王麗娜,陳輝煌,劉樂冕,余 正,楊 軍,*

1 中國科學院城市環(huán)境研究所,城市環(huán)境與健康重點實驗室,水生態(tài)健康研究組, 廈門 361021 2 中國科學院大學, 北京 100049

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亞熱帶分層水庫固氮微生物時空分布格局

王麗娜1, 2,陳輝煌1,劉樂冕1,余 正1,楊 軍1,*

1 中國科學院城市環(huán)境研究所,城市環(huán)境與健康重點實驗室,水生態(tài)健康研究組, 廈門 361021 2 中國科學院大學, 北京 100049

生物固氮作用是水生態(tài)系統(tǒng)氮元素的重要來源途徑之一,通常通過固氮微生物實現(xiàn)。但是,目前人們對亞熱帶分層水庫固氮微生物多樣性、分布和豐度認識還非常有限。以廈門市汀溪水庫為例,基于固氮基因(nifH)綜合應(yīng)用克隆文庫、定量PCR、定量RT-PCR研究固氮微生物在不同季節(jié)和不同水層的時空分布格局與演替規(guī)律。結(jié)果表明,汀溪水庫具有豐富多樣的固氮微生物,包括藍藻、α-變形菌、β-變形菌、γ-變形菌、厚壁菌,以及少量未知的固氮細菌和序列；固氮微生物的群落組成、豐度、多樣性和活性均呈現(xiàn)顯著的時空差異。春、夏和秋3季表層和底層藍藻nifH基因序列所占比例均超過50%,其中表層高于底層；冬季表層和底層藍藻OTU數(shù)目比例超過50%。聚類分析表明,冬季表層和底層群落匯聚為一類；春、夏和秋三個季節(jié)表層首先聚為一類,然后與底層分別匯為一支。汀溪水庫熱分層時期的固氮微生物群落組成的空間差異大于季節(jié)差異,而且表層水體藍藻在所有固氮微生物中占據(jù)絕對優(yōu)勢地位。相關(guān)分析表明,固氮微生物RNA豐度和RNA/DNA分別與氨氮、水溫顯著負相關(guān)；固氮微生物DNA豐度與溶解氧、pH、葉綠素a顯著負相關(guān),與硝氮顯著正相關(guān)。綜上所述,亞熱帶水庫熱分層對固氮微生物的群落結(jié)構(gòu)具有顯著的影響,在水庫環(huán)境保護和生態(tài)管理中,特別是藍藻水華防控時,要充分考慮水體熱分層的生態(tài)效應(yīng)。

生物固氮；nifH基因；分層水庫；汀溪水庫；時空變異

在淡水生態(tài)系統(tǒng)中,生物固氮受到氮磷濃度與光照強度的影響[19],然而不同固氮微生物多樣性和活性的時空分布規(guī)律還不是很明確[13]。Short[20]等人在切薩皮克灣生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)兩種nifH基因型有著不同的季節(jié)和空間分布格局,暗示這些生物群落受到不同環(huán)境過程的影響。Moisander[9]等人研究切薩皮克灣水柱和沉積物固氮微生物組成的時空變化,發(fā)現(xiàn)多樣性最高的是nifHCluster 3,但是Cluster 1(α-,β-,γ-變形菌,藍藻)具有較高的豐度；底層水體固氮微生物群落具有較高的相似性,而表層水體群落變異較大；鹽度、溶解性無機氮、溶解性有機碳和溶解性有機磷等環(huán)境因子與固氮微生物群落組成有顯著的關(guān)系。Yu[12]等人研究東圳水庫中固氮微生物秋季垂直分布特征,發(fā)現(xiàn)溫躍層的出現(xiàn)使水溫與溶解氧發(fā)生明顯垂直變化,從而對固氮微生物群落組成造成了顯著影響。以上研究報道顯示,水生固氮微生物的垂直分布和時空動態(tài)過程的相關(guān)研究是最新發(fā)展趨勢和研究熱點。

