嚴雪瑜，蔣欽楊，吳延軍，梁家充，郭亞芬，蘭干球

(廣西大學動物科學技術學院，南寧 530004)

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廣西巴馬小型豬2型糖尿病模型骨骼肌糖代謝及能量代謝相關基因的表達差異

嚴雪瑜，蔣欽楊，吳延軍，梁家充，郭亞芬，蘭干球*

(廣西大學動物科學技術學院，南寧 530004)

目的 探討糖代謝及能量代謝過程中的關鍵調(diào)控基因(PGC-1α、Glut-4、ERRα、NRF-1、TFAM和線粒體基因)在2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)發(fā)生中的作用。方法 以廣西巴馬小型豬T2DM模型建立的發(fā)病組和未發(fā)病組的背最長肌為實驗材料，利用QRT-PCR實時熒光定量的方法對糖代謝及能量代謝相關基因mRNA和線粒體基因的表達情況進行檢測。結果 在廣西巴馬小型豬背最長肌中，T2DM組PGC-1α、Glut-4、ERRα和NRF-1的相對表達量均顯著高于非T2DM組，TFAM和線粒體基因的相對表達量則稍低于非T2DM組。結論 在T2DM巴馬小型豬骨骼肌中，上調(diào)PGC-1α及其下游基因Glut-4、ERRα和NRF-1的表達水平，有利于改善葡萄糖代謝；而線粒體合成不足，致使ATP合成量不夠，或引起胰島素抵抗，進而導致2型糖尿病的發(fā)生。

廣西巴馬小型豬； 2型糖尿病； 骨骼肌； 胰島素抵抗

全球成年人糖尿病患者數(shù)逐年增加，尤其以2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)發(fā)病為主，成為嚴重危害人類健康的慢性非傳染性疾病。而T2DM發(fā)病機制仍不十分清楚，骨骼肌胰島素抵抗(insulin resistance，IR)是T2DM主要病因，研究參與調(diào)控骨骼肌IR的關鍵基因表達差異，對了解T2DM的發(fā)生有一定的作用。

肌肉組織是體內(nèi)胰島素刺激的葡萄糖攝取的主要場所。對T2DM患者進行高血糖-高血胰島素試驗表明，肌肉中的胰島素抵抗是由葡萄糖轉(zhuǎn)運缺陷所致[1]。在T2DM中，葡萄糖轉(zhuǎn)運子4(Glut-4)表達下調(diào)或者由胰島素刺激引起的Glut-4的轉(zhuǎn)位的功能被減弱，終將導致血糖升高[2]。過氧化物酶體增殖激活受體輔激活因子1α(PGC-1α)，對機體葡萄糖代謝、脂肪酸β-氧化以及線粒體生物合成等多種生理功能起到主要調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)，胰島素抵抗個體線粒體代謝的標志物的表達發(fā)生改變、線粒體功能下降，導致肥胖和脂質(zhì)堆積，在胰島素抵抗和2型糖尿病發(fā)病機制中起重要作用[3]。線粒體功能紊亂是引發(fā)骨骼肌胰島素抵抗主要因素之一，線粒體功能性障礙致使ATP合成減少，導致胰島素分泌減少，或引起胰島素抵抗，導致T2DM的發(fā)生[4]。

本實驗通過QRT-PCR的方法測定兩組小型豬(2型糖尿病豬、未發(fā)病豬)的糖代謝及能量代謝等關鍵調(diào)控基因(PGC-1α、Glut-4、ERRα、NRF-1、TFAM)和線粒體基因(12SrRNA和16SrRNA)數(shù)量，探討上述關鍵調(diào)控基因在2型糖尿病發(fā)生中所起到的作用。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

選用高脂高糖飼養(yǎng)的廣西巴馬小型豬10頭，15月齡，分為T2DM組和非T2DM組，每組根據(jù)實驗需求隨機選取3頭，性別不限。均來自廣西大學巴馬小型豬繁育場封閉群【SCXK(桂)2013-0003】，飼養(yǎng)于廣西大學動物遺傳育種實驗室小型豬繁育場內(nèi)，飼養(yǎng)期間給予高脂高糖飼料(60%全價飼料，30%蔗糖，10%豬油)，自由飲水。其中，T2DM組為自然誘導的2型糖尿病小型豬，非T2DM組為未發(fā)病小型豬；以連續(xù)兩個月空腹血糖值大于6.3 mmol/L，或只有一次空腹血糖值大于6.3 mmol/L，且靜脈葡萄糖耐量試驗(IVGTT)60 min血糖值大于6.3 mmol/L為2型糖尿病的判斷標準[5, 6]。在建模結束后，采集小型豬第6、7肋骨之間的骨骼肌(背最長肌)樣品，裝入滅菌的凍存管中立即置于液氮中冷凍，而后迅速轉(zhuǎn)入-80℃冰箱備用。

