劉凱麗，賈瑞博，李燕，李鑫，劉斌，黃一帆*

（1.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福州350002；2.國家菌草工程技術(shù)研究中心，福州350002；3.福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，福州350002）

星蟲多糖提取工藝優(yōu)化及其抗氧化作用研究

劉凱麗1，2，賈瑞博1，2，李燕1，2，李鑫2，劉斌1，2，黃一帆3*

（1.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福州350002；2.國家菌草工程技術(shù)研究中心，福州350002；3.福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，福州350002）

以星蟲多糖提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察不同料液比、超聲時(shí)間、超聲溫度、超聲功率4個(gè)因素對(duì)超聲輔助提取星蟲多糖的影響。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)確定了星蟲多糖超聲輔助提取的最佳工藝條件為料液比1∶25(g∶mL)，超聲溫度70℃，超聲時(shí)間50 min，超聲功率400 W。在此工藝條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，星蟲多糖提取率的平均值為7.01%。體外抗氧化研究結(jié)果表明，星蟲多糖對(duì)DPPH自由基、羥自由基清除率分別為76.31%、56.93%，有一定的抗氧化作用。

星蟲多糖；超聲波；響應(yīng)面試驗(yàn)；工藝優(yōu)化；抗氧化

海洋星蟲又稱沙蟲，在我國古代醫(yī)學(xué)著作中多有記載，中醫(yī)認(rèn)為其有清肺補(bǔ)虛、滋陰降火的功效，有著“海洋里的冬蟲夏草”和“動(dòng)物人參”的美譽(yù)。研究表明，星蟲中的主要活性成分為蛋白質(zhì)、多糖、礦物質(zhì)元素等，對(duì)調(diào)節(jié)機(jī)體多種機(jī)能具有重要的作用。隨著海洋生物資源的進(jìn)一步開發(fā)和對(duì)糖類藥物研究的日益重視，海洋動(dòng)物多糖的研究與開發(fā)也將越來越受到關(guān)注，成為熱點(diǎn)之一。海洋動(dòng)物多糖具有許多重要的生理活性，如抗腫瘤、抗病毒、降血脂、抗氧化及改善免疫功能[1]。目前國內(nèi)外對(duì)星蟲的研究主要集中在養(yǎng)殖技術(shù)[2]、營養(yǎng)分析[3]、藥用價(jià)值[4-5]等方面，對(duì)星蟲活性物質(zhì)的生理活性研究表明，星蟲多糖具有抗輻射、抗疲勞、抗氧化、抗病毒、調(diào)節(jié)免疫[6-10]等多種生物學(xué)功能。

多糖的提取方法主要有酶法、溶劑浸提法、超聲輔助提取法、微波輔助提取法、超臨界流體萃取法等。目前星蟲多糖的提取多為熱水浸提法、堿提法、酶解法，但存在耗時(shí)較長、對(duì)溫度等條件要求較高且提取率較低等問題[11-12]。而用超聲波提取星蟲多糖是一種物理過程，不僅能保證試材的生物活性在短時(shí)間內(nèi)保持不變還可提高提取率，縮短提取時(shí)間。利用響應(yīng)面優(yōu)化法可以對(duì)多種試驗(yàn)因素及其相互作用的有效性進(jìn)行分析，因此，本研究采用超聲波輔助提取法對(duì)星蟲多糖進(jìn)行提取，考察料液比、超聲時(shí)間、超聲溫度、超聲功率4個(gè)因素對(duì)星蟲多糖提取率的影響，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，運(yùn)用響應(yīng)面法，確定提取星蟲多糖的最佳條件，同時(shí)對(duì)星蟲多糖體外抗氧化活性進(jìn)行研究，期望為海洋多糖的研究和海洋藥物的開發(fā)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

鮮方格星蟲：市售。

葡萄糖，無水乙醇，三氯乙酸，苯酚，濃硫酸，硫化亞鐵，過氧化氫，鄰羥基苯甲酸（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：美國Sigma公司。

1.2儀器與設(shè)備

HH-3A數(shù)顯三用水浴鍋：金壇市精達(dá)儀器制造廠；SC-3612低低速離心機(jī)：科大創(chuàng)新股份有限公司；EO2140電子分析天平：賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司；SHB.IIIS循環(huán)水多用真空泵：上海申生科技有限公司；DHG-9240A電熱恒溫干燥箱：上海一恒科技有限公司；R201旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海申生科技有限公司；TYPEFDU-1000冷凍干燥機(jī)：東京理化器械株式會(huì)社；TU-1810紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1多糖的提取

取勻漿后的方格星蟲50 g，經(jīng)超聲輔助提取后，用八層紗布過濾，抽濾后上清液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至體積的1/3后，加入4倍體積的無水乙醇，4℃過夜。4 500 r/min離心10 min取沉淀，沉淀即為粗多糖，用3%三氯乙酸脫蛋白3次后調(diào)pH值為7.0，將多糖溶液流水透析24 h后得到星蟲多糖提取液。

