黃玫英，羅潔文，黃彩鳳，周垂帆*

（1.福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院，福建 福州 350002；2.海峽兩岸紅壤區(qū)水土保持協(xié)同創(chuàng)新中心，福建 福州 350002）

Pb在類蘆組織和亞細(xì)胞中的分布規(guī)律和毒害效應(yīng)

黃玫英1，2，羅潔文1，2，黃彩鳳1，2，周垂帆1，2*

（1.福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院，福建 福州 350002；2.海峽兩岸紅壤區(qū)水土保持協(xié)同創(chuàng)新中心，福建 福州 350002）

通過研究類蘆體內(nèi)Pb在組織和亞細(xì)胞水平的毒害效應(yīng)和分布規(guī)律，分析類蘆對Pb的耐性機(jī)制，為了解類蘆對重金屬的富集能力、耐性機(jī)制及逆境生理提供理論依據(jù)。采用營養(yǎng)液培養(yǎng)的方法，以Pb為目標(biāo)污染物，脅迫后測定類蘆體內(nèi)（分為根和葉）Pb在各亞細(xì)胞組分的含量，并分別通過掃描電子顯微鏡（SEM）和能譜透射電子顯微鏡（TEM-EDS）觀察Pb在組織和亞細(xì)胞的分布以及對其損傷情況。結(jié)果顯示：從組織水平來看，Pb脅迫下組織結(jié)構(gòu)由排列整齊變?yōu)椴灰?guī)則，局部出現(xiàn)較大破損而形成一些碎片，并出現(xiàn)晶體堵塞導(dǎo)管的現(xiàn)象；從亞細(xì)胞水平來看，類蘆根葉細(xì)胞均損傷，出現(xiàn)細(xì)胞壁模糊、線粒體減少、葉綠體腫脹等現(xiàn)象，在根部Pb主要分布于細(xì)胞壁（12.28 mg·kg-1）和以液泡為主的可溶組分（38.82 mg·kg-1），而葉片中以可溶組分占比例最大（32.56%），且EDS元素分析也顯示細(xì)胞內(nèi)含有大量Pb。這些結(jié)果表明，類蘆對Pb有一定的吸收富集能力，并可通過改變Pb在其組織和亞細(xì)胞水平的分布來降低毒害作用，因此類蘆對重金屬Pb有較強(qiáng)的耐性。

Pb；類蘆；組織結(jié)構(gòu)；亞細(xì)胞；SEM；TEM-EDS

Pb具有熔點(diǎn)低、易加工、耐腐蝕等特點(diǎn)，已經(jīng)被人類使用了數(shù)千年。采礦、電鍍以及一些含Pb的涂料、紙張、汽油等生產(chǎn)和使用向環(huán)境中排放了大量的Pb。由于Pb并不是動植物生長發(fā)育所必需的元素，而是一種有毒的重金屬元素，其毒害作用具有潛伏性和長期性，進(jìn)入土壤之后，可影響土壤的生化活性，致使植物葉綠素含量降低，呼吸作用受到抑制[1]，膜透性發(fā)生改變以及DNA損傷[2]，也會導(dǎo)致代謝過程中一些抗氧化酶如SOD、CAT、POD等的活性降低[3]。不少研究表明，低濃度的Pb對植物生長有促進(jìn)作用，但是一般不超過100 mg·L-1[4]，且Pb對植物的毒害作用隨著Pb濃度、植物種類和部位以及植物生長發(fā)育階段等的不同而有差異，如白雪姬（Tradescantia sillamontana）地上部和根部Pb累積最大量可超過1000 mg· kg-1，Pb脅迫下出現(xiàn)根部顏色變暗、葉片變薄下垂和幼莖生長遲緩等現(xiàn)象[5]；雷竹（Phyllostachys praecox）在Pb含量1200 mg·kg-1土培條件下，葉、莖、根最大Pb富集量分別達(dá)到63、101、595 mg·kg-1，高濃度的Pb使雷竹部分細(xì)胞壁變形、葉綠體膜消失或部分?jǐn)嗔?，片層結(jié)構(gòu)模糊不清[6]。

