顧斌濤，黃國昌，熊大維

（江西省科學(xué)院微生物研究所，江西南昌330096）

內(nèi)切葡聚糖酶基因cel7b在里氏木霉中的同源表達(dá)

顧斌濤，黃國昌，熊大維

（江西省科學(xué)院微生物研究所，江西南昌330096）

用里氏木霉（Trichoderma reesei）作為宿主同源表達(dá)內(nèi)切葡聚糖酶基因。運(yùn)用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)從里氏木霉cDNA中擴(kuò)增得到內(nèi)切葡聚糖酶基因cel7b序列，并將其連接到載體p18-m2上構(gòu)建重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到里氏木霉菌株中，通過篩選獲得表達(dá)內(nèi)切葡聚糖酶的重組里氏木霉工程菌。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）檢測顯示，發(fā)酵液中重組內(nèi)切葡聚糖酶的分子質(zhì)量約48 ku。搖瓶發(fā)酵結(jié)果顯示，內(nèi)切葡聚糖酶在重組里氏木霉中得到分泌表達(dá)，發(fā)酵液中的內(nèi)切葡聚糖酶和濾紙酶活分別達(dá)到了726 U/mL和28.7 U/mL，分別為出發(fā)菌株酶活的2.9倍和1.1倍。玉米芯進(jìn)行糖化試驗(yàn)結(jié)果顯示，重組里氏木霉所產(chǎn)酶液糖化玉米芯的酶解得率為81.4%，比出發(fā)菌株提高了6.3%。

內(nèi)切葡聚糖酶；里氏木霉；纖維素酶；同源表達(dá)

纖維素酶為一組能水解纖維素β-1,4葡萄糖苷鍵的復(fù)合酶，包括外切葡聚糖酶（又稱為纖維二糖水解酶）、內(nèi)切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶[1-3]。內(nèi)切葡聚糖酶作用于纖維素長鏈分子內(nèi)部非結(jié)晶區(qū)，通過水解β-1,4糖苷鍵將長鏈的纖維素大分子切成短纖維，由于內(nèi)切葡聚糖酶能特異性水解纖維素分子，因此在紡織、造紙和洗滌等工業(yè)中發(fā)揮著重要作用[4-6]。內(nèi)切葡聚糖酶廣泛存在于自然界的細(xì)菌、真菌和植物等各類生物體中[7-9]。近幾十年來對內(nèi)切葡聚糖酶基因的克隆和表達(dá)研究較為普遍，內(nèi)切葡聚糖酶基因的常見表達(dá)宿主菌有大腸桿菌、酵母和絲狀真菌。DHARA H等[10]克隆了類芽孢桿菌屬（Paenibacillussp.）的內(nèi)切葡聚糖酶基因并在大腸桿菌中表達(dá)。KARAOURI A C等[11]克隆了嗜熱毀絲霉（Myceliophthora thermophila）的內(nèi)切葡聚糖酶基因并在畢赤酵母中表達(dá)。YIN Y R等[12]克隆了耐鹽嗜熱裂孢菌（Thermobifida halotolerans）的內(nèi)切葡聚糖酶基因并在大腸桿菌中表達(dá)。WANG W等[13]將內(nèi)切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶基因在里氏木霉（Trichoderma reesei）中進(jìn)行共表達(dá)，共表達(dá)重組菌株所產(chǎn)酶液比表達(dá)單獨(dú)酶組分具有更高降解纖維素的活性。

里氏木霉（Trichoderma reesei）是目前工業(yè)上重要的產(chǎn)纖維素酶的菌種，具有纖維二糖水解酶基因I強(qiáng)啟動子，大量同源或異源酶基因已經(jīng)在里氏木霉中獲得表達(dá)[14-17]。里氏木霉纖維二糖水解酶活性較高，內(nèi)切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的活性偏低。里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶基因cel7b表達(dá)的酶蛋白CEL7B具有較高的酶比活力，并含有纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域，具有較強(qiáng)的降解羧甲基纖維素的能力。為增強(qiáng)里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶的活性，本試驗(yàn)以里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶基因cel7b為目的基因，利用聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）從里氏木霉中克隆到cel7b基因，用根瘤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將其導(dǎo)入到里氏木霉中進(jìn)行表達(dá)，獲得高效表達(dá)內(nèi)切葡聚糖酶基因的重組里氏木霉菌，進(jìn)一步對重組菌進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶及利用酶液對玉米芯進(jìn)行糖化。本研究在構(gòu)建高產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶菌株和利用纖維素資源生產(chǎn)還原糖方面具有意義。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌株和質(zhì)粒

里氏木霉（Trichoderma reesei）WU3和質(zhì)粒p18-m2（含纖維二糖水解酶Ⅰ基因啟動子及信號肽和潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因）均為實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2試劑

