壤采樣規(guī)則，在每試驗(yàn)小區(qū)按照S形多點(diǎn)法采集0～20 cm的耕層土壤，同一小區(qū)土壤混合均勻形成一個(gè)土壤樣品。土壤樣品去除石礫、植物殘?bào)w等后，分成3份。一份土樣風(fēng)干后用于土壤理化指標(biāo)測(cè)定，另一份土樣先采用四分法取壓碎樣，過孔徑20目尼龍篩，隨后繼續(xù)研磨至過100目篩用于土壤元素全量分析。最后一份新鮮土樣采集后立即于4℃冷藏保存，一周內(nèi)完成MicroRESPTM分析。

1.3 土壤基本理化性狀

土壤基本理化性質(zhì)指標(biāo)測(cè)定參照《土壤理化分析》[21]。新鮮樣本用于測(cè)定含水率、pH值、電導(dǎo)率（EC）。含水率采用烘箱干燥法測(cè)定；pH值和EC按1∶2.5固液比浸提，濾液分別用pH計(jì)和電導(dǎo)儀測(cè)定。風(fēng)干樣品用于測(cè)定總碳、總氮等其他養(yǎng)分參數(shù)?？傆袡C(jī)碳和總氮采用元素分析儀測(cè)定；總磷采用釩鉬黃比色法測(cè)定；總鉀采用火焰光度計(jì)法測(cè)定。

1.4 重金屬測(cè)定

土壤重金屬全量測(cè)定嚴(yán)格按照《中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》（NY/T 1613—2008），采用王水回流消解法進(jìn)行消解。土壤有效態(tài)Cu、Pb、Zn采用DTPA（二乙三胺五乙酸）提取劑浸提后進(jìn)行含量測(cè)定（GB/T 23739—2009），土壤有效態(tài)As采用0.1 mol·L-1鹽酸[22]浸提后進(jìn)行含量測(cè)定。采用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀（ICP-OES）測(cè)定Pb、Cu、Zn含量。按照《中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)》（GB/T 22105.2—2008），采用原子熒光法測(cè)定As含量。

1.5 MicroRESPTM方法

MicroRESPTM技術(shù)是一種基于土壤微生物代謝功能研究土壤微生物生態(tài)的方法，其利用土壤在不同碳源誘導(dǎo)下的CO2產(chǎn)生情況來表征土壤微生物群落水平的生理特征[23]。與傳統(tǒng)微生物平板培養(yǎng)法、Biolog微平板法和多重底物誘導(dǎo)呼吸法相比具有明顯優(yōu)勢(shì)。MicroRESPTM技術(shù)可克服微生物平板法只能測(cè)定可培養(yǎng)微生物、Biolog微平板法依賴土壤懸浮液提取物和細(xì)胞后續(xù)生長(zhǎng)情況、多重底物誘導(dǎo)呼吸自動(dòng)化程度低等缺點(diǎn)，是研究原位土壤微生物群落水平生理特征的一種較為靈敏、快捷的測(cè)定方法[24]。操作步驟如下：

（1）4℃冷藏保存的土壤樣品必須預(yù)培養(yǎng)活化微生物：均勻稱取50 g新鮮土壤于燒杯中，根據(jù)土壤樣品含水率明確土壤濕度，將所有土壤濕度調(diào)至一致（20%～30%之間），保鮮膜封口后，25℃預(yù)培養(yǎng)4 d。

（2）檢測(cè)板配制：在900 mL超純水中依次加入18.75 mg甲酚紅，16.77 g氯化鉀和0.315 g碳酸氫鈉，溶解后形成指示劑。同時(shí)配制3%的純化瓊脂（Sigma），121℃滅菌20 min充分溶解，冷卻到60℃，加入2倍膠體積的指示劑，混合均勻后取150 μL指示瓊脂添加到檢測(cè)板的微孔中，配制好的檢測(cè)微孔板存放在含有堿石灰的避光干燥器里待用。