植物修復(fù)是近些年發(fā)展起來的一項(xiàng)用于修復(fù)土壤重金屬污染的生態(tài)技術(shù)，其機(jī)理主要是通過植物對重金屬的吸收、積累和轉(zhuǎn)化，減輕土壤重金屬污染，因具有經(jīng)濟(jì)、簡單和高效等優(yōu)點(diǎn)而備受人們的關(guān)注。類蘆（Neyraudia reynaudiana）是一種廣泛分布于長江以南的草本植物，該植物極耐干旱、瘠薄，且根系發(fā)達(dá)、莖分蘗力強(qiáng)、生物量大、容易自然更新，對各種惡劣生境條件都有較強(qiáng)的適應(yīng)性，是中國南方水土保持防風(fēng)固沙的理想草種。近年來許多研究者發(fā)現(xiàn)，類蘆在重金屬礦廢棄地上也可較好生長，并保有較高的生物量，對Pb有較強(qiáng)的耐性，并可以改善土壤理化性質(zhì)。楊期和等[7]在粵東鉛鋅尾礦區(qū)對3種優(yōu)勢植物根際土壤微生物的活性研究中發(fā)現(xiàn)，類蘆根際土壤Pb含量高達(dá)7 795.51 mg·kg-1；羅有發(fā)等[8]研究類蘆在酸性礦山廢水（AMD）污染土壤的生態(tài)修復(fù)效應(yīng)及潛力中發(fā)現(xiàn)，類蘆不僅生長良好，還提高了AMD污染土壤有效養(yǎng)分（全磷、全氮、有效磷、有效氮、有機(jī)質(zhì)、速效鉀）的含量。正是由于具備這些優(yōu)勢，使得類蘆適合作為中國南方土壤重金屬污染的修復(fù)植物。但近年來，國內(nèi)外學(xué)者對類蘆開展的研究多集中在水土流失治理、根系固土作用以及在受污染區(qū)域中生長的優(yōu)勢度等方面，而關(guān)于重金屬在類蘆組織和亞細(xì)胞水平上的毒害效應(yīng)和分布規(guī)律并不清楚。

鑒于上述，本研究選取南方水土保持先鋒植物類蘆為試驗(yàn)材料，通過營養(yǎng)液培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，采用掃描電子顯微鏡（SEM）法和能譜透射電子顯微鏡（TEM-EDS）法以及差速離心法，研究Pb在類蘆組織和亞細(xì)胞中的分布規(guī)律以及毒害效應(yīng)，旨在探明類蘆對重金屬Pb的富集能力和解毒機(jī)制，為Pb污染土壤的植物修復(fù)治理提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及預(yù)培養(yǎng)

類蘆種子于2015年4月購自云南昆明某種子公司，5月底種植于福建農(nóng)林大學(xué)溫室。同年8月底選擇生長均一的類蘆幼株，去除幼株腐爛的根和葉，將根系依次用自來水和去離子水洗凈，移植在泡沫板上并置于500 mL超純水中培養(yǎng)3～4 d，依次用1/4、1/2和完全Hoagland培養(yǎng)液在塑料盆中培養(yǎng)。預(yù)培養(yǎng)試驗(yàn)全程于人工氣候箱中完成，培養(yǎng)期間晝/夜溫度為25℃/22℃，光照時間16h，培養(yǎng)時間為3～5d。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 Pb脅迫類蘆試驗(yàn)

取預(yù)培養(yǎng)后長到一定程度且大小一致的類蘆，依次用自來水和去離子水沖洗干凈，放入含有不同濃度Pb（以Pb（NO3）2的形式加入）的脅迫溶液中，設(shè)置濃度為0、200 μmol·L-1（以純鉛計(jì)）。每個處理重復(fù)15棵類蘆，定植于有泡沫固定板的塑料盆中，將類蘆置于人工氣候箱培養(yǎng)，培養(yǎng)期間晝/夜溫度為25℃/22℃，光照時間16 h，每3～4 d換一次脅迫液，并清洗塑料瓶，避免根系因缺氧腐爛。

1.2.2 SEM分析樣品的制備和觀察

類蘆SEM分析樣品的制備和觀察參照朱宇恩等[9]的方法，并加以改進(jìn)：取Pb脅迫21 d的類蘆，依次用蒸溜水和去離子水將根系和葉片表面沖洗干凈，分別切取新生根的根尖1 cm，完整的葉片中部（避開葉脈）5 mm2，然后用磷酸緩沖液反復(fù)清洗干凈，迅速置于2.5%戊二酸固定液中固定2～24 h，抽氣使材料下沉，在此期間加入適量Na2S（1%）溶液，使植物組織中的重金屬凝結(jié)，再用0.1 mol·L-1的磷酸緩沖液沖洗3次，經(jīng)50%、70%、80%、90%、95%、100%酒精逐級脫水，時間為每次15 min。再經(jīng)冷凍干燥后切片鍍金，采用S4800型掃描電鏡，在5.0 kV的加速電壓條件下完成觀察、拍照。