我國亞熱帶深水水庫多屬于典型的暖單次混合型水庫,除冬季有短暫的混合期外,在一年當中會持續(xù)出現(xiàn)熱分層現(xiàn)象[21]。在這些水庫中,明顯的熱分層是春季、夏季與秋季的典型特征,在溫躍層上下水體中明顯差異的環(huán)境對于微生物群落的組成、多樣性及豐度可能有著顯著的影響[22]。顯然,亞熱帶分層水庫同樣非常適合研究固氮微生物垂直分布和季節(jié)動態(tài)變化規(guī)律。本研究以廈門汀溪水庫為例,綜合應(yīng)用克隆文庫、定量PCR、定量RT-PCR技術(shù)分析固氮微生物在4個季節(jié)不同水層的組成、多樣性、活性及豐度。本研究的目的是：1)揭示分層水庫固氮微生物群落的季節(jié)和空間分布格局；2)探討固氮微生物優(yōu)勢類群的特征與成因。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及理化分析

汀溪水庫(24°48′N,118°08′E)位于福建省廈門市,是一座典型的亞熱帶深水水庫。本研究選取汀溪水庫湖泊區(qū)的深水區(qū)設(shè)置站位進行采樣,此站位水深可達25 m。水體樣品采集周期為1a：2012年的7月(夏季),10月(秋季),以及2013年的1月(冬季),4月(春季)。每次采樣均采集5個水層的樣品,分別是：0、6、12、18、24 m(夏),0、10、15、20、25 m(秋),0、5、10、15、21 m(冬),0、5、10、15、20 m(春)。每份樣品均采集10 L水樣,水樣采集后立即送往實驗室進行過濾,采用孔徑為0.22 μm的濾膜(直徑47 mm,Millipore,美國)過濾1 L水樣,并保留4份重復樣品。將載有微生物的濾膜儲存在-80℃的冰箱,用于后續(xù)DNA和RNA的提取。

現(xiàn)場利用美國哈希HACH多參數(shù)水質(zhì)分析儀(Hydrolab DS5)監(jiān)測水溫、溶解氧、pH、葉綠素a等參數(shù),每隔1 m測定1次。水體營養(yǎng)鹽分析在實驗室進行,總氮、氨氮、硝態(tài)氮、總磷、正磷酸鹽均按照國家標準進行測定。

1.2 DNA和RNA提取

根據(jù)說明書,利用試劑盒Fast DNA spin kit(MP Biomedicals, 美國)和E.Z.N.A. total RNA kit(Omega Bio-Tek, 美國)分別提取固氮微生物DNA和RNA。提取的RNA立即反轉(zhuǎn)錄成cDNA,使用的是試劑盒OneStep RT-PCR kit Version 2.0(Takara,日本)。反轉(zhuǎn)錄程序是：37 ℃,15 min； 95 ℃,5 s。提純后的DNA和cDNA均置于冰箱-40 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR擴增及克隆文庫分析

本研究擴增nifH基因選擇的引物是nifH-F (5′-CGTAGGTTGCGACCCTAAGGCTGA-3′) 和nifH-R (5′-GCATACATCGCCATCATTTCACC-3′)[23]。PCR的擴增體系是50 μL,包含：5 μL 10 × PCR緩沖液(10 nmol/L),4 μL dNTPs(10 mmol/L),0.5 μLTaq聚合酶(5 U/μL),前后引物各1 μL(10 μmol/L),100 ng DNA模板,然后使用ddH2O補充到50 μL。PCR反應(yīng)體系如下：94 ℃預變性5 min,然后40個循環(huán)(94 ℃變性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸40 s),最終72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物利用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。利用膠回收試劑盒提純PCR產(chǎn)物,然后根據(jù)操作指南將其連接到pMD18-T載體(Takara, 日本)。將連接后的載體轉(zhuǎn)移到大腸桿菌DH5α(Takara, 日本)中,置于液體培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)過夜。利用添加氨芐的固體培養(yǎng)基進行藍白斑篩選,挑取白色克隆進行測序分析。本文選用四個季節(jié)的表層和底層樣品,共構(gòu)建8個克隆文庫,每個克隆文庫挑選70個克隆子進行測序。

1.4 定量PCR

定量PCR與克隆文庫所用的引物是相同的。利用Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System(ABI,美國)進行定量PCR,每個樣品設(shè)置3個重復[12]。本研究采用的是20 μL體系：0.5 μL前后引物(10 μmol/L),10 μL SYBR Premix Ex TaqTM,2 μL DNA 或cDNA模板和7 μL RNase-free water。本研究的標準曲線的R2值為0.994(DNA)和0.991(RNA),擴增效率分別是97.45%(DNA)和98.19%(RNA)。RNA/DNA比值可以作為反映固氮微生物基因表達活性的參數(shù),因此也進行了分析。