（3）檢測(cè)：將待測(cè)土壤樣品均勻添加到96孔深孔板中，并在每個(gè)深孔板中添加16種碳源底物（mg C· g-1soil water），分別為：水，0；L-丙氨酸，30；L-阿拉伯糖，30；精氨酸，30；半胱氨酸鹽酸鹽，30；檸檬酸，30；D-果糖，30；D-半乳糖，30；D-葡萄糖，30；γ-氨基丁酸，30；L-賴氨酸，30；L-蘋果酸，30；N-乙酰葡糖胺，7.5；草酸，30；原兒茶酸，7.5；海藻糖，30。將檢測(cè)板倒扣在深孔板上，用夾子固定，在25℃下培養(yǎng)6 h。采用酶標(biāo)儀讀取570 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)板在土壤樣品培養(yǎng)前和培養(yǎng)后6 h的吸光值，利用吸光值差異計(jì)算CO2產(chǎn)生率（%）。

CO2產(chǎn)生率和吸光度數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化計(jì)算公式[23]為：

式中：At6為檢測(cè)板在培養(yǎng)6 h后的A570；At0為培養(yǎng)前（0 h）的A570；A=-0.226 5；B=-1.606，D=-6.771；WCO2為CO2產(chǎn)生率，μg·g-1·h-1；T為培養(yǎng)溫度，25℃；L為檢測(cè)板孔體積，945 μL；W為土壤鮮重；U為土壤含水率；t為培養(yǎng)時(shí)間，6 h。

1.6 數(shù)據(jù)處理

利用多樣性指數(shù)分析不同施肥處理對(duì)土壤微生物群落多樣性的影響。Shannon-Winner香農(nóng)多樣性指數(shù)（H′）表示整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)土壤微生物群落利用碳源類型的多與少，即功能多樣性。生態(tài)系統(tǒng)香農(nóng)多樣性指數(shù)值越大，該系統(tǒng)的土壤微生物群落功能多樣性越高，反之則多樣性越低。Simpson辛普森多樣性指數(shù)（D）也可用于判斷細(xì)菌群落多樣性，群落中物種越多、各種個(gè)體分配越均勻則辛普森多樣性指數(shù)越高，群落多樣性越好。Simpson多樣性指數(shù)中稀有物種所起的作用較小，而普遍物種所起的作用較大。均勻度指數(shù)（E）是通過Shannon多樣性指數(shù)計(jì)算出來的均度，包含兩個(gè)因素，其一是種類數(shù)目，即豐富度，其二是種類中個(gè)體分布的均勻性。種類數(shù)目越多，多樣性越大；同樣，種類之間個(gè)體分配的均勻性增加也會(huì)使多樣性提高。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2004和SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。不同處理差異顯著性分析采用單因素方差分析（One-way ANOVA，最小顯著差法LSD）。采用SigmaPlot 10.0作圖，SPSS 15.0作主成分分析和聚類分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同施肥處理土壤理化性狀和重金屬累積差異

由表1可知，T1和T2土壤有機(jī)質(zhì)、有效磷和速效鉀含量顯著高于CK，無論是重金屬達(dá)標(biāo)商品有機(jī)肥還是Pb-As-Cu-Zn添加有機(jī)肥的施用均可以提高土壤有機(jī)質(zhì)和部分養(yǎng)分含量，與以往的研究報(bào)道基本一致[18，25]。不同施肥處理土壤中的重金屬全量和有效態(tài)含量大小基本為T2＞T1＞CK。與CK土壤相比，T1土壤Cu、Pb、Zn、As全量無顯著變化，但有效Zn含量顯著增加。T2土壤中的Cu、Zn全量顯著高于CK和T1，但Pb和As全量在3個(gè)處理間無顯著差異。T2土壤中的有效Cu、有效Zn和有效As含量也顯著高于其他兩個(gè)處理?？傮w來說，2年4季的重金屬達(dá)標(biāo)商品有機(jī)肥施用僅顯著增加菜地土壤有效Zn含量；同樣情況下，供試重金屬添加有機(jī)肥施用不僅顯著增加了土壤Cu、Zn全量，且使得土壤有效Cu、Zn、As含量顯著上升。