1.2.3 TEM-EDS樣品的制備和觀察

TEM-EDS樣品的制備和觀察參照劉延盛等[10]和Basile等[11]的方法，具體步驟為：在Pb脅迫21 d后，依次用蒸溜水和去離子水將根系和葉片表面沖洗干凈，從類蘆頂端往下數(shù)第三片真葉，用鋒利刀片取完整葉片中段2～3 cm，將切好的材料迅速投入2.5%的戊二醛固定液（用pH7.4的磷酸緩沖溶液配制），在4℃黑暗條件下固定6 h。隨后，用0.1 mol·L-1磷酸緩沖溶液（pH7.4）洗滌4次，每次20 min。將洗滌過的材料轉(zhuǎn)移至2%的鋨酸（磷酸緩沖溶液配制）浸泡過夜10～12 h。在50%、70%、85%、90%、95%酒精中逐級脫水，每次各15 min，最后在100%酒精中脫水3次，每次各15 min。酒精與包埋劑3∶1比例滲透處理，每次2～3 h，之后純包埋劑過夜（包埋膠囊包埋）。放入70℃烘箱處理12 h后，使用超薄切片機(jī)切片，分別經(jīng)醋酸雙氧鈾染色20 min、檸檬酸鉛染色15 min。

組織結(jié)構(gòu)的改變及重金屬分布特征觀察采用配備X-射線能譜儀的透射電鏡，在20 keV加速和25°離源角條件下完成。測量計(jì)數(shù)時間為60 s，測出的數(shù)值分別表示每種元素的峰值減去其背景值后的每秒脈沖數(shù)（CPS），重復(fù)檢測每一細(xì)胞的微區(qū)至少8個測試點(diǎn)。

1.2.4 樣品亞細(xì)胞組分Pb2+含量的測定

定期對類蘆取樣，分別在第3、7、14、21 d各取3株類蘆，將根用去離子水沖洗干凈并擦干，分為根部和地上部，放置于-80℃冰箱保存。

采用差速離心法分離不同的亞細(xì)胞組分，參考周小勇等[12]的方法，具體步驟為：準(zhǔn)確稱取鮮樣0.2 g，加入20 mL提取液[0.25 mol·L-1蔗糖+50 mmol·L-1Tris-HCl緩沖液（pH 7.5）+1 mmol·L-1二硫赤蘚糖醇]，液氮研磨勻漿。勻漿液在冷凍離心機(jī)300 r·min-1下離心1 min，沉淀為細(xì)胞壁組分（F1）；將上清液在2000 r·min-1下離心15 min，沉淀為細(xì)胞核和葉綠體組分（F2）；上清液在10 000 r·min-1下離心20 min，沉淀為線粒體組分（F3）；上清液為含核糖體的可溶組分（F4）。全部操作在4℃下進(jìn)行。

各亞細(xì)胞組分Pb2+含量參考包曙光等[13]的硝酸-高氯酸濕法測定，并加以改進(jìn)：將已分離的細(xì)胞組分置于50 mL三角瓶中，加混酸（HNO3∶HClO4=5∶1）10 mL，在電爐上加熱，溫度為150～200℃，加熱約30 min溶液沸騰，持續(xù)加熱溶液直至樣品近干未干且溶液澄清時為消解完全，取下冷卻至室溫后用1%的稀硝酸定容至10 mL容量瓶中，用原子吸收法測定Pb2+含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)為3次重復(fù)樣品測定結(jié)果的平均值（含標(biāo)準(zhǔn)差）。運(yùn)用Excel 2007和SPSS 18進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析（One-way ANOVA）和多重比較，用SNK法對處理間數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析，以P＜0.05表示處理間數(shù)據(jù)差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 Pb脅迫下類蘆組織結(jié)構(gòu)的SEM分析