1.3.2葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線[13]

精確稱取烘干至恒質(zhì)量的葡萄糖0.100 0 g，加入適量蒸餾水溶解，轉(zhuǎn)移至1 000 mL容量瓶中定容備用，得到質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。吸取標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液0、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL，置于20 mL試管中，加入蒸餾水至1.0 mL，搖勻。然后向其中加入5%苯酚溶液1.0 mL，再快速垂直加入5.0 mL濃硫酸，搖勻后靜置10 min，將試管放在40℃水浴鍋中反應(yīng)15 min，拿出后冷卻至室溫，用紫外可見分光光度計(jì)于波長490 nm處測其吸光度值，以葡萄糖含量（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程。

1.3.3單因素試驗(yàn)

料液比：分別取方格星蟲50 g，超聲功率300 W，超聲時(shí)間為60 min，超聲溫度為80℃，研究不同料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g∶mL））對(duì)星蟲多糖提取率的影響。

超聲功率：分別取方格星蟲50 g，料液比1∶20（g∶mL），超聲時(shí)間為60 min，超聲溫度為80℃，研究不同超聲功率（200 W、250W、300W、350W、400W）對(duì)星蟲多糖提取率的影響。

超聲時(shí)間：分別取方格星蟲50 g，超聲功率300 W，超聲溫度為80℃，料液比1∶20（g∶mL），研究不同超聲時(shí)間（20 min、40 min、60 min、80 min、100 min）對(duì)星蟲多糖提取得率的影響。

超聲溫度：分別取方格星蟲50 g，料液比1∶20（g∶mL），超聲時(shí)間為60 min，研究不同超聲溫度（40℃、50℃、60℃、70℃、80℃）對(duì)星蟲多糖提取率的影響。

1.3.4響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選取料液比、超聲功率、超聲溫度和超聲時(shí)間為試驗(yàn)因素，以多糖提取率（Y）為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)4因素3水平響應(yīng)面分析試驗(yàn)，對(duì)多糖提取工藝進(jìn)行優(yōu)化分析，因素及水平見表1。

表1　星蟲多糖提取工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table1 Factors and levels of response surface experiments for Sipunculus nuduspolysaccharide extraction condition optimization

1.3.5分析方法

多糖的測定：吸取適量提取液，按1.3.2的方法測定樣品在波長490 nm處的吸光度值，通過回歸方程計(jì)算提取液中多糖的含量。星蟲多糖提取率計(jì)算公式如下：

式中：C為星蟲多糖溶液的質(zhì)量濃度，mg/mL；V為星蟲多糖溶液的體積，mL；m為星蟲干質(zhì)量，g。

1.3.6體外抗氧化研究

羥自由基（·OH）清除能力：按照參考文獻(xiàn)[14]的方法進(jìn)行測定，·OH清除率計(jì)算公式如下：

DPPH·清除能力：按照參考文獻(xiàn)[15]的方法進(jìn)行測定，DPPH·清除率計(jì)算公式如下：

2　結(jié)果與分析

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定

以葡萄糖質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖1。

圖1　葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of glucose

由圖1可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為y=0.981x+0.0033，相關(guān)系數(shù)R2=0.997 6，標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合度良好，表明吸光度值在葡萄糖質(zhì)量濃度0～1.2 mg/mL的范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

2.2單因素試驗(yàn)結(jié)果

綜上所述，高速公路的大規(guī)模施工在我國不斷展開，不但使人們的實(shí)際需求得到了滿足，也使社會(huì)各界越來越關(guān)注路施工的質(zhì)量，廣大人民群眾也漸漸重視軟土路基施工的質(zhì)量，鑒于此，相關(guān)施工技術(shù)人員應(yīng)該深入了解路基的真實(shí)情況，不斷優(yōu)化、創(chuàng)新軟土路基的施工技術(shù)，提升軟土路基的施工質(zhì)量。

2.2.1料液比對(duì)星蟲多糖提取率的影響

由圖2可知，隨著料液比的增加，星蟲多糖提取率逐漸增加，在料液比為1∶20（g∶mL）時(shí)星蟲多糖提取率達(dá)到最高，繼續(xù)增大料液比，多糖提取率急劇下降?？赡艿脑蚴橇弦罕容^低時(shí)，溶液的黏度過高，使得多糖難以析出，隨著料液比的增大，多糖的擴(kuò)散性增強(qiáng)，多糖提取率有所提高，但料液比過高，溶劑過多，增加了超聲波下細(xì)胞破壁的阻力，致使星蟲多糖提取率下降。因此，選取1∶20（g∶mL）為星蟲多糖提取最佳料液比。