2.2 重金屬對(duì)有機(jī)肥施用土壤基礎(chǔ)呼吸的影響

土壤基礎(chǔ)呼吸可以表征土壤碳素的周轉(zhuǎn)速率及微生物的總體活性，在一定程度上反映環(huán)境脅迫情況[10，26]。圖1表示不同施肥處理下土壤微生物在不添加外源底物下的基礎(chǔ)呼吸。T1顯著增加了土壤基礎(chǔ)呼吸，而T2與CK的土壤基礎(chǔ)代謝無顯著差異。

表1 不同施肥處理土壤的基本理化性質(zhì)和重金屬含量Table 1 The basal physic-chemical properties and heavy metal contents of soil samples from different fertilization treatments

有機(jī)肥對(duì)土壤基礎(chǔ)呼吸作用的促進(jìn)早有報(bào)道，其一般通過增加土壤有機(jī)碳來提高土壤微生物量、土壤活性，進(jìn)而增加土壤呼吸強(qiáng)度[27]。本文中商品有機(jī)肥施用土壤后基礎(chǔ)呼吸作用的增強(qiáng)也支持了這一結(jié)論。但是目前獲得的土壤理化和重金屬指標(biāo)中（表1），我們發(fā)現(xiàn)T1與T2土壤僅在部分重金屬含量上存在顯著差異，T1處理刺激土壤基礎(chǔ)呼吸，T2處理則無明顯影響，二者的差異暗示了有機(jī)肥中重金屬殘留會(huì)改變有機(jī)肥對(duì)土壤基礎(chǔ)呼吸的影響。研究表明，重金屬對(duì)土壤呼吸的影響存在濃度效應(yīng)，例如，低濃度的重金屬可以刺激土壤CO2釋放。這種效應(yīng)的產(chǎn)生主要是因?yàn)樵谖廴久{迫下，土壤微生物為了維持正常的生命活性需要更多的能量維持生理需要，最終表現(xiàn)為重金屬脅迫下呼吸強(qiáng)度增加[15]。但是，過高濃度的重金屬也可以與碳源結(jié)合形成復(fù)合物，抑制微生物代謝或者直接殺死微生物[28]，因而表現(xiàn)為重金屬濃度增加，呼吸強(qiáng)度降低。例如，在楊元根等[14]的研究中，長(zhǎng)期暴露于低濃度Cu中的土壤微生物具有較高的呼吸速率，而暴露于高濃度Cu中的土壤微生物呼吸速率較低。因此，T1土壤中的重金屬可能由于全量或其有效態(tài)含量較低而未達(dá)到抑制濃度或者重金屬的抑制活性被有機(jī)肥中有機(jī)質(zhì)等所緩解。

圖1 不同施肥處理對(duì)土壤基礎(chǔ)呼吸的影響Figure 1 Effects of different fertilization treatments on the soil basal respiration

已有研究證實(shí)，外源有機(jī)質(zhì)進(jìn)入土壤可以在一定程度上緩解重金屬脅迫導(dǎo)致的微生物活性、數(shù)量[15]以及微生物功能多樣性的下降[29]。相反，T2土壤中重金屬污染水平可認(rèn)為已達(dá)到抑制水平，因而掩蓋或者削弱了有機(jī)肥本身對(duì)土壤基礎(chǔ)呼吸的促進(jìn)作用。重金屬的形態(tài)與其生物毒性密切相關(guān)，一般來說，伴隨重金屬形態(tài)從不穩(wěn)定向穩(wěn)定遷移，其生物活性降低[30]。Ghosh等[31]研究證實(shí)，有效As對(duì)土壤基礎(chǔ)呼吸的抑制遠(yuǎn)大于全As，因而T2處理所帶來的土壤有效As含量的顯著增加不容小覷，其可能是T2與T1土壤基礎(chǔ)呼吸差異的重要原因之一。此外，值得格外關(guān)注的是，T2土壤中Cu、Zn有效態(tài)含量和全量的顯著大幅增加。雖然Zn和Cu是植物生長(zhǎng)必需的微量元素，但當(dāng)它們?cè)谕寥乐械暮砍^一定限度時(shí)，也可對(duì)土壤微生物產(chǎn)生毒性效應(yīng)。