1.5 數(shù)據(jù)分析

克隆文庫的操作分類單元(Operational taxonomic unit,OTU)劃分采用97%的相似度,利用軟件MOTHUR v.1.33.0分析8個文庫的稀釋曲線,然后計算OTU個數(shù)、覆蓋率、Shannon-Wiener指數(shù)、Simpson倒數(shù)指數(shù)、Pielou均勻度指數(shù)、以及反映OTU豐富度的Chao1指數(shù)和 ACE指數(shù)[24]。將測序獲得的序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行比對,查找最相似序列并確定其分類歸屬,統(tǒng)計分析主要類群的OTUs比例和序列比例。利用PRIMER 6.0計算樣品間的Bray-Curtis相似系數(shù),進而對樣品進行聚類分析[25]。利用SPSS 19.0進行單因素方差方法,確定混合期及分層水體中不同水層之間水體理化及生物指標的差異是否顯著(P< 0.05),應(yīng)用Spearman相關(guān)分析確定DNA拷貝數(shù)、RNA拷貝數(shù)及RNA/DNA比值與環(huán)境因子之間的相關(guān)性是否顯著(P< 0.05)。

2 結(jié)果

2.1 水庫環(huán)境因子的時空變化

圖1 汀溪水1周年內(nèi)的水溫、溶解氧、pH和葉綠素a垂直變化Fig.1 Changes in water temperature, dissolved oxygen (DO), pH and chlorophyll a in the water column of the Tingxi Reservoir during one year水庫底層用灰色表示,黑色圓點表示固氮微生物采樣點

汀溪水庫是一座典型的亞熱帶分層水庫,在冬季呈現(xiàn)短時期的上下混合,在春季、夏季和秋季出現(xiàn)穩(wěn)定的熱分層(圖1)。本研究中,春季4月份、夏季7月份、秋季10月份水庫的溫躍層分別出現(xiàn)在3—14 m、18—22 m、21—24 m。冬季1月份處于上下混合的狀態(tài),水體物理化學參數(shù)從表層到底層無明顯差異。春季分層開始出現(xiàn)時,溫躍層跨度較大,為11 m。夏季和秋季的溫躍層厚度相對狹窄(厚3—4 m)。顯然,隨著熱分層狀態(tài)的變化,水體物理化學參數(shù)也呈現(xiàn)梯度變化,使得不同季節(jié)同一水層或同一季節(jié)不同水層的生境特征差異顯著(表1)。通常,分層時期的水溫、pH、溶解氧、葉綠素a在湖上層均顯著高于湖下層(P< 0.05)。營養(yǎng)鹽在不同水層差異也比較顯著,湖上層總氮、氨氮、總磷、正磷酸鹽均低于湖下層。

表1 汀溪水庫水體理化參數(shù)和固氮微生物群落特征

不同小寫字母表示顯著性差異(P<0.05),數(shù)據(jù)為平均值±標準誤

2.2 固氮微生物的豐度和活性

圖2 汀溪水庫4個季節(jié)不同水層的nifH DNA與RNA拷貝數(shù)及RNA/DNA比值Fig.2 Number of nifH DNA and RNA copies per liter and RNA/DNA ratio from different water depths and different seasons in the Tingxi Reservoir誤差線表示3個重復樣品的標準誤