圖2　料液比對(duì)星蟲多糖提取率的影響Fig.2 Effect of ratio onSipunculus nuduspolysaccharides yield solid-liquid

2.2.2超聲功率對(duì)星蟲多糖提取率的影響

由圖3可知，隨著超聲功率的增加，星蟲多糖的提取率逐漸增加，在超聲功率為400 W時(shí)星蟲多糖提取率達(dá)到最高，繼續(xù)升高超聲功率，星蟲多糖提取率趨于穩(wěn)定?？赡艿脑蚴请S著超聲功率的增大，細(xì)胞破壁程度增強(qiáng)，較多的多糖可以進(jìn)入溶劑，致使多糖提取率增加。因此，選取400 W為星蟲多糖提取最佳超聲功率。

圖3　超聲功率對(duì)星蟲多糖提取率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic power onSipunculus nudus polysaccharides yield

2.2.3超聲時(shí)間對(duì)星蟲多糖提取率的影響

由圖4可知，隨著超聲時(shí)間的增加，星蟲多糖提取率逐漸增加，在60 min時(shí)星蟲多糖提取率達(dá)到最高，繼續(xù)延長超聲時(shí)間，星蟲多糖提取率呈現(xiàn)下降趨勢?？赡艿脑蚴浅晻r(shí)間過短，多糖的提取不夠充分，隨著超聲時(shí)間的增加，破壁的效果增強(qiáng)致使多糖的溶出率增加，但超聲時(shí)間過長，多糖的次級(jí)鍵被破壞致使多糖降解，從而多糖的提取率降低。因此，選取60 min為星蟲多糖提取最佳超聲時(shí)間。

圖4　超聲時(shí)間對(duì)星蟲多糖提取率的影響Fig.4 Effect of extraction time onSipunculus nudus polysaccharides yield

由圖5可知，隨著超聲溫度的升高，星蟲多糖提取率迅速增加，在60℃時(shí)星蟲多糖提取率達(dá)到最高，繼續(xù)升高超聲溫度，星蟲多糖提取率基本趨于穩(wěn)定?？赡艿脑蚴请S著溫度的提高，多糖的溶解度增強(qiáng)，擴(kuò)散性提高，致使多糖提取率增加，當(dāng)溫度到達(dá)一定水平，多糖的溶解度基本不再發(fā)生變化，使得多糖提取率基本穩(wěn)定，但溫度過高，部分多糖可能會(huì)水解為單糖、低聚糖等，降低了星蟲多糖提取率。因此，選取60℃為星蟲多糖提取最佳超聲溫度。

圖5　超聲溫度對(duì)星蟲多糖提取率的影響Fig.5 Effect of extraction temperature onSipunculus nudus polysaccharides yield

2.3星蟲多糖提取工藝的響應(yīng)面優(yōu)化

2.3.1響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

在單因素的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選取料液比（A）、超聲溫度（B）、超聲時(shí)間（C）和超聲功率（D）為4個(gè)試驗(yàn)因素，以星蟲多糖提取率（Y）作為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)4因素3水平試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表2　星蟲多糖提取工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of response surface methodology for Sipunculus nuduspolysaccharide extraction condition optimization

采用Design Expert 8.0.6軟件對(duì)表2結(jié)果進(jìn)行多元模型擬合回歸分析，得到星蟲多糖提取率（Y）對(duì)料液比（A）、超聲溫度（B）、超聲時(shí)間（C）和超聲功率（D）的二次多項(xiàng)回歸模型方程：

對(duì)回歸模型進(jìn)行方差分析和系數(shù)顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見表3。

表3　回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance for quadric regression model of experiment

由表3可知，星蟲多糖得率響應(yīng)面模型的F值為46.5363，P＜0.000 1差異極顯著；失擬項(xiàng)的F值為5.271 4，P=0.061 7，差異不顯著，說明該模型擬合性較好，數(shù)據(jù)無異常點(diǎn)，因此由不確定因素所帶來的影響可以忽略。模型的決定系數(shù)R2= 0.979 0，說明提取率的變化有97.90%來源于所選的4個(gè)變量，即料液比、超聲溫度、超聲時(shí)間和超聲功率；該模型調(diào)整決定系數(shù)R2Adj=0.957 9；預(yù)測樣本決定系數(shù)R2=0.885 1。由于預(yù)測樣本的決定系數(shù)與調(diào)整后的決定系數(shù)較一致，故可以得出該模型擬合度良好，回歸方程能較好的描述各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系，此模型可用于對(duì)星蟲多糖提取得率的分析和預(yù)測，試驗(yàn)方法有效可靠。