2.3 重金屬對(duì)有機(jī)肥施用土壤微生物群落功能多樣性的影響

微生物有多種多樣的代謝方式和生理功能，可以適應(yīng)各種生態(tài)環(huán)境并與其他生物相互作用。土壤微生物群落功能多樣性可以表征土壤微生物群落利用碳源類型的差異，同時(shí)在一定程度上反映土壤微生物的種類和分布情況。由表2可知，T1的Shannon指數(shù)、均勻度指數(shù)和Simpson指數(shù)最大，表明達(dá)標(biāo)重金屬商品有機(jī)肥施用土壤的微生物種類最多、分布較均勻，且對(duì)碳源利用程度最高。T2土壤微生物功能多樣性指數(shù)顯著低于T1，且略低于CK。因此，施用重金屬達(dá)標(biāo)商品有機(jī)肥可以增加菜田土壤的微生物群落功能多樣性，而施用重金屬高殘留有機(jī)肥無類似效應(yīng)。

表2 基于MicroRespTM分析下菜地土壤微生物群落代謝多樣性指數(shù)Table 2 Diversity indices of soil microbial metabolism in vegetable soil based on MicroRespTManalysis

正如以往報(bào)道[32]，有機(jī)肥養(yǎng)分本身可以增加土壤微生物群落代謝多樣性。但與土壤基礎(chǔ)呼吸結(jié)果一致，目前商品有機(jī)肥對(duì)土壤微生物群落代謝的積極影響往往受到有機(jī)肥中殘留重金屬的制約。因此有機(jī)肥對(duì)土壤微生物群落代謝功能的影響是有機(jī)肥中有機(jī)質(zhì)等養(yǎng)分和重金屬的綜合效應(yīng)，其中T2土壤中Cu、Zn的顯著累積活化以及有效As含量上升可能掩蓋或削弱了有機(jī)肥中有機(jī)質(zhì)等對(duì)微生物群落功能多樣性的促進(jìn)作用。Sheik等[16]研究指出，As含量總體和微生物群落多樣性呈負(fù)相關(guān)。Li等[33]的研究表明，與健康土壤相比，Cu污染土壤的微生物群落代謝多樣性明顯下降，從而使得Cu污染土壤微生物在抵抗干濕交替變化的能力低于無Cu殘留的健康土壤。此外，高濃度Zn的生物毒性同樣不容忽視，在相同濃度下，Zn對(duì)紅壤微生物代謝多樣性等各項(xiàng)微生物學(xué)指標(biāo)的抑制能力甚至可以高于Pb[34]。因此，土壤中Cu、Zn、As含量顯著上升均可抑制土壤微生物代謝功能。綜上認(rèn)為，在Pb-As-Cu-Zn添加有機(jī)肥中的重金屬殘留水平下，2年4季的有機(jī)肥施用就可對(duì)菜田土壤造成一定風(fēng)險(xiǎn)，重金屬添加有機(jī)肥中Cu、Zn和As濃度過高是主要原因。

2.4 不同施肥處理土壤微生物群落代謝結(jié)構(gòu)