通過SEM對類蘆根系橫切面進(jìn)行觀察，對照處理（圖1A）的類蘆根組織形狀規(guī)則、排列整齊，根系表皮、內(nèi)皮層和中柱清晰易分辨，切面的組織結(jié)構(gòu)表面平整且無多余的雜質(zhì)；Pb脅迫處理的類蘆（圖1B）根部組織結(jié)構(gòu)形狀不規(guī)則、排列無序，且薄壁細(xì)胞徑向明顯增大，相鄰細(xì)胞間、上下細(xì)胞間連接壁破裂，在皮層細(xì)胞出現(xiàn)較多的顆粒狀晶體，且有導(dǎo)管堵塞的現(xiàn)象。

類蘆葉片組織結(jié)構(gòu)相對于根系的變化要明顯，對照處理（圖2A）的類蘆葉片表面光滑、連續(xù)；木質(zhì)部內(nèi)部的環(huán)紋清晰，排列有序且無破損；韌皮部細(xì)胞結(jié)構(gòu)飽滿，輪廓分明，薄壁細(xì)胞連續(xù)形成光滑。在Pb脅迫下（圖2B），類蘆的葉片表皮發(fā)生明顯的變化，表皮細(xì)胞皺縮，局部有部分半球狀或球狀的突起，局部出現(xiàn)較大破損而形成一些碎片；木質(zhì)部內(nèi)的環(huán)紋變得模糊，部分環(huán)紋出現(xiàn)斷裂或略微的膨脹；皮層出現(xiàn)了大量的顆粒狀晶體，部分導(dǎo)管已出現(xiàn)堵塞。

2.2 類蘆吸收Pb2+在亞細(xì)胞中累積部位的TEM-EDS分析

圖1 不同處理下的類蘆根系組織掃描電鏡圖Figure 1 The root tissues of Neyraudia reynaudiana in the different control treatment

通過TEM觀察發(fā)現(xiàn)，正常類蘆根系細(xì)胞的細(xì)胞器沒有明顯的損傷（圖3），細(xì)胞質(zhì)膜以及細(xì)胞壁表面清晰、光滑且連續(xù)。Pb脅迫下類蘆根細(xì)胞（圖4）的細(xì)胞膜、細(xì)胞壁附近可見到許多沉積的深色顆粒物，特別是在細(xì)胞間隙，表現(xiàn)出Pb2+逐漸滲入細(xì)胞結(jié)構(gòu)而沉積的過程，進(jìn)一步對樣品放大觀察發(fā)現(xiàn)，在Pb2+的作用下，根細(xì)胞發(fā)生了略微的質(zhì)壁分離（圖4d），局部的細(xì)胞質(zhì)膜變得粗糙；線粒體的數(shù)量相對于對照組出現(xiàn)了明顯的減少，一些受損的線粒體只殘存一個或者極少數(shù)的脊突或幾乎成為空泡；隨著Pb2+的逐漸滲入，細(xì)胞質(zhì)中大小液泡內(nèi)也沉積了許多深色顆粒物（圖4c）。通過EDS分析發(fā)現(xiàn)（圖5），根細(xì)胞中Pb峰值與C、O、Si的相當(dāng)，顯著高于其他營養(yǎng)元素（Mg、Ca、K等），且吸附Pb的點(diǎn)位豐富，證實(shí)了大量沉淀于細(xì)胞壁、細(xì)胞間隙和液泡中的深色顆粒物主要成分為Pb。

圖2 不同處理下的類蘆葉片組織掃描電鏡圖Figure 2 The leave tissues of Neyraudia reynaudiana in the different control treatment

圖3 Pb濃度為0 μmol·L-1處理下的類蘆根細(xì)胞透射電鏡圖Figure 3 Ultrastructure of root cells of Neyraudia reynaudiana inthe control treatment（exposed to 0 μmol·L-1Pb for 21 days）

圖4 Pb濃度為200 μmol·L-1處理下類蘆根細(xì)胞透射電鏡圖Figure 4 Ultrastructure of root cells of Neyraudia reynaudiana in the control treatment（exposed to 200 μmol·L-1Pb for 21 days）

圖5 Pb濃度為200 μmol·L-1處理下的類蘆根細(xì)胞能譜分析圖Figure 5 The EDS analyses of root cells of Neyraudia reynaudiana in the control treatment（exposed to 200 μmol·L-1Pb for 21 days）