由表3可知，該模型中一次項(xiàng)中B、C、D對(duì)該模型的影響達(dá)到極顯著（P＜0.01）水平，A對(duì)該模型的影響達(dá)到顯著（P＜0.05）水平。二次項(xiàng)中A2和C2和D2對(duì)該模型的影響均達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）；此外，該模型的交互項(xiàng)中AD、BC和BD均達(dá)到了極顯著水平（P＜0.01）。因此可以得出，試驗(yàn)因子對(duì)響應(yīng)值的影響并不是簡單的線性關(guān)系，且影響星蟲多糖提取率因素的順序?yàn)椋撼暅囟龋˙）＞超聲功率（D）＞超聲時(shí)間（C）＞料液比（A）。

2.3.2交互項(xiàng)作用對(duì)星蟲多糖提取率影響的分析

通過Design-expert 8.0.6軟件，由多項(xiàng)二次回歸方程可得到響應(yīng)面圖，見圖6。

圖6　料液比、超聲溫度、超聲時(shí)間、超聲功率交互作用對(duì)星蟲多糖提取率影響的響應(yīng)面和等高線Fig.6 Response surface plots and contour line of effects of interaction between solid-liquid ratio,ultrasound temperature, time and power onSipunculus nuduspolysaccharide extraction rate

由圖6可知，該模型的交互項(xiàng)中AD、BC和BD均達(dá)到了極顯著水平（P＜0.01）。對(duì)二次多項(xiàng)式回歸方程進(jìn)行計(jì)算，得到最佳的提取條件為料液比為1∶24.87（g∶mL），超聲溫度為69.33℃，超聲時(shí)間為47.88 min，超聲功率為386.68 W，預(yù)測提取得率為7.029 5%?？紤]試驗(yàn)的可操作性，將參數(shù)修正為料液比1∶25（g∶mL），超聲溫度70℃，超聲時(shí)間50min，超聲功率為400 W。進(jìn)行5次驗(yàn)證試驗(yàn)，得星蟲多糖平均提取率為7.01%，與理論預(yù)測值基本一致。

2.4星蟲多糖體外抗氧化活性測定

圖7　星蟲多糖及VC對(duì)DPPH(a)以及·OH(b)的清除活性Fig.7 Scavenging activity ofSipunculus nuduspolysaccharide and vitamin C on DPPH(a)and·OH(b)

由圖7可知，隨著樣品質(zhì)量濃度的增加，星蟲多糖對(duì)DPPH自由基、羥自由基清除率隨之增加。在星蟲多糖質(zhì)量濃度為10 mg/mL時(shí)，對(duì)DPPH自由基、羥自由基清除活性分別達(dá)到76.31%、56.93%。均略低于維生素C對(duì)DPPH自由基、羥自由基的清除作用。

3　結(jié)論

通過單因素和響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)確定了超聲波輔助提取星蟲多糖最佳工藝條件：料液比1∶25（g∶mL），超聲溫度70℃，超聲時(shí)間50min，超聲功率400W，在此工藝條件下星蟲多糖平均提取率為7.01%。體外抗氧化研究結(jié)果表明，星蟲多糖對(duì)DPPH自由基、羥自由基清除率分別為76.31%、56.93%，有一定的抗氧化作用。

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Extraction process optimization and antioxidant activity ofSipunculus nuduspolysaccharide

LIU Kaili1,2,JIA Ruibo1,2,LI Yan1,2,LI Xin2,LIU Bin1,2,HUANG Yifan3*
(1.College of Food Science,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350002,China; 2.National Engineering Research Center of JUNCAO Technology,Fuzhou 350002,China; 3.College of Animal Sciences,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350002,China)

UsingSipunculus nuduspolysaccharide extraction yield as evaluation index,the effect of solid-liquid ratio,ultrasonic power,temperature and time onS.nuduspolysaccharide extraction yield was studied.Based on single factor experiment results,the optimal extraction technology was determined by Box-Behnken experiment as follows：solid-liquid ratio 1∶25(g∶ml),temperature 70℃,time 50 min,and power 400 W.Under these conditions,verification tests results showed that the average extraction yield ofS.nuduspolysaccharide was 7.01%.In vitroantioxidant activity results showed that the scavenging effect ofS.nuduspolysaccharide on DPPH and·OH was 76.31%and 56.93%,respectively.which showed certain antioxidant activity.

Sipunculus nuduspolysaccharide;ultrasonic;response surface methodology;extraction process optimization;antioxidant

TQ914.1

0254-5071（2016）08-0115-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.08.026

2016-04-21

國家科技支撐計(jì)劃子課題（2014BAD15B01）；福建省科技重大專項(xiàng)（2014NZ2002-1）；菌草食藥用菌產(chǎn)業(yè)化關(guān)鍵技術(shù)研究與示范”福建省科技重大專項(xiàng)（2014NZ 2002-1）

劉凱麗（1992-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。

黃一帆（1954-），男，教授，博士，研究方向?yàn)樘烊凰幬镅芯颗c應(yīng)用。