為了探討不同施肥處理菜田土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化，對(duì)不同碳源底物誘導(dǎo)呼吸（SIR）數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，并繪制主成分分析圖譜，獲得不同處理土壤微生物群落水平的生理指紋圖譜（CLPP），結(jié)果見圖2。CK、T1和T2各聚為一類，表明不同施肥處理土壤的CLPP存在差異，即不同處理土壤具有不同的碳源利用代謝模式。相較T2與CK土壤，T1與CK土壤之間碳源底物利用模式相似性更高。由此可知，有機(jī)肥養(yǎng)分本身可以改變土壤微生物代謝結(jié)構(gòu)，同時(shí)有機(jī)肥中重金屬殘留水平又會(huì)影響有機(jī)肥自身養(yǎng)分對(duì)土壤微生物代謝結(jié)構(gòu)的作用。楊元根等[14]就曾指出，高濃度重金屬脅迫，例如Cu脅迫，會(huì)驅(qū)動(dòng)土壤微生物對(duì)碳源的優(yōu)先利用種類發(fā)生轉(zhuǎn)移。因此，有機(jī)肥及其重金屬殘留水平同時(shí)影響土壤微生物碳源利用格局。微生物不同碳源利用方式暗示著其不同的群落結(jié)構(gòu)和代謝功能，必然影響土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化和循環(huán)過程，從而影響土壤養(yǎng)分?jǐn)?shù)量與形態(tài)。

圖2 基于MicroRESPTM底物誘導(dǎo)呼吸數(shù)據(jù)主成分分析和聚類分析下的不同施肥處理土壤微生物群落結(jié)構(gòu)差異Figure 2 Differences in soil microbial community structure among different fertilization treatments based on principle component analysis and cluster analysis of the substrate-induced respiration data from MicroRESPTManalysis

圖3進(jìn)一步比較了T1和T2處理土壤微生物群落的15種底物誘導(dǎo)呼吸強(qiáng)度（SIR碳源），發(fā)現(xiàn)T2土壤中SIR檸檬酸、SIRL-蘋果酸和SIR草酸大幅高于T2處理組，表明T2處理土壤中重金屬增加了土壤微生物對(duì)檸檬酸、蘋果酸和草酸等羧酸的代謝利用。參考關(guān)于Cu、Zn、As土壤微生物效應(yīng)的相關(guān)文獻(xiàn)，我們發(fā)現(xiàn)本結(jié)果與楊元根等[14]、郭星亮等[35]研究不同濃度Cu對(duì)微生物碳源代謝的影響結(jié)果較為吻合。楊元根等[14]指出，高濃度Cu處理土壤微生物對(duì)氨基酸、羧酸的利用基本高于低濃度Cu處理；郭星亮等[35]以Biolog方法為檢測(cè)手段研究Cu對(duì)堆肥微生物群落代謝能力的影響，也證實(shí)低劑量Cu能提高微生物群落對(duì)高聚物類碳源的轉(zhuǎn)化而利用，而高劑量Cu則產(chǎn)生一定的抑制作用。相關(guān)羧酸的代謝可能是土壤微生物應(yīng)答Cu脅迫的一種機(jī)制。當(dāng)然，土壤中Zn和有效As含量變化也會(huì)改變土壤微生物群落代謝利用行為，但其與土壤微生物羧酸代謝之間的關(guān)系還不明確，具體影響行為亟待進(jìn)一步探索。

圖3 不同處理土壤中15種碳源底物的誘導(dǎo)呼吸Figure 3 The 15 substrate-induced respirations in different soil treatments

3 結(jié)論

本試驗(yàn)條件下，2年4季的商品有機(jī)肥和Pb-As-Cu-Zn添加有機(jī)肥施用顯著提高了旱地蔬菜輪作土壤有機(jī)質(zhì)和部分養(yǎng)分含量，但僅有商品有機(jī)肥施用顯著促進(jìn)了土壤基礎(chǔ)呼吸作用和微生物代謝功能多樣性。土壤Cu、Zn和有效態(tài)As含量是不同有機(jī)肥處理微生物群落代謝產(chǎn)生差異的主要原因，其大量添加削弱了有機(jī)肥中有機(jī)質(zhì)等養(yǎng)分對(duì)土壤微生物的積極作用，并改變了有機(jī)肥本身對(duì)土壤微生物群落代謝結(jié)構(gòu)的影響，極大刺激了土壤微生物對(duì)檸檬酸、蘋果酸和草酸的代謝。綜上，2年4季的重金屬添加有機(jī)肥施用已對(duì)菜田土壤造成風(fēng)險(xiǎn)，減少和控制有機(jī)肥中的重金屬殘留才能保證有機(jī)肥的安全施用，最大程度地發(fā)揮土壤培肥及養(yǎng)分替代等積極作用，同時(shí)建議在未來的有機(jī)肥標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定Cu和Zn的限量參考值。