TEM觀察類蘆葉細(xì)胞顯示，正常類蘆（圖6）葉細(xì)胞完整，葉綠體片層結(jié)構(gòu)清晰并呈現(xiàn)橢圓形，類囊體基粒和片層整齊；線粒體明顯，呈現(xiàn)橢圓形；細(xì)胞核雙層膜結(jié)構(gòu)清楚，核仁致密完整，與核質(zhì)界限分明。圖7顯示，Pb脅迫對類蘆葉片的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了一定損傷：部分細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞壁被破壞（圖7a），細(xì)胞內(nèi)的膜系統(tǒng)空泡化嚴(yán)重（圖7c），膜層出現(xiàn)游離現(xiàn)象，膜結(jié)構(gòu)還逐漸模糊；在細(xì)胞間隙、細(xì)胞膜與細(xì)胞壁之間存在許多沉積的深色顆粒，可能是由于大量Pb2+在此沉積的結(jié)果；葉綠體的基粒片層結(jié)構(gòu)紊亂以及消失，類囊體腫脹，一部分葉綠體外膜解體，葉綠體呈現(xiàn)略微的腫脹。通過EDS（圖8）進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，類蘆葉片組織的Pb峰值與C、O峰值相當(dāng)，且在2.55、10.51 keV吸附位點(diǎn)豐富，其他營養(yǎng)元素（Mg、Ca、Fe、K等）的峰值也較根細(xì)胞有所下降。這同樣證實(shí)了大量地沉淀于類蘆細(xì)胞壁以及葉綠體等細(xì)胞器的深色顆粒物的主要成分是Pb。

圖6 Pb濃度為0 μmol·L-1處理下的葉細(xì)胞透射電鏡圖Figure 6 Ultrastructure of leave cells of Neyraudia reynaudiana in the control treatment（exposed to 0 μmol·L-1Pb for 21 days）

圖7 Pb濃度為200 μmol·L-1處理下的葉細(xì)胞透射電鏡圖Figure 7 Ultrastructure of leave cells of Neyraudia reynaudiana in the control treatment（exposed to 200 μmol·L-1Pb for 21 days）

圖8 Pb濃度為200 μmol·L-1處理下的類蘆葉細(xì)胞能譜分析圖Figure 8 The EDS analyses of leave cells of Neyraudia reynaudiana in the control treatment（exposed to 200 μmol·L-1Pb for 21 days）

2.3 Pb2+在類蘆體內(nèi)的亞細(xì)胞分布

通過差速離心分離法，將類蘆葉片和根細(xì)胞分別分離出四部分，Pb2+在類蘆亞細(xì)胞的分布如表1。從總含量上看，根系中的Pb2+含量遠(yuǎn)高于葉片，且隨著脅迫時間的延長類蘆體內(nèi)Pb總量逐漸增加，但在不同部分的含量有一定差異。類蘆根細(xì)胞在Pb濃度為200 μmol·L-1的脅迫初期，Pb2+主要分布在細(xì)胞壁組分（F1）及細(xì)胞核和葉綠體組分（F2），所占百分率分別為59.18%、22.30%，其次為線粒體組分（F3）以及可溶組分（F4）；至脅迫結(jié)束，對照各組分未測出Pb2+，在Pb濃度為200 μmol·L-1的脅處理下，Pb2+從F1遷移到細(xì)胞原生質(zhì)體，各組分Pb2+含量呈現(xiàn)F4＞F1＞F2＞F3的規(guī)律，在F4中Pb2+含量最高（38.82 mg·kg-1），占總量的57.77%，此時含核糖體的F4是Pb2+在類蘆根細(xì)胞的主要分布位點(diǎn)。而在類蘆葉片中，脅迫初期，Pb2+也主要分布在F1，隨著脅迫時間的延長，Pb2+在類蘆體內(nèi)逐漸從F1遷移到F2，至脅迫結(jié)束，各組分的含量呈現(xiàn)F4＞F3＞F1＞F2的規(guī)律，Pb2+在F4含量較高，占32.56%，此時F4是Pb2+在類蘆葉細(xì)胞的主要分布位點(diǎn)。

表1 不同時間和濃度處理下Pb2+在類蘆各亞細(xì)胞的含量（mg·kg-1）Table 1 The concentration of Pb2+in leave and root cells of Neyraudia reynaudiana（mg·kg-1）