1.2 RNA提取及RT-PCR

采用Trizol法提取廣西巴馬小型豬的骨骼肌總RNA，并以其為模板，用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒(TaKaRa，日本)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.3 線粒體基因組(mtDNA)的提取

線粒體基因組DNA參照TIANamp基因組DNA提取試劑盒(Tiangen，中國)從骨骼肌中提取。

1.4 引物設計與合成

根據(jù)NCBI上GenBank公布的普通豬的基因序列，設計并合成豬的相關基因QRT-PCR引物設計[7-10](表1)，溫度為60℃。所需引物由TAKARA大連寶生物公司和上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

表1 定量PCR引物

1.5 實時熒光定量PCR反應

采用SYBR Green I染料法，以18S rRNA為內(nèi)參基因，目的基因相對表達量采用2-△△Ct法計算目的基因相對定量結果，在Roche Light Cycler 480實時熒光定量PCR儀上進行PCR擴增和數(shù)據(jù)分析。

實時熒光定量PCR體系(20.0 μL)：SYBR Premix Ex Taq(Roche，美國)10.0 μL，Prime-F(10 μmol/L)0.5 μL，Prime-R(10 μmol/L)0.5 μL，模板5.0 μL，ddH2O 補足至20.0 μL。反應程序：95℃預變性5 min；95℃ 10 s、60℃ 10 s、72℃ 20 s，進行40個循環(huán)。

2 結果與分析

2.1 廣西巴馬小型豬T2DM模型糖代謝相關血清生化指標測定

對比分析T2DM豬與非T2DM豬糖代謝相關指標，結果如表2所示[5]。比較發(fā)現(xiàn)，T2DM組的空腹血糖高于非T2DM組，差異有顯著性(P<0.05)，胰島素水平和胰島素敏感指數(shù)(ISI)差異無顯著性(P>0.05)。

表2 兩組小型豬糖代謝相關指標對比±s，n=3)

注：同列數(shù)值標“*”代表組內(nèi)差異有顯著性(P<0.05)。

Note. The mark “*” in the same column indicates a significant difference(P<0.05).

圖1 廣西巴馬小型豬2型糖尿病模型相關調(diào)控基因表達情況Fig.1 T2 DM-related gene expression in the two groups of minipigs

2.2 兩組小型豬骨骼肌IR關鍵調(diào)控基因表達差異

T2DM組和非T2DM組骨骼肌IR關鍵調(diào)控基因表達差異結果如圖1所示。結果顯示，在巴馬小型豬骨骼肌中，T2DM組PGC-1α、Glut-4、ERRα及NRF-1的mRNA相對表達量均高于非T2DM組，差異有顯著性(P<0.05)，而TFAM相對表達量與非T2DM組差異無顯著性(P>0.05)。在mtDNA基因數(shù)量的結果比較中發(fā)現(xiàn)， T2DM組12SrRNA以及16S rRNA的數(shù)量均低于非T2DM組，差異有顯著性(P<0.05)。

2.3 關鍵調(diào)控基因表達差異與血清生化指標相關性分析

關鍵調(diào)控基因表達差異與血清生化指標相關性分析結果如表3所示。結果顯示，血糖水平與PGC-1α、Glut-4和NRF-1基因呈正相關關系，差異有顯著性(P<0.05)，與12SrRNA和16SrRNA基因呈負相關關系，差異有顯著性(P<0.05)；胰島素水平和ISI指數(shù)均與PGC-1α、Glut-4和NRF-1基因呈負相關關系，差異有顯著性(P<0.05)，與12SrRNA和16SrRNA基因呈正相關關系，差異有顯著性(P<0.05)；ERRα和TFAM基因與血糖、胰島素和ISI指數(shù)相關關系差異無顯著性(P>0.05)。

表3 關鍵調(diào)控基因表達差異與血清生化指標相關性分析

注：表中數(shù)值為相關系數(shù)(r)。

Note. Value in the table is the correlation coefficient (r).

3 討論

肌肉葡萄糖的轉(zhuǎn)運主要依賴于胰島素敏感的Glut-4在質(zhì)膜表面的聚集，Glut-4具有保持胰島素敏感性，維持血糖平衡的作用，與2型糖尿病有著密切的關系。PGC-1α能通過協(xié)同激活MEF2C高效誘導Glut-4基因的表達，進而提高肌細胞轉(zhuǎn)運葡萄糖的能力，降低血糖[11]。實驗動物模型骨骼肌內(nèi)PGC-1α的表達缺陷，能引起嚴重的胰島素抵抗[12-16]，從而導致T2DM的發(fā)生。雌激素受體相關受體α(ERRα)是PGC-1α的重要共轉(zhuǎn)錄因子，也是線粒體能量傳遞中脂肪酸氧化和氧化磷酸化的重要調(diào)節(jié)因子。PGC-1α通過輔激活ERRα基因，抑制葡萄糖的氧化，保持肌糖原儲備[17]。PGC-1α或PGC-1α-ERRα復合體通過結合核呼吸因子(NRFs)，調(diào)節(jié)線粒體氧化磷酸化作用(OXPHOS)，刺激線粒體DNA復制和轉(zhuǎn)錄所必需的線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(TFAM)的表達；TFAM表達上調(diào)可刺激ATP的合成[18]，介導線粒體的生物發(fā)生，促進線粒體合成和數(shù)量增加[19, 20]。

本研究發(fā)現(xiàn)，小型豬的血糖水平、胰島素水平和ISI等指標與所檢測的基因相關關系明顯，表明所檢測的基因與T2DM的發(fā)展有著一定重要的聯(lián)系。T2DM組骨骼肌中PGC-1α、Glut-4、ERRα及NRF-1的mRNA相對表達量均顯著高于非T2DM組，推測T2DM小型豬骨骼肌需要PGC-1α的過量表達，從而誘導大量Glut-4來轉(zhuǎn)運葡萄糖；高表達的PGC-1α又刺激下游基因ERRα和NRF-1的表達上調(diào)。而T2DM組mtDNA基因12SrRNA和16SrRNA的表達水平顯著低于非T2DM組，前者的線粒體數(shù)量明顯少于后者，能量代謝能力降低，對糖和脂肪酸的消化應用減少，過多的糖和脂肪酸沉積，引發(fā)骨骼肌胰島素抵抗發(fā)生，進而誘發(fā)T2DM。該結果與Mootha等[21]的研究結果相似，他們發(fā)現(xiàn)部分T2DM患者的骨骼肌中線粒體OXPHOS相關靶基因的表達水平低于正常人。Patti等[22]的研究亦證實，在糖尿病及IR患者PGC-1α和NRFs的mRNA表達水平顯著下調(diào)，并伴隨著線粒體的形態(tài)異常。而在小鼠肌肉中超表達PGC-1α基因，可以成倍地增加肌肉線粒體的數(shù)量，ATP合成能力提高近60%，并增加脂肪酸轉(zhuǎn)運相關基因的表達水平[23, 24]。

綜上所述，推測機體骨骼肌中PGC-1α、Glut-4、ERRα、NRF-1和TFAM等調(diào)節(jié)能量代謝的基因表達增加，可以促進骨骼肌糖含量下降；而線粒體數(shù)量減少，則引起能量代謝水平下降，導致骨骼肌糖代謝異常，引發(fā)胰島素抵抗，最終誘發(fā)T2DM。

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Expression of skeletal muscle glucose and energy metabolism-related genes in Guangxi Bama minipigs with type 2 diabetes mellitus

YAN Xue-yu， JIANG Qin-yang， WU Yan-jun， LIANG Jia-chong， GUO Ya-fen, LAN Gan-qiu*

(College of Animal Science and Technology, Guangxi University，Nanning 530004，China)

Objective In this study, the glucose and energy metabolism-related genes (PGC-1α,Glut-4,ERRα,NRF-1,TFAMand mtDNA gene) were detected in type 2 diabetes mellitus (T2DM) and non-T2DM minipigs, and the gene function was explored for T2DM pathogenesis. Methods The longissimus muscle of T2DM and non-T2DM Guangxi Bama mini-pigs was used as experiment material. The expression of glucose and energy metabolism-related genes was detected by QRT-PCR. Results The expressions ofPGC-1α,Glut-4,ERRαandNRF-1 genes were significantly higher than that of non-T2DM group, the expressions of TFAM and mtDNA gene were lower than that of non-T2DM group. Conclusions The upregulated expression ofPGC-1αgene and its downstream genesGlut-4,ERRα,NRF-1 may improve the glucose metabolic functions in skeletal muscle in the Bama minipigs, whereas insufficient mitochondrial synthesis may induce decreasing ATP synthesis, and results in skeletal muscle insulin resistance, finally leading to the T2DM occurrence.

Guangxi Bama minipig; Diabetes mellitus, type 2, T2DM; Skeletal muscle; Insulin resistance

LAN Gan-qiu. E-mail: ganqiulan@gxu.edu.cn

國家自然科學基金項目(81360135)；廣西自然科學基金項目(2013GXNSFAA019187)；國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系廣西生豬產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團隊項目(NYCYTXGXCXTD-03-15)。

嚴雪瑜(1988-)，女，博士，研究方向：動物遺傳育種與動物疾病模型研究。E-mail： yanxueyu1122@qq.com

蘭干球(1963-)，博士，教授，博士生導師，主要從事動物分子遺傳育種研究工作。E-mail： ganqiulan@gxu.edu.cn

研究報告

Q95-33

A

1005-4847(2016)05-0470-04

10.3969/j.issn.1005-4847.2016.05.006

2016-02-02