限制性內(nèi)切酶：加拿大Fermentas公司；T4脫氧核糖核酸（deoxyribose nucleic acid，DNA）連接酶、TaqDNA聚合酶：大連寶生物公司；質(zhì)粒小量提取和核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）抽提試劑盒：上海生工公司；羧甲基纖維素鈉（carboxyl methyl cellulose-Na，CMC-Na）：美國Sigma公司。其他化學(xué)試劑為國產(chǎn)分析純。

1.1.3培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：土豆200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂粉18 g/L。200 g去皮的土豆切成小塊，加水800 mL煮沸30 min，用紗布過濾，補(bǔ)足水至1 000 mL，加20 g/L葡萄糖。固體培養(yǎng)基加18 g/L瓊脂粉。115℃濕熱滅菌30 min。

CMC篩選培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉20 g/L，KH2PO48g/L，（NH4）2SO45g/L，MgSO40.6g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O0.005g/L，CaCl20.6 g/L，MnSO4·H2O 0.001 6 g/L，ZnSO4·7H2O 0.001 4 g/L，CoC12·6H2O 0.003 7 g/L，瓊脂粉18 g/L，121℃濕熱滅菌20 min。

1.2儀器與設(shè)備

ZWY-2102C恒溫?fù)u床：上海智城分析儀器制造有限公司；ZF-288凝膠成像系統(tǒng)：上海嘉鵬科技有限公司；UV-6100紫外可見分光光度計(jì)：上海元析儀器有限公司；EPS600電泳儀：上海天能科技有限公司；MG25+PCR儀：杭州郎基科學(xué)儀器有限公司；H1650-W離心機(jī)：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司。

1.3方法

1.3.1內(nèi)切葡聚糖酶基因的克隆

采用真菌總RNA抽提試劑盒提取里氏木霉WU3菌絲體總RNA，并用互補(bǔ)脫氧核糖核酸（complementary deoxyribonucleic acid，cDNA）合成試劑盒獲得cDNA。根據(jù)現(xiàn)有內(nèi)切葡聚糖酶基因序列設(shè)計(jì)合成引物。上游引物：CTGGATCCTTGTCCCAAAATGGCGCCCT；下游引物：CTTCTAGAGTCTTATATATTAAGCCCAA。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min，94℃、40s→64℃、40s→72℃、100 s，29次循環(huán)，72℃延伸8 min。將擴(kuò)增得到的目的片段進(jìn)行電泳并進(jìn)行膠回收，連入pMD18-T simple Vector測序后保存。

1.3.2重組載體的構(gòu)建

雙酶切質(zhì)粒p18-m2，用T4連接酶將內(nèi)切葡聚糖酶基因片段連接至纖維二糖水解酶Ⅰ啟動子PcbhⅠ和終止子之間，得到重組質(zhì)粒p18-m2cel。

1.3.3酶基因?qū)肜锸夏久?/p>

采用根瘤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將質(zhì)粒p18-m2cel導(dǎo)入里氏木霉WU3[7]，其中PDA抗性平板潮霉素B質(zhì)量濃度為100 μg/mL。將PDA平板上培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化子菌落轉(zhuǎn)接到CMC篩選培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)，選取菌落直徑大的木霉轉(zhuǎn)化子保存。

1.3.4轉(zhuǎn)化子產(chǎn)酶試驗(yàn)

以出發(fā)菌WU3為對照，在PDA平板上培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子5 d，接到種子培養(yǎng)基培養(yǎng)2 d，轉(zhuǎn)接至產(chǎn)酶培養(yǎng)基（搖瓶裝液量50 mL/250 mL），在溫度30℃和轉(zhuǎn)速180 r/min條件下培養(yǎng)48 h。每株菌種做3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。

1.3.5十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳

十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）電泳樣品取發(fā)酵液離心后的上清液，采用12%的聚丙烯酰胺，0.1%考馬斯亮藍(lán)R-250染色，乙酸∶甲醇∶水1∶2∶7（V/V）脫色。電泳上樣量10 μL，電泳凝膠的配方、電泳的參數(shù)以及凝膠的染色、脫色等參照標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行。

1.3.6酶活力測定

內(nèi)切葡聚糖酶活（endoglucanase activity，EGA）定義：用檸檬酸緩沖液（0.05 mol/L、pH 4.8）配制的1%羧甲基纖維素鈉與稀釋500倍的纖維素酶液在50℃水浴反應(yīng)30 min后，3,5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）法測定上清液中的還原糖。每小時(shí)由底物產(chǎn)生1.0 mg還原糖所需的酶量為一個(gè)活力單位，用U/mL表示。

纖維二糖水解酶活（cellobiohydrolase activity，CBHA）定義：微晶纖維素為底物與稀釋10倍的纖維素酶液在50℃水浴反應(yīng)30 min后，DNS法測定上清液中的還原糖。每小時(shí)由底物產(chǎn)生1.0 mg還原糖所需的酶量為一個(gè)活力單位，用U/mL表示。