3 討論

3.1 Pb2+對組織和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的毒害效應(yīng)

Pb是一種對植物有極大毒害的元素，但是植物對Pb的敏感性及不同植物的毒害響應(yīng)過程依賴于植物的基因型和生理特性。在SEM觀察下發(fā)現(xiàn)，Pb對類蘆不同的組織結(jié)構(gòu)和組織區(qū)域均有不同的影響。在組織水平上，Pb脅迫后的類蘆根和葉的組織結(jié)構(gòu)均發(fā)生了形狀不規(guī)則和形成晶體的現(xiàn)象，特別是皮層細(xì)胞，但中柱卻無明顯變化。這可能是因?yàn)橹参餅榱藴p少重金屬的毒害，將重金屬離子限制在功能相對不重要的組織結(jié)構(gòu)中。彭鳴等[14]通過X射線顯微分析發(fā)現(xiàn)，玉米幼苗的木質(zhì)部薄壁細(xì)胞對Pb2+的主動吸收積累以及皮層和表皮層細(xì)胞的沉積，減少了其進(jìn)入中柱的量，保證了玉米正常的養(yǎng)分傳輸。Pb2+進(jìn)入類蘆體內(nèi)后合成含Pb的晶體并在皮層及薄壁組織沉淀，有效地阻止了Pb2+向中柱內(nèi)遷移，而中柱是植物運(yùn)輸養(yǎng)分和水分的重要組織[15]，這在不同程度上降低了Pb2+對類蘆的毒害作用。陳世寶等[16]在研究磷對降低土壤中鉛生物有效性的X衍射及電鏡分析發(fā)現(xiàn)，Pb以不同的磷酸鹽化合物的形式沉淀，有效地阻止了Pb2+向中國芥菜中柱內(nèi)的遷移，降低了污染土壤中Pb的蓄積毒性。因此，類蘆為了保證生長代謝所需營養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸，將大量的Pb2+以晶體形式沉淀，并將其限制在內(nèi)柱外的組織結(jié)構(gòu)中，但同時也導(dǎo)致了部分過多累積晶體的組織結(jié)構(gòu)嚴(yán)重?fù)p傷。

TEM-EDS觀察和分析證實(shí)細(xì)胞壁有大量Pb2+沉積，并且質(zhì)膜已變得粗糙或模糊。這可能是由于Pb2+與膜蛋白相結(jié)合并使其部分變性，從而使以蛋白為主要成分的膜結(jié)構(gòu)改變，導(dǎo)致部分功能喪失[17]，這也是細(xì)胞壁對重金屬離子固持作用有一定限度的原因。進(jìn)入原生質(zhì)體的重金屬離子會對植物線粒體、葉綠體和細(xì)胞核等產(chǎn)生不同的毒害效應(yīng)，如李佩華等[18]在鉛、鎘脅迫對馬鈴薯細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響研究中發(fā)現(xiàn)，線粒體輕微膨脹呈橢圓形，嵴部分消失，結(jié)構(gòu)解體；徐勤松等[19]通過電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，Pb脅迫下鳳眼蓮（Eichhor-nia Crassipes Solms）體細(xì)胞中的細(xì)胞核染色質(zhì)凝集，質(zhì)體解體。但對植物來說，受危害后影響最大的是葉細(xì)胞中的葉綠體，其對重金屬脅迫非常敏感，葉綠體的超微結(jié)構(gòu)包括類囊體的完整性和有序性對光合作用的正常進(jìn)行十分重要，而光合作用是植物生長發(fā)育重要的能量來源。本實(shí)驗(yàn)在SEM下觀察到葉綠體的類囊體腫脹、外膜解體，這些表征都說明了Pb2+已經(jīng)損傷了類蘆的葉綠體。重金屬離子對葉綠素的破壞將直接影響光合電子傳遞鏈的正常功能[20]，也說明此時植物葉綠體在逐漸喪失光合功能，將逐步影響植物的整個生長發(fā)育過程。