固氮微生物的豐度和活性隨著季節(jié)和水層的變化發(fā)生明顯的變化(圖2)。冬季固氮微生物的nifHDNA豐度隨著深度的增加有一個緩慢上升的趨勢,在底層達到最大值4.52×107拷貝/L；春季固氮微生物nifHDNA豐度在溫躍層(5,10 m)要低于湖上層和湖下層,在湖下層15 m水深處為最大值4.95×107拷貝/L；夏季nifHDNA豐度在6—12 m急劇上升,在溫躍層開始點18 m達最高值7.66×107拷貝/L,24 m稍微下降,但并不明顯；秋季nifHDNA豐度隨著深度的增加而逐漸減少,水深20 m水層豐度最低,有趣的是nifHDNA豐度最大值位于秋季表層。固氮微生物nifHRNA水平變化趨勢與DNA存在一定的差異性,而且RNA豐度顯著低于DNA豐度,相差2個數(shù)量級。冬季水深10 m和15 m處的nifHRNA豐度要明顯高于其他水層；春季隨水深增加先降低后上升,在10 m處為最低值；夏季,隨著深度的增加呈現(xiàn)明顯上升的趨勢,在底層24 m達到最高值；秋季呈現(xiàn)總體下降的趨勢,在15—20 m急劇下降,與nifHDNA變化趨勢一致。RNA/DNA是一個能夠表征基因表達活性的指標,而4個季節(jié)表現(xiàn)出不同的垂直分布格局。例如,4個季節(jié)活性最高出現(xiàn)的位置不同：10 m(冬季)、20 m(春季)、24 m(夏季)、15 m(秋季)。方差分析顯示,nifHDNA和RNA在不同水層之間差異不顯著,而RNA/DNA在溫躍層顯著低于混合期水層(表1)。顯然,固氮微生物群落的DNA、RNA豐度變化趨勢呈現(xiàn)出一定差異性；基因表達活性的顯著特征是在春季和夏季的底層活性最高,而在秋季湖上層的活性顯著高于湖下層。據(jù)此推測,溫躍層的出現(xiàn)是造成湖上層與湖下層差異的主要原因。

2.3 固氮微生物的多樣性

圖3 汀溪水庫固氮微生物nifH基因克隆文庫稀釋曲線(OTUs在97%相似性水平劃分)Fig.3 Rarefaction curves of nifH gene sequences, which were grouped into OTUs based on 97% sequence similarity level

4個季節(jié)的表層和底層8個樣品克隆文庫共成功獲得451條序列,盡管稀釋曲線沒有平緩,在97%相似度水平共鑒定106個固氮微生物OTUs(圖3)。主要類群包括：藍藻(Cyanobacteria)46個OTUs、α-變形菌(Alphaproteobacteria)21個OTUs、β-變形菌(Betaproteobacteria)3個OTUs、γ-變形菌(Gammaproteobacteria)9個OTUs、厚壁菌(Firmicutes)1個OTU,以及其他未知的固氮細菌18個OTUs、未知序列8個OTUs(表S1)。其中98個OTUs的序列與GenBank中各種生態(tài)壞境中的固氮微生物序列相似,相似度水平范圍是80%—99%。然而,在50%相似性水平下,20條序列(8個OTUs)在數(shù)據(jù)庫中沒有找到相似的序列,因此屬于未知序列。8個克隆文庫中,冬季混合期水庫表層和底層OTUs數(shù)目并沒有差異,然而分層期水庫表層和底層顯示出明顯的差異。例如,春季和夏季底層OTUs數(shù)目高于表層,而秋季表層OTUs數(shù)目稍高于底層(表2)。在本研究測序范圍內(nèi),固氮微生物群落的多樣性指數(shù),包括Shannon-Wiener指數(shù)、Simpson倒數(shù)指數(shù)、Pielou均勻度指數(shù)均呈現(xiàn)一定時空變化,變化趨勢與OTUs相似(表2)。根據(jù)稀釋曲線計算的OTU豐富度指數(shù)Chao1 和 ACE 均表現(xiàn)出分層差異,冬、春、夏3個季節(jié)水庫底層大于表層,而秋季卻呈現(xiàn)為表層高于底層的特征(表2)。

2.4 固氮微生物的群落組成

除秋季底層藍藻OTUs的比例為16.67%外,在所有樣品中藍藻物種所占比例是最大的一類,OTUs占據(jù)38.89%—56.52%,序列占據(jù)34.21%—76.92%(圖4)。α-變形菌OTUs為8.33%—27.78%,其中秋季表層多樣性最高,序列豐度為2.33—10.29%；β-變形菌在冬季底層、春季表層、夏季表層,以及秋季表層和底層均沒有檢測到,而且OTUs和序列所占比例均小于5%；γ-變形菌在4個季節(jié)的表層與底層都被檢測到,OTUs為4.00%—18.75%,序列為2.70%—13.24%；厚壁菌僅僅在秋季表層被檢測到,OTUs為5.55%,序列為1.52%；未知固氮菌在4個季節(jié)中均被發(fā)現(xiàn),而且底層OTUs和序列數(shù)均高于表層；未知序列在夏季表層和秋季表層之外其他水層都有檢測到,而且底層均高于表層(圖4)。