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Effects of heavy metal within organic fertilizers on the microbial community metabolic profile of a vegetable soil after land application

LIN Hui1,SUN Wan-chun1,WANG Fei2,WANG Bin3,WENG Ying4,MA Jun-wei1*,FU Jian-rong1
（1.Institute of Environment,Resources,Soil and Fertilizers,Zhejiang Academy of Agricultural Sciences,Hangzhou 310021,China;2.Plant Management Bureau of Ningbo,Ningbo 315012,China;3.Agriculture and Forestry Bureau of Yinzhou District,Ningbo 315100,China;4.A-gricultural Monitoring Center of Cixi City,Ningbo 315310,China）

This study investigated the effect of heavy metals in organic fertilizer on the metabolic characteristics of soil microbial community on the basis of a vegetable fertilization experiment,which was carried out in Zhangqi Town,Cixi City.Vegetable planting and fertilization were performed twice each year.Three fertilization treatments were included：CK treatment with no fertilizer;T1 treatment with a manure fertilizer having heavy metal levels within the safe limit set by China;T2 treatment with a manure fertilizer having an increased level of Pb, As,Cu and Zn.After two years,soil physic-chemical properties,soil heavy metals and metabolic characteristic of soil microbial community were measured by using both conventional soil analysis method and MicroRESPTMtechnology.Results indicated that both T1 and T2 significantly increased the soil content of organic matter,available phosphorus and available potassium.Although there is insignificant differencein soil physic-chemical properties between T1 and T2,T2 had significantly higher contents of total Cu,total Zn,available Cu,available Zn and available As in soil.Microbial community metabolic profile analysis based on the MicroRESPTMmethod showed that T1 significantly enhanced the basal respiration and the functional diversity of microbial community in soil;but T2 did not show similar enhancement.Thus,the increased level of Cu,Zn and available As in T2 soil might reduce the positive effect of nutrients within manure on soil microbial community.Principle component analysis and cluster analysis results further showed that the community level physiological profile（CLPP）in T1 soil was apparently different from that in T2 soil.The highly accumulated heavy metals and their increased availability in T2 soil enhanced the utilization of citric acid,malic acid and oxalic acid in soil.In conclusion,the effect of manure fertilizer on the metabolic function of soil microbial community was related to both manure nutrients and its residual heavy metal.The application of manure fertilizer with excessive residual heavy metal would change the effect of manure nutrients on soil microbial community.

livestock manure;organic fertilizer;vegetable soil;heavy metal;soil microbial community function

S154.3

A

1672-2043（2016）11-2123-08

10.11654/jaes.2016-0674

2016-05-15

浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（LY14C150002）；寧波市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2013C11024）；2013年鄞州區(qū)省農(nóng)科院合作項(xiàng)目;公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）專項(xiàng)（201303091）

林輝（1986—），女，博士，助理研究員，主要研究方向?yàn)檗r(nóng)業(yè)環(huán)境微生物。E-mail：lin82774872@163.com

*通信作者：馬軍偉E-mail：majw@mail.zaas.ac.cn

林輝，孫萬春，王飛，等.有機(jī)肥中重金屬對(duì)菜田土壤微生物群落代謝的影響.題目[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào),2016,35（11）：2123-2130.

LIN Hui,SUN Wan-chun,WANG Fei,et al.Effects of heavy metal within organic fertilizers on the microbial community metabolic profile of a vegetable soil after land application[J].Journal of Agro-Environment Science,2016,35（11）:2123-2130.