3.2 Pb2+在類蘆亞細(xì)胞水平的分布規(guī)律及其耐受機(jī)制

植物對Pb的耐受和解毒機(jī)制有多種，亞細(xì)胞的分布與累積方式?jīng)Q定了植物對Pb的耐性及解毒能力的大小，其中細(xì)胞壁被認(rèn)為是植物保護(hù)原生質(zhì)體免受金屬離子毒害的第一道屏障。本研究通過原子吸收法和TEM觀察法得到一致的結(jié)果，大量的Pb沉淀在類蘆的細(xì)胞壁上，還有一大部分Pb被限制在液泡中。Pb主要分布在類蘆細(xì)胞壁的原因可能在于：①由于Pb2+帶正電，很容易在帶負(fù)電的細(xì)胞壁處被大量吸附而沉積；②植物細(xì)胞壁含有蛋白質(zhì)和多糖（纖維素、半纖維素、木質(zhì)素等）以及大量配位基團(tuán)（羥基、羧基、醛基、氨基酸等），容易吸附Pb2+。這一結(jié)果同王裕玲[21]的鉛脅迫對雙穗雀稗生理特性及鉛積累的研究一致，Pb2+主要被儲存于細(xì)胞壁。重金屬離子被根毛吸收進(jìn)入植物體內(nèi)，轉(zhuǎn)移到莖部或葉片中，將直接影響植物光合作用和其他重要的生理代謝過程，所以植物根部細(xì)胞壁的阻礙作用對避免重金屬的毒害有重要意義。Lyubenova等[22]經(jīng)研究證實(shí)，植物根細(xì)胞壁內(nèi)帶負(fù)電的果膠可以吸附固定大量的Pb；Krzeslowska[23]發(fā)現(xiàn)在Pb、Cd、Cu等重金屬脅迫下，植物細(xì)胞壁果膠甲酯酶活性提高，低甲酯化果膠含量顯著增加，果膠在空間上重新排布，從而提高了細(xì)胞壁吸收和累積重金屬的容量。綜合上述，類蘆根細(xì)胞壁在減小Pb毒害效應(yīng)中起到關(guān)鍵的作用，可能是其耐Pb機(jī)制之一。

然而，細(xì)胞壁的這種截留作用具有一定的局限性，這一方面可能是由于根細(xì)胞壁結(jié)合的重金屬量達(dá)到飽和，另一方面由于毒性作用的加劇，使類蘆細(xì)胞的正常代謝造成了傷害，如導(dǎo)致根細(xì)胞壁、原生質(zhì)膜的透性增加、誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，從而對根細(xì)胞壁的截留功能產(chǎn)生嚴(yán)重的破壞，使得大量Pb2+會透過質(zhì)膜進(jìn)入原生質(zhì)體。液泡因富含有機(jī)酸、蛋白質(zhì)和生物堿等物質(zhì)，可將Pb2+螯合成有機(jī)配體，轉(zhuǎn)化為毒性較小的結(jié)合形態(tài)，緩解Pb對植物的毒害效應(yīng)，所以成為植物保護(hù)原生質(zhì)體免受金屬離子毒害的第二道屏障。本研究也發(fā)現(xiàn)其他兩個組分（F2、F3）的含量并不高，可能是透過細(xì)胞壁的Pb被局限在液泡這個活性較低的區(qū)域內(nèi)，阻止了過多的Pb進(jìn)入植物原生質(zhì)體。羅有發(fā)等[8]通過X射線分析發(fā)現(xiàn)，脅迫后的豌豆幼苗液泡比細(xì)胞質(zhì)多積累60%的Pb，在根中更是高達(dá)80%。液泡膜上的H+-ATP酶和Ca2+-ATP酶可以有效地轉(zhuǎn)運(yùn)金屬離子[24]，被認(rèn)為是分隔重金屬的重要機(jī)構(gòu)。已有許多學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，Pb在液泡內(nèi)的螯合作用可有效減小其毒性，如在Pb脅迫下的煙草[25]，PCs與Pb所形成的絡(luò)合物主要累積在葉肉細(xì)胞的液泡中，Yang等[26]發(fā)現(xiàn)在耐Pb品種水稻根系組織細(xì)胞質(zhì)中的草酸擔(dān)負(fù)著與Pb絡(luò)合、減輕Pb毒害的作用。綜合上述，說明類蘆液泡內(nèi)部的解毒機(jī)制及其區(qū)室化作用在類蘆對Pb的富集、耐性和解毒方面起著重要的作用，但其內(nèi)部有效的解毒機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。

類蘆通過細(xì)胞壁固持和液泡區(qū)室化這兩個重要的屏障，減少了大量的Pb進(jìn)入原生質(zhì)體，許多學(xué)者在研究其他超富集植物（如Sedum alfredii、Potentilla griffithii var.velutina等）時也同樣發(fā)現(xiàn)重金屬離子主要富集在植物細(xì)胞壁和液泡中，其次分布在原生質(zhì)體內(nèi)[10，27]，但是不同植物種類和重金屬濃度脅迫下的耐受力和相應(yīng)內(nèi)部機(jī)制存在一定的差異。因類蘆對Pb的富集能力、耐受性及擁有較大的生物量等特點(diǎn)，特別是在中國南方的礦區(qū)，類蘆能對當(dāng)?shù)貝毫迎h(huán)境有極強(qiáng)的適應(yīng)能力[7-8，28]，使其成為中國南方礦區(qū)退化生態(tài)系統(tǒng)的植被恢復(fù)、重金屬污染土壤治理的一種潛能植物。

4 結(jié)論

類蘆將進(jìn)入其體內(nèi)的Pb2+合成晶體，并限制在中柱以外的組織中，有效地降低了Pb對組織結(jié)構(gòu)的毒害作用，保證了正常的營養(yǎng)物質(zhì)和水分運(yùn)輸。類蘆的不同器官對Pb2+吸收能力存在一定差異，表現(xiàn)在地下部吸收Pb2+的能力大于地上部。根細(xì)胞內(nèi)Pb2+主要分布在細(xì)胞壁和以液泡為主的可溶組分，而葉細(xì)胞內(nèi)Pb2+在可溶組分占有量較大。

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The distribution and toxic effects of Pb at the levels of the tissue and sub-cellular in Neyraudia reynaudiana

HUANG Mei-ying1，2,LUO Jie-wen1，2,HUANG Cai-feng1，2,ZHOU Chui-fan1，2*
（1.College of Forestry,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350002,China;2.Co-innovation Center for Soil and Water Conservation in Red Soil Region of the Cross-straits,Fuzhou 350002,China）

In order to examine the phytoremediation potential of Neyraudia reynaudiana，the study explored the toxic effects and distribution of lead（Pb）at the levels of the tissue and sub-cellular in this species and analyzed the supplementing the growth medium with Pb as a target pollutant.After cultivation was concluded，the uptake of sub-cellular Pb was determined，and the distribution of Pb as well as the Pbinduced damage was respectively assessed through scanning electron microscope（SEM）and transmission electron microscope with energy dispersive X-ray spectroscopy（TEM-EDS）.Pb caused the tissues to become irregular and fragmented by injuries；additionally，a portion of the catheters were filled with crystals.At the sub-cellular level，many phenomena demonstrated that leaf and root cells were harmed；for example，cell walls became vague，mitochondria were less numerous，and chloroplasts were swollen.Pb was mainly distributed in the cell wall（12.28 mg·kg-1）and the vacuole（38.82 mg·kg-1）of root cells，and it accounted for 32.56%of the total biomass in the leaves.In addition，the EDS analysis found a significant amount of Pb in cells.These results suggest that N.reynaudiana has a strong ability to both absorb and tolerate Pb.Moreover，the species may alter the distribution of Pb at both the tissue and the sub-cellular levels to reduce toxicity.Therefore，N.reynaudiana is well suited for phytoremediation in Southern China and elsewhere.

Pb；Neyraudia reynaudiana；tissue；sub-cellular；scanning electron microscope（SEM）；transmission electron microscope with energy dispersive x-ray spectroscopy（TEM-EDS）

X171.5

A

1672-2043（2016）11-2077-09

10.11654/jaes.2016-0627

2016-05-06

國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2014BAD15B02）；農(nóng)業(yè)高校產(chǎn)學(xué)合作科技重大項(xiàng)目（2013N5002）；福建省高校杰出青年科研人才培育計(jì)劃項(xiàng)目（2015）；福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2013J01073）

黃玫英（1994—），女，本科生，福建上杭人，主要從事生態(tài)修復(fù)研究。E-mail：hmy597@163.com

*通信作者：周垂帆E-mail：zhouchuifan@163.com

黃玫英，羅潔文，黃彩鳳，等.Pb在類蘆組織和亞細(xì)胞中的分布規(guī)律和毒害效應(yīng)[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào),2016,35（11）：2077-2085.

HUANG Mei-ying,LUO Jie-wen,HUANG Cai-feng,et al.The distribution and toxic effects of Pb at the levels of the tissue and sub-cellular in Neyraudia reynaudiana[J].Journal of Agro-Environment Science,2016,35（11）：2077-2085.