β-葡萄糖苷酶活（β-glucosidase activity，BGA）定義：以纖維二糖為底物，用葡萄糖氧化酶法測定。每個(gè)單位的β-葡萄糖苷酶活力為每小時(shí)水解1.0 mg纖維二糖所需的酶量，用U/mL表示。

濾紙酶活力（filter paper cellulase activity，F(xiàn)PA）定義：取Whatman No.1濾紙與稀釋20倍的纖維素酶液在50℃水浴反應(yīng)30 min后，DNS法測定上清液中的還原糖。一個(gè)單位的濾紙酶活力為1 h生成1.0 mg還原糖所需的酶量，用U/mL表示。

1.3.7玉米芯酶解實(shí)驗(yàn)

用酸處理（1%硫酸110℃處理60 min）后的玉米芯殘?jiān)鳛榈孜?，加入纖維素酶在pH 5.0、50℃、100 r/min的水浴搖床進(jìn)行水解，用酶量為每1 g底物8 mL酶液，DNS法測定酶解液中的還原糖含量。酶解得率計(jì)算公式如下：

式中：Y為酶解得率，%；M為還原糖總量，g；62.8為每100 g底物中纖維素和半纖維素的質(zhì)量，g。

2　結(jié)果與分析

2.1基因的克隆

通過反轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）法擴(kuò)增cel7b基因，電泳顯示獲得長度約為1.4 kbp的DNA片段（圖1）。通過測序顯示該基因序列全長為1 377 bp，編碼459個(gè)氨基酸；Blast比對分析顯示基因同源率為99%，而蛋白序列的同源率為100%，可以確定該基因?yàn)槔锸夏久梗═richoderma reesei）cel7b基因。

圖1　RT-PCR擴(kuò)增cel7b基因和總RNA的電泳圖Fig.1 Electrophoretogram of RT-PCR amplification products of genecel7band total RNA

2.2轉(zhuǎn)化子的產(chǎn)酶

通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法獲得156株木霉轉(zhuǎn)化子，進(jìn)一步在篩選培養(yǎng)基上初篩獲得6株菌落直徑＞4.0 cm的菌株，依次命名為E1～E6。將6株菌株進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶，結(jié)果見圖2。

由圖2可知，木霉轉(zhuǎn)化子內(nèi)切葡聚糖酶活比出發(fā)菌株都有較大提高，轉(zhuǎn)化子E4菌株內(nèi)切葡聚糖酶活為726 U/mL，為出發(fā)菌株WU3（248 U/mL）的2.9倍，濾紙酶活為28.7 U/mL，是出發(fā)菌株WU3（25.4 U/mL）的1.1倍。進(jìn)一步分析纖維素酶酶系的組分，結(jié)果見表1。由表1可知，菌株E4的β-葡萄糖苷酶活與出發(fā)菌株WU3相差不大，纖維二糖水解酶活略低于出發(fā)菌株WU3，這說明轉(zhuǎn)化子E4菌株濾紙酶活的提高主要由于其內(nèi)切葡聚糖酶活較高。丁新麗等[18]將里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶基因cel7b片斷分別插入酵母met10和pgk1啟動子和終止子序列之間，構(gòu)建質(zhì)粒并通過電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入到釀酒酵母菌株中，獲得的酵母轉(zhuǎn)化子表達(dá)內(nèi)切葡聚糖酶活力為126.7 U/mL。

圖2　重組里氏木霉產(chǎn)酶結(jié)果Fig.2 Results of enzyme production by recombinantT.reesei

表1　纖維素酶組分的測定結(jié)果Table 1 Determination results of cellulase componentsU/mL

2.3蛋白電泳檢測內(nèi)切葡聚糖酶的表達(dá)

用SDS-PAGE檢測重組里氏木霉發(fā)酵液上清中的酶蛋白表達(dá)產(chǎn)物，電泳結(jié)果顯示在66.2 ku和42.7 ku之間有一條較濃的條帶，而對照出發(fā)菌株發(fā)酵液上清中此位置的條帶較淺（見圖3）。根據(jù)蛋白電泳的分子質(zhì)量和遷移率的關(guān)系，計(jì)算出該蛋白的分子質(zhì)量約為48 ku。

圖3　發(fā)酵酶液SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of fermentation liquid

2.4纖維素酶對玉米芯的糖化

用重組里氏木霉E4和出發(fā)菌株WU3的酶液分別對10 g酸處理后的玉米芯纖維殘?jiān)M(jìn)行糖化試驗(yàn)，結(jié)果見表2。由表2可知，采用菌株E4產(chǎn)纖維素酶進(jìn)行的酶解糖化試驗(yàn)，酶解得率為81.4%，比出發(fā)菌株（酶解得率75.1%）提高了6.3%。

表2　玉米芯纖維酶解結(jié)果Table 2 Results of enzymatic hydrolysis of corncob fiber

纖維素酶的3種組分外切葡聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶在水解纖維素的過程中需要互相配合，協(xié)同降解。對于木質(zhì)纖維素酶解產(chǎn)可發(fā)酵糖來說，需要組分全面的纖維素酶系。傳統(tǒng)的纖維素酶系研究中，常通過“雞尾酒”法，即通過勾兌各纖維素酶系組分的比例對特定的木質(zhì)纖維素原料進(jìn)行最優(yōu)降解。通過基因工程高表達(dá)纖維素酶系組分也是纖維素酶系研究的一個(gè)重要研究方向。酶蛋白CBHⅠ占里氏木霉總分泌蛋白的50%～60%，其啟動子PcbhⅠ為強(qiáng)啟動子，可用于表達(dá)里氏木霉纖維素酶各組分。WANG B等[19]通過高表達(dá)β-葡萄糖苷酶組分使里氏木霉的總纖維素酶活提高了44%。FANGH等[20]利用啟動子PcbhⅠ高表達(dá)里氏木霉外切葡聚糖酶組分，獲得的重組里氏木霉菌株的總纖維素酶活為出發(fā)菌株的4.3倍。另外，多拷貝也是基因高效表達(dá)的常用技術(shù)方法，考慮到用于強(qiáng)啟動子表達(dá)的各種調(diào)控因子不足，對PcbhⅠ啟動子中CCAAT盒和Ace2結(jié)合位點(diǎn)序列進(jìn)行多拷貝以增加表達(dá)量[21]。

3　結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)從里氏木霉菌株中成功克隆到內(nèi)切葡聚糖酶基因cel7b，將該基因置于里氏木霉的強(qiáng)啟動子及信號肽下用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入里氏木霉宿主進(jìn)行表達(dá)，通過篩選得到6株里氏木霉轉(zhuǎn)化子。在搖瓶條件下，重組菌產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶、濾紙酶活力分別提高至出發(fā)菌株的2.9倍、1.1倍，成功實(shí)現(xiàn)了內(nèi)切葡聚糖酶基因在里氏木霉中的高效同源表達(dá)。重組菌所產(chǎn)纖維素酶對玉米芯纖維殘?jiān)拿附獾寐蕿?1.4%，比出發(fā)菌株提高了6.3%。表明重組里氏木霉E4因含有高活力的內(nèi)切葡聚糖酶，能提高纖維素酶各組分的協(xié)同酶解性能，能更加有效地水解木質(zhì)纖維素，該重組菌株的構(gòu)建對于高產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶菌株的構(gòu)建和提高纖維素酶的催化活性具有研究意義，在木質(zhì)纖維素的降解方面有較大應(yīng)用價(jià)值。

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Homologous expression of endoglucanase genecel7binTrichoderma reesei

GU Bintao,HUANG Guochang,XIONG Dawei
(Institute of Microbiology,Jiangxi Academy of Sciences,Nanchang 330096,China)

Using theTrichoderma reeseias host,the endoglucanase gene was homologously expressed.The endoglucanase genecel7bsequence was amplified by polymerase chain reaction(PCR)fromT.reeseicDNA.The amplified products were ligated into the carrier p18-m2 to construct recombinant plasmid.The recombinant plasmid was transformed intoT.reeseistrain,and a recombinationT.reeseiengineering strain of expressing endoglucanase was obtained by screening.The results of sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis showed that the molecular mass of recombination endoglucanase in fermented liquid was about 48 ku.The results of shaking flask fermentation showed that endoglucanase in recombinantT.reeseiwas secreted and expressed.The endoglucanase activity in fermented liquid and filter paper were up to 726 U/ml and 28.7 U/ml,respectively,which were 2.9 times and 1.1 times than that of original strain,respectively.The results of saccharification tests of corncob showed that enzymatic hydrolysis yield of corncob saccharified by enzyme from recombinantT.reeseicellulase was 81.4%,which was 6.3%higher than that of original strain.

endoglucanase;Trichoderma reesei;cellulase;homologous expression

Q566.2

0254-5071（2016）08-0129-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.08.029

2016-03-29

江西省科研院所基礎(chǔ)設(shè)施配套項(xiàng)目（20142BBA13030）；江西省科學(xué)院科研開發(fā)專項(xiàng)基金（2014-YYB-01）；江西省科學(xué)院協(xié)同創(chuàng)新專項(xiàng)資金普惠一類項(xiàng)目（2013-XTPH-29）

顧斌濤（1980-），男，助理研究員，博士，研究方向?yàn)楣I(yè)酶制劑。