表2 汀溪水庫4個季節(jié)表層與底層固氮微生物nifH基因的多樣性

Table 2 Diversity and predicted richness of thenifHgene sequences from both surface and bottom waters of the Tingxi Reservoir in four different seasons

季節(jié)Season水深/mDepth序列數(shù)SequencesnumberOTU0．03個數(shù)OTU0．03number覆蓋率/%Coverage香農(nóng)威納指數(shù)Shannon-WienerindexSimpson倒數(shù)指數(shù)SimpsoninverseindexPielou均勻度指數(shù)PielouevennessChao1指數(shù)Chao1indexACE指數(shù)ACEindex冬季W(wǎng)inter0442368．182．8718．50．633869冬季21372548．652．7612．80．6180491春季Spring0671291．041．573．030．441736春季20693368．122．9614．70．60108182夏季Summer0641685．941．945．000．502795夏季24613654．103．2221．30．6299445秋季Autumn0661787．882．196．670．552540秋季25431288．371．703．130．471416

圖4 汀溪水庫固氮微生物主要類群OTUs和序列所占比例Fig.4 Proportions of the main diazotroph groups detected in the Tingxi Researvor. The proportions are computed in terms of OTUs and sequences

聚類分析結(jié)果顯示,4個季節(jié)表層與底層的固氮微生物群落組成明顯不同(圖5)。冬季表層與底層的群落組成比較相似,差異相對較小。存在分層現(xiàn)象的春、夏、秋3個季節(jié),表層固氮微生物群落組成最相似；春、夏底層的群落組成較相似,秋季底層顯示出其獨特性。據(jù)此推測,水體分層對固氮微生物群落組成的影響比季節(jié)差異的影響更明顯。

圖5 汀溪水庫固氮微生物的聚類分析展示群落組成的時空分布格局Fig.5 Cluster dendrogram showing seasonal and spatial patterns of diazotrophic bacteria community from the Tingxi Reservoir based on clone library data

2.5 固氮微生物群落與環(huán)境因子的關(guān)系

汀溪水庫nifHDNA豐度與pH、溶解氧、葉綠素a顯著負相關(guān),與硝態(tài)氮顯著正相關(guān)；nifHRNA豐度則與氨氮存在極顯著的負相關(guān)關(guān)系；RNA/DNA與水溫顯著負相關(guān)(表3)。顯然,熱分層發(fā)生時溫躍層的出現(xiàn)及其導致的水體理化分層與固氮微生物群落組成、豐度和活性密切相關(guān)。

3 討論

3.1 固氮微生物群落的時空變化

汀溪水庫在水體分層期間(春、夏、秋),固氮微生物群落在上下水層空間上的差異要明顯高于季節(jié)上的差異。在冬季處于混合期,水體上下混合導致表層到底層物理化學因子比較接近,同樣表層與底層的固氮微生物群落組成也比較接近,然而nifHDNA和RNA在底層的豐度卻高于表層。利用nifH基因可以檢測到廣泛的自養(yǎng)和異養(yǎng)固氮微生物：藍藻、古菌、厚壁菌、螺旋菌、α-變形菌、β-變形菌、γ-變形菌和δ-變形菌[1]。本研究同樣檢測到藍藻、α-變形菌、β-變形菌、γ-變形菌、厚壁菌、未知固氮菌,還有少量不能確定歸屬的新序列。在所有的已知類群中,藍藻序列占據(jù)最優(yōu)勢的地位。水庫在春季開始出現(xiàn)分層,固氮微生物群落組成在表層和底層就呈現(xiàn)出明顯的差異,例如春季底層OTU數(shù)目,以及多樣性指數(shù)均明顯高于表層,而且表層沒有檢測到β-變形菌。夏季相較于春季而言溫躍層下降,有趣的是夏季底層檢測到的nifHDNA豐度、RNA豐度、RNA/DNA、OTU數(shù)目都明顯高于表層,說明底層固氮微生物豐度、活性、多樣性高于表層。秋季溫躍層位置繼續(xù)下降,表層OTU數(shù)目高于底層；而且表層nifHDNA豐度、RNA豐度、RNA/DNA明顯高于底層,呈現(xiàn)出與夏季相反的垂直分布格局。Moisander[9]等人發(fā)現(xiàn)在4月、10月切薩皮克灣的底層水體固氮微生物群落組成比較相似,而表層樣品變化更加明顯,這與本文的結(jié)果存在差異。汀溪水庫4月、7月和10月表層水體的固氮微生物組成更加相似,而底層樣品多樣性高,群落組成變化較大。有趣的是,在秋季表層檢測到厚壁菌(Firmicutes)。厚壁菌微生物一般大量出現(xiàn)在土壤環(huán)境[26],本文的檢測結(jié)果暗示具有固氮作用的厚壁菌也能生存在水體環(huán)境或者來源于庫區(qū)流域的土壤。由于在春夏表層沒有發(fā)現(xiàn)β-變形菌,在底層卻檢測到,因此認為具有固氮功能的β-變形菌在分層水庫中可能更加偏好底層的低溫、缺氧的環(huán)境。

表3 固氮微生物nifHDNA、RNA、RNA/DNA與環(huán)境因子之間的Spearman相關(guān)系數(shù)

Table 3 The Spearman correlation coefficients betweennifHDNA, RNA, RNA/DNA ratio, and environmental variables in the Tingxi Reservoir

相關(guān)性CorrelationDNARNARNA/DNA相關(guān)性CorrelationDNARNARNA/DNA水溫WatertemperatureNSNS-0．320?pH-0．433??NSNS溶解氧Dissolvedoxygen-0．316?NSNS葉綠素aChlorophylla-0．315?NSNS總氮TotalnitrogenNSNSNS氨氮NH4-NNS-0．362??NS硝態(tài)氮NOx-N0．382?NSNS總磷TotalphosphorusNSNSNS正磷酸鹽PO4-PNSNSNS

*P< 0.05; **P< 0.01; NS:不顯著 not significant

隨著大量相關(guān)研究的進行,固氮微生物的多樣性和復雜性逐步被人們所認知[1],但是影響水生態(tài)系統(tǒng)固氮微生物的分布及多樣性的因子還不是很清楚[20]。在貧營養(yǎng)海洋中,固氮微生物的豐度低于湖泊或者近海岸水體,但是多樣性卻更高[1]。固氮藍藻是湖泊和水庫中常見的水華種類[27],而且通常占據(jù)優(yōu)勢地位,如紐約喬治湖[28]。有趣的是,氮是莫諾湖的限制因子,盡管在垂直水柱中沒有檢測到固氮作用的發(fā)生,表層和底層水體卻發(fā)現(xiàn)多樣性很高且群落差異顯著的固氮微生物[1]。河口具有多樣的固氮微生物,如切薩皮克灣與紐斯河具有豐富的α-變形菌、β-變形菌、γ-變形菌[1, 29]。同樣,在河口沉積物和沼澤中,固氮微生物是非常多樣的,而且不論氮含量高低或者環(huán)境變化,總是會保持相對穩(wěn)定的狀態(tài)[30-31]。綜上所述,固氮微生物種類在水環(huán)境中具有廣泛的分布,包括微生物墊、湖泊、鹽沼、河口等多種生境,而在不同環(huán)境下存在著各自的分布特點[20]。本文的研究結(jié)果在一定程度和前人的結(jié)果一致,例如,藍藻是淡水生境優(yōu)勢類群；但也存在一定的特殊性,比如檢測到厚壁菌。值得注意的是,本研究中8個OTUs在GenBank上沒有找到比較接近的序列,暗示這些OTUs可能是新的未知序列,迫切需要后續(xù)的實驗分析確定其分類地位信息。此外,這些未知固氮菌和未知序列通常在4個季節(jié)底層的出現(xiàn)頻率高于表層,主要原因可能是過去對湖泊水庫的研究往往忽視底層水體,對于底層水體微生物的研究遠遠少于表層。

3.2 固氮藍藻占優(yōu)勢的原因

在汀溪水庫的8個克隆文庫中,固氮微生物的多樣性非常高,更重要的特征是藍藻占據(jù)絕對優(yōu)勢。湖泊水庫藍藻優(yōu)勢的存在有其物理、化學、生物因素等多重原因[32]。研究表明,水庫水體上下混合運動會影響物種間的相互作用,在小范圍內(nèi)存在水體運動的環(huán)境中,有競爭作用的物種也可以共同存在[33]。Zani[28]等人在喬治湖發(fā)現(xiàn)固氮藍藻與其他固氮菌共同存在,這與本文在同一樣品中檢測到多樣的固氮微生物是一致的,雖然有競爭作用,但是可以共同生存。通常,氧氣對固氮酶活性具有抑制作用,藍藻占據(jù)優(yōu)勢地位也與自身生理結(jié)構(gòu)有關(guān)[1]。例如藍藻有兩種固氮機制：空間上區(qū)分開光合作用和固氮作用；時間上錯開光合作用和固氮作用[34]。因此,藍藻在水體表層和底層都可以進行固氮作用,而且氧氣不會對其固氮作用造成不利影響。有研究報道,海洋藍藻束毛藻(eg.Trichodesmiumspp.)是熱帶貧營養(yǎng)鹽海域優(yōu)勢的固氮微生物[35],而具有異形胞的藍藻在淡水和半咸水環(huán)境中都可以成為占優(yōu)勢的類群[36]。具有異形胞的藍藻相對于非異形胞藍藻更加適合固氮作用[35],因為異形胞可以空間上分開光合作用與固氮作用,這樣不僅固氮效率更高,而且也有效避免了氧氣的抑制作用,因此可以解釋在氮磷比低的淡水湖泊和水庫中固氮藍藻容易形成水華[37-38]。變形菌門的固氮微生物多數(shù)是異養(yǎng)型固氮微生物,相對喜歡底層低氧或厭氧環(huán)境[39]。Toepel[40]等人研究了Cyanothecesp. ATCC 51142株在白天黑夜及持續(xù)性光照條件下固氮基因表達差異性,實驗證明其在白天會儲存糖原,連續(xù)光照能夠誘導晚上進行固氮作用。另一方面,水庫穩(wěn)定的分層現(xiàn)象也為藍藻提供了有利的條件,藍藻可以在分層水體上下自由移動,這是因為藍藻體內(nèi)有特殊的氣泡結(jié)構(gòu),可以通過自身調(diào)節(jié)提供浮力[41]。藍藻可以借助氣泡在水層中找到光、營養(yǎng)鹽等合適生境的水層,進行生長繁殖[42]。由此可以解釋,在亞熱帶深水水庫藍藻不論季節(jié)和空間上的變化都可以占據(jù)優(yōu)勢地位。

Langois[43]等人發(fā)現(xiàn)藍藻更偏好表層水體,這與我們研究結(jié)果一致,因為汀溪水庫4個季節(jié)表層藍藻的豐度比例和物種多樣性均高于底層。藍藻喜歡表層并不是一個因素決定的,可能是藍藻屬于自養(yǎng)光合生物,偏好較高水溫、更適宜光照的表層水體,或者是同其他生態(tài)因子的綜合效應(yīng)[27, 35]。Bentzon-Tilia[44]等人研究了兩個河口灣的固氮藍藻,發(fā)現(xiàn)兩個河口灣表層水體比海洋束毛藻(Trichodesmium)水華爆發(fā)期的固氮效率還要高。由此推測,水庫生態(tài)系統(tǒng)中藍藻在固氮作用中扮演著很重要的角色。Voss[45]等人發(fā)現(xiàn)隨著海水深度變化的總?cè)芙忤F與固氮作用是顯著相關(guān)的。這需要后續(xù)的野外控制實驗驗證水庫中微量元素溶解鐵與固氮過程的關(guān)系,進而可以更加深入的了解藍藻固氮的生態(tài)過程與機制。另外一種原因,可能是藍藻體內(nèi)有氣泡、具有很強的漂浮能力,也更有利于在表層占據(jù)優(yōu)勢地位[41-43]。本文研究結(jié)果提示,在亞熱帶深水水庫全年具有藍藻水華爆發(fā)的條件和可能,因此在藍藻水華預防和控制時要充分考慮水體分層的變化規(guī)律。

4 結(jié)論

本研究鑒定固氮微生物OTUs超過100個,表明汀溪水庫中具有多樣性很高的固氮微生物,主要類群包括藍藻、α-變形菌、β-變形菌、γ-變形菌、厚壁菌,以及少量未知的固氮細菌和序列。固氮微生物的豐度、活性、多樣性及群落組成具有明顯的季節(jié)和垂直分布格局,在春夏秋水庫熱分層時期,群落組成在水體表層和底層的空間變化明顯大于時間變化,暗示熱分層對固氮微生物群落具有更為顯著的影響。春夏秋冬4個季節(jié)里,藍藻在水庫中始終占據(jù)最優(yōu)勢地位,特別是在水庫分層時期(春、夏、秋),藍藻的優(yōu)勢更加突出。高溫和熱分層環(huán)境,以及藍藻的獨特生理結(jié)構(gòu)有利于表層水體固氮藍藻占優(yōu)勢。有趣的是,汀溪水庫夏季和秋季固氮微生物豐度和活性呈現(xiàn)相反的垂直變化趨勢。在后續(xù)研究中,有必要更加深入系統(tǒng)研究并揭示熱分層條件下固氮微生物群落變化的生態(tài)機制,進而為預防和控制藍藻水華發(fā)生提供對策。

[1] Zehr J P, Jenkins B D, Short S M, Steward G F. Nitrogenase gene diversity and microbial community structure: a cross-system comparison. Environmental Microbiology, 2003, 5(7): 539-554.

[2] Zehr J P, Paerl H W. Molecular ecological aspects of nitrogen fixation in the marine environment // Kirchman D L, ed. Microbial Ecology of the Oceans, Second Edition. New York: John Wiley & Sons, Inc., 2008: 481-525.

[3] Gaby J C, Buckley D H. A comprehensive evaluation of PCR primers to amplify thenifHgene of nitrogenase. PLoS One, 2012, 7(7): e42149.

[4] DeLong E F, Preston C M, Mincer T, Rich V, Hallam S J, Frigaard N-U, Martinez A, Sullivan M B, Edwards R, Brito B R, Chisholm S W, Karl D M. Community genomics among stratified microbial assemblages in the ocean′s interior. Science, 2006, 311(5760): 496-503.

[5] Short S M, Zehr J P. Nitrogenase gene expression in the Chesapeake Bay Estuary. Environmental Microbiology, 2007, 9(6): 1591-1596.

[6] Farnelid H, ?berg T, Riemann L. Identity and dynamics of putative N2-fixing picoplankton in the Baltic Sea proper suggest complex patterns of regulation. Environmental Microbiology Reports, 2009, 1(2): 145-154.

[7] Young J P W. Phylogenetic classification of nitrogen-fixing organisms // Stacey G, Evans H J, Burris R H, eds. Biological Nitrogen Fixation. New York, USA: Chapman and Hall, 1992: 43-86.

[8] Gaby J C, Buckley D H. A global census of nitrogenase diversity. Environmental Microbiology, 2011, 13(7): 1790-1799.

[9] Moisander P H, Morrison A E, Ward B B, Jenkins, B D, Zehr J P. Spatial-temporal variability in diazotroph assemblages in Chesapeake Bay using an oligonucleotidenifHmicroarray. Environmental Microbiology, 2007, 9(7): 1823-1835.

[10] Church M J, Bj?rkman K M, Karl D M, Saito M A, Zehr J P. Regional distributions of nitrogen-fixing bacteria in the Pacific Ocean. Limnology and Oceanography, 2008, 53(1): 63-77.

[11] Langlois R J, Hümmer D, LaRoche J. Abundances and distributions of the dominantnifHphylotypes in the Northern Atlantic Ocean. Applied and Environmental Microbiology, 2008, 74(6): 1922-1931.

[12] Yu Z, Zhou J, Yang J, Yu X Q, Liu L M. Vertical distribution of diazotrophic bacterial community associated with temperature and oxygen gradients in a subtropical reservoir. Hydrobiologia, 2014, 741(1): 69-77.

[13] Zehr J P, Church M J, Moisander P H. Diversity, distribution and biogeochemical significance of nitrogen-fