龔文靜，婁興焜*，虞龍

（1.揚子江藥業(yè)集團有限公司質(zhì)量管理部，江蘇泰州225321；2.南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，江蘇南京211816）

低能N+離子注入阿維菌素B1a生產(chǎn)菌的誘變選育

龔文靜1，婁興焜1*，虞龍2

（1.揚子江藥業(yè)集團有限公司質(zhì)量管理部，江蘇泰州225321；2.南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，江蘇南京211816）

以阿維菌素生產(chǎn)菌阿維鏈霉菌為研究對象，通過低能N+離子注入法對阿維鏈霉菌進行誘變選育。根據(jù)其存活率和突變率，確定最佳的誘變條件為：誘變能量為16 keV，誘變劑量為160×1014ions/cm2。經(jīng)過誘變后篩選獲得高產(chǎn)突變菌株AVE-10-N102-26。該菌株發(fā)酵產(chǎn)阿維菌素B1a含量為3 012 μg/mL，較出發(fā)菌株AVE-10提高了25.7%；經(jīng)多次傳代試驗結(jié)果證明其遺傳穩(wěn)定性較好。

阿維菌素B1a；誘變選育；離子注入

阿維菌素（avermectins，AVM）是由放線菌屬鏈霉菌中阿維鏈霉菌（Streptomyces avermitilis）發(fā)酵產(chǎn)生的一類十六元環(huán)內(nèi)酯類多組分抗生素，天然阿維菌素按其C5、C22-23、C26三個位置上的結(jié)構(gòu)差異可分為A1a、A1b、A2a、A2b、B1a、B1b、B2a、B2b共8種組分，其中B1a組分活性最高且毒性最小[1]。阿維菌素的殺蟲機制獨特，目前廣泛應(yīng)用于家畜的寄生蟲感染、治療以及農(nóng)業(yè)蟲害的防治，如家畜殺螨劑，菜青蟲、小菜蛾、斜紋夜蛾防治等。阿維菌素具有高效、廣譜、低殘留以及對人畜和環(huán)境安全等特點，是一種重要的綠色生態(tài)型農(nóng)畜用抗生素。目前已商品化的有伊維菌素（ivermectin，IVM）、阿維菌素（avermectin，AVM）、多拉菌素（doramectin，DOR）等。阿維菌素B1a的分子結(jié)構(gòu)式如圖1所示。

圖1　阿維菌素B1a分子結(jié)構(gòu)式Fig.1 Molecular structure of avermectins B1a

阿維菌素作為抗生素是一類次級代謝產(chǎn)物，涉及初級代謝和次級代謝的多種酶系，其調(diào)控機制復(fù)雜，隨機誘變、定向篩選的方法依舊是目前生產(chǎn)商及科研機構(gòu)應(yīng)用最經(jīng)典、最廣泛的微生物育種手段，尤其是對于遺傳背景未知的菌株，誘變選育是目前最好的選擇。但傳統(tǒng)應(yīng)用的紫外、化學(xué)誘變由于長期使用，使得菌種對其產(chǎn)生“鈍化效應(yīng)”[4]。研究表明，離子注入誘變法是集物理誘變和化學(xué)誘變特性于一體的一種綜合誘變方法，與傳統(tǒng)誘變方式相比，除了有能量沉積外，還具有動量傳遞、質(zhì)量沉積及電荷交換等效應(yīng)[2-3]，其不僅可以影響細(xì)胞的生理生化功能，還能引起細(xì)胞內(nèi)脫氧核糖核酸（deoxyribose nucleic acid，DNA）分子的斷裂、堿基的缺失等物理損傷，從而導(dǎo)致細(xì)胞遺傳物質(zhì)——染色體結(jié)構(gòu)的變異，在低劑量注入下具有損傷輕、突變率高和突變譜廣等特點[4-5]。作為一種具有獨特誘變機理和生物效應(yīng)的新型生物誘變源，近年來離子束在誘變育種方面的應(yīng)用發(fā)展極為迅速。目前國內(nèi)外已有大量研究者通過離子注入誘變成功獲得目標(biāo)性能大幅度提高且遺傳性能穩(wěn)定的菌株[6-12]。近年來，眾多研究人員對阿維菌素采用了各種不同方法以改良其遺傳特性，為提高有效組分B1a做了大量研究，但離子注入能否誘導(dǎo)阿維鏈霉菌發(fā)酵生成高產(chǎn)阿維菌素卻鮮有研究報道。本研究利用低能N+離子作為物理誘變劑，對阿維鏈霉菌（Streptomyces avermitilis）進行誘變選育，并對不同誘變產(chǎn)物的有效成分進行檢測，以期獲得高產(chǎn)阿維菌素B1a的穩(wěn)定菌株。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌種

阿維鏈霉菌（Streptomyces avermitilis）AVE-10：本實驗室保存。

1.1.2培養(yǎng)基

平板/斜面培養(yǎng)基：可溶性淀粉10.0 g/L，（NH4）2SO42.5 g/L，NaC1 0.5 g/L，MgSO4·7H2O 1.2 g/L，K2HPO4·3H2O 3.0 g/L，CaCO33.0 g/L，瓊脂粉15.0 g/L，pH 7.2～7.4，蒸餾水配制。

種子培養(yǎng)基：玉米淀粉25.0g/L，花生餅粉10.0g/L，黃豆餅粉8.0 g/L，酵母粉5.0 g/L，酵母膏5.0 g/L，玉米漿4.0 g/L，CoCl2·6H2O 0.003g/L，淀粉酶（酶活力為2 000 U/mg）4 μg/g淀粉，pH7.0～7.2，蒸餾水配制。

發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米淀粉140.0 g/L，花生餅粉10.0 g/L，黃豆餅粉8.0 g/L，酵母粉5.0 g/L，酵母膏3.0 g/L，玉米漿2.2g/L，CoCl2·6H2O0.003g/L，淀粉酶（酶活力為2000U/mg）4 μg/g淀粉，pH7.2～7.4，蒸餾水配制。

1.1.3試劑

可溶性淀粉、氯化鈉、氯化鈷、磷酸氫二鉀、瓊脂粉、丙酮、乙酸乙酯（均為分析純）：國藥集團（上海）化學(xué)試劑公司；葡萄糖：中國惠興生化試劑有限公司；蔗糖、麥芽糖：中國醫(yī)藥集團（上海）化學(xué)試劑公司；硫酸鎂、碳酸鈣：汕頭市西隴化工廠；硫酸銨：上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；酵母粉：北京康明威培養(yǎng)基技術(shù)有限公司：甲醇（色譜純）：山東禹王實業(yè)有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

P230II型高效液相色譜儀（high performance liquid chromatography，HPLC）：大連依利特分析儀器有限公司；Agilent不銹鋼色譜柱（內(nèi)裝填料PLRS-S，100?，250mm× 4.6 mm，8 μm）：美國安捷倫公司；XS-212型生物顯微鏡：南京江南光電集團公司；SPY50型雙層培養(yǎng)搖床：上海市離心機械研究所；101A型電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海實驗儀器總廠；FA/JA型電子天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司；SW-CJ-1B型超凈臺：蘇州凈化設(shè)備廠；YXQ-SG41-280型滅菌鍋：上海醫(yī)用核子儀器廠；Q/BKYY10-200型恒溫培養(yǎng)箱：上海躍進醫(yī)療器械廠；752S型紫外分光光度計：上海凌光技術(shù)有限公司；離子束生物工程裝置：中國科學(xué)院等離子體物理研究所。

1.3方法

1.3.1菌株活化

將保存的菌種阿維鏈霉菌AVE-10接種于平板/斜面培養(yǎng)基上，28℃活化培養(yǎng)6～7 d。

1.3.2單孢子懸浮液制備

向成熟的新鮮斜面加無菌水10 mL，刮洗下培養(yǎng)好的新鮮斜面孢子后，傾于帶有一定玻璃珠的250 mL三角瓶內(nèi)，250 r/min振蕩搖勻20 min，經(jīng)三層無菌脫脂紗布過濾，濾液加已滅菌的蒸餾水稀釋后用血球計數(shù)板計數(shù)，至血球板上無孢子重疊，即為單孢子懸液，備用。

1.3.3低能N+離子注入誘變

取0.1 mL的單孢子懸液均勻涂布于無菌平皿上，以無菌風(fēng)吹干。鏡檢無細(xì)胞重疊者進行低能N+離子注入。分別在10 deV、14 deV、16 deV、18 deV的注入能量下對阿維鏈霉菌進行N+離子注入。選擇的注入劑量分別為40× 1014ions/cm2、80×1014ions/cm2、120×1014ions/cm2、160× 1014ions/cm2、200×1014ions/cm2、240×1014ions/cm2。靶室真空度為10-3Pa，以20 s脈沖式注入，間隔15 s，靶室內(nèi)放置不接受N+離子注入的陰性對照樣。

1.3.4菌株存活率的計算

離子注入完畢后，取出平皿，在無菌環(huán)境下用1 mL無菌水洗脫，涂布到平板/斜面培養(yǎng)基上，于28℃條件下倒置培養(yǎng)6～7 d，考察菌株的存活率并測定發(fā)酵液中B1a含量，以確定正突變率。菌株的存活率為誘變后平板培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)與同條件下未經(jīng)誘變的陰性對照菌株在平板培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)的比值。

1.3.5低能N+離子注入對菌種突變率的影響

以出發(fā)菌株為對照，對誘變后的菌株進行發(fā)酵培養(yǎng)。先經(jīng)平板/斜面培養(yǎng)后，進行種子培養(yǎng)，即挑取平板/斜面豐滿灰色孢子，轉(zhuǎn)接到種子培養(yǎng)基中，置于28℃，在200 r/min搖床轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)40 h。再以5%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于28℃，在200 r/min搖床轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)9 d。測定發(fā)酵液中阿維菌素B1a含量。

將阿維菌素B1a含量比出發(fā)菌株低5%的視為負(fù)突變菌株，在5%以內(nèi)的視為無義突變菌株，高于5%的視為正突變菌株。其中，阿維菌素B1a正突變率指正突變菌株占全部被考察菌株的比例。

1.3.6突變菌株的初篩和復(fù)篩

初篩：轉(zhuǎn)接至斜面培養(yǎng)基中，在28℃、200 r/min搖床轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)6～7 d后，取二分之一的菌體于離心管中，加入0.5 mL丙酮，浸泡12～15 h。然后加入0.25 mL乙酸乙酯，在快速混勻器上振蕩l min，3 000 r/min離心10 min，取上清采用紫外分光光度法在波長254 nm處測定樣品的光密度（OD254nm值）。以乙酸乙酯為空白對照，根據(jù)測得的光密度值結(jié)果，淘汰50%的低效價菌株。

復(fù)篩：將初篩得到的高產(chǎn)量菌株斜面接入種子培養(yǎng)基中于28℃、200 r/min搖床轉(zhuǎn)速下擴大培養(yǎng)40 h，以5%（V/V）的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，在28℃、200 r/min搖床轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)8～9 d，用高效液相色譜法測定發(fā)酵液中阿維菌素B1a含量。

1.3.7發(fā)酵液中阿維菌素B1a含量測定

取發(fā)酵液3 mL，在3 500 r/min條件下離心10 min，棄上清液，加入甲醇至9 mL，在漩渦混合器上振蕩30 min，3 500 r/min離心10 min后取上清液經(jīng)稀釋后用HPLC法測定B1a含量[6]。

色譜條件：色譜柱選用Agilent不銹鋼柱（250 mm× 4.6 mm，8 μm）流動相為甲醇-水（85∶15，V/V），流速為1.0 mL/min，檢測波長245 nm，進樣量20 μL，柱溫30℃。以質(zhì)量濃度為100 μg/mL阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)溶液進行定量分析，阿維菌素B1a含量計算公式如下：

2　結(jié)果與分析

2.1 N+離子注入對菌株存活率的影響

選取出發(fā)菌株AVE-10，利用N+離子注入進行誘變，考察不同注入能量和劑量對菌株存活率的影響，結(jié)果見圖2。

圖2　N+離子注入對菌株存活率的影響Fig.2 Effect of N+ion beam implantation on survival rate of strains

由圖1可知，不同能量的N+離子注入后菌株的存活率曲線均呈現(xiàn)“馬鞍型”曲線[13]。當(dāng)離子注入劑量＜120 ions/cm2時，菌株的存活率隨著N+離子注入劑量的增加而降低；在注入劑量為160×1014ions/cm2時，存活率出現(xiàn)短暫回升達到一個峰值，為40%左右；隨后有逐漸下降，整個曲線呈“馬鞍型”[13]。這種現(xiàn)象發(fā)生的原因可能是低劑量的離子只對孢子細(xì)胞的表面產(chǎn)生損傷及刻蝕，因此細(xì)胞存活率較高；隨著注入劑量的增加，細(xì)胞表面刻蝕加重，離子對細(xì)胞內(nèi)部產(chǎn)生損傷，同時生成大量自由基和軟射線等，從而使細(xì)胞的存活率急劇下降。下降到一定限度時，連續(xù)注入的電荷堆積產(chǎn)生很強的庫倫斥力并對細(xì)胞形成一種所謂的“保護屏障”，阻礙了后續(xù)注入離子對細(xì)胞的損傷，從而達到保護細(xì)胞的作用[13-14]。與此同時，離子注入激活細(xì)胞內(nèi)的各種酶尤其是修復(fù)酶，提高了細(xì)胞損傷的修復(fù)效率，使得存活率有短暫回升[14]；但繼續(xù)增加劑量時，細(xì)胞損傷無所修復(fù)，細(xì)胞失去電荷屏障，存活率再次下降。

2.2 N+離子注入對菌株突變率的影響

經(jīng)不同能量、不同劑量N+離子注入處理后得到的單菌落接種到種子培養(yǎng)基28℃、200 r/min搖床培養(yǎng)40 h后，進行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，考察其正負(fù)突變率變化情況，結(jié)果見表1。

表1　不同劑量N+離子注入對菌株突變率的影響Table 1 Effect of different doses of N+ion beam implantation on mutation rate of strains%

由表1可知，10 keV、14 keV以及18 keV劑量下菌株的正突變率普遍低于16 keV，且負(fù)突變率普遍低于正突變率，也就是說可以確定16 keV為菌種的最佳誘變能量。在能量為16 keV、劑量為160×1014ions/cm2條件下正突變率最高，最容易篩選出效價提高幅度超過10%的正突變菌株，所以確定最佳誘變能量為16 keV、最佳誘變劑量為160×1014ions/cm2。

2.3誘變菌株的篩選

采用能量為16 keV的N+離子，以160×1014ions/cm2的處理劑量對菌株AVE-10進行誘變處理，初篩經(jīng)紫外分光光度法測定后淘汰50%的低產(chǎn)菌株。將初篩獲得的菌株照復(fù)篩要求進行培養(yǎng)后測定發(fā)酵液中阿維菌素B1a含量，根據(jù)HPLC測定結(jié)果，最終篩選獲得3株產(chǎn)阿維菌素B1a含量較高的突變菌株，分別命名為AVE-10-N16、AVE-10-N23、AVE-10-N102，經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后，分別測定各發(fā)酵液種阿維菌素B1a含量，結(jié)果見表2。

由表2可知，篩選得到的3株菌株AVE-10-N16、AVE-10-N23、AVE-10-N102，其發(fā)酵產(chǎn)阿維菌素B1a含量較出發(fā)菌株AVE-10均有一定提高。其中菌株AVE-10-N102發(fā)酵產(chǎn)阿維菌素B1a含量最高，為2847μg/mL，比出發(fā)菌株提高了18.8%。

表2　突變菌株產(chǎn)阿維菌素B1a含量Table 2 Content of avermectins B1aproduced by the mutant strain

通過對篩選到得到菌株AVE-10-N102進行重復(fù)誘變一次，最終篩選到高產(chǎn)菌株產(chǎn)阿維菌素B1a含量從2396μg/mL提高到3 012 μg/mL，將其命名為AVE-10-N102-26。

2.4菌株遺傳穩(wěn)定性試驗結(jié)果

對篩選到的高產(chǎn)阿維菌素B1a菌株AVE-10-N102-26進行遺傳穩(wěn)定考察。將出發(fā)菌株和篩選到得高產(chǎn)菌株AVE-10-N102-26共傳5代，每代做3個平行樣。遺傳穩(wěn)定性試驗結(jié)果見表3。

表3　突變菌株遺傳穩(wěn)定性試驗結(jié)果Table 3 Results of genetic stability tests of the mutant strain

由表3可知，高產(chǎn)菌株AVE-10-N102-26傳代5次，其發(fā)酵產(chǎn)阿維菌素B1a的含量基本維持不變，與出發(fā)菌株比較，突變提高在23%以上，表明其很好地保持高產(chǎn)穩(wěn)定的能力，阿維菌素B1a含量遺傳穩(wěn)定在3 000 μg/mL左右。

3　結(jié)論

為篩選到產(chǎn)阿維菌素B1a含量較高的阿維鏈霉菌，本研究采用低能N+離子注入阿維鏈霉菌進行誘變篩選，確定出低能N+離子注入的最優(yōu)誘變能量及最優(yōu)誘變劑量分別為16 keV和160×1014ions/cm2。在此條件下，篩選得到高產(chǎn)菌株AVE-10-N102-26，其產(chǎn)阿維菌素B1a含量為3 012 μg/mL，較出發(fā)菌株提高了25.7%，且遺傳穩(wěn)定性較好。誘變選育結(jié)果表明，低能N+離子注入法在提高菌株突變率的同時，對正向突變菌株也起到了一定的富集作用[15]，是一種有效的誘變篩選模型，在微生物誘變選育領(lǐng)域具有廣泛的使用價值。

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Mutation screening of avermectins B1aproducing strains with low energy N+ion beam implantation

GONG Wenjing1,LOU Xingkun1*,YU Long2
(1.Depatment of Quality Management,Yangtze River Pharmaceutical Group Co.,Ltd.,Taizhou 225321,China; 2.College of Biotechnology&Pharmaceutical Engineering,Nanjing University of Technology,Nanjing 211816,China)

Using the avermectins-producingStreptomyces avermitilisas research object,the strain was mutated and screened by low energy N+ion beam implantation.According to the survival rate and mutation rate,the optimum mutation conditions were determined as mutation energy 18 keV and mutation dose 160×1014ions/cm2.The high yield mutant strain AVE-10-N102-26 was obtained by mutation,and the content of avermectins B1awas 3 012 μg/ml,which was 25.7%higher than that of original strain AVE-10.The results of subculture tests indicated that the strain had good genetic stability.

avermectins B1a;mutation screening;ion beam implantation

Q939.97

0254-5071（2016）08-0133-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.08.030

2016-03-31

中國科學(xué)院知識創(chuàng)新工程重大項目（KZCX1-YW-14-3）

龔文靜（1987-），女，助理工程師，碩士，研究方向為工業(yè)微生物育種。

婁興焜（1987-），男，助理工程師，本科，研究方向為制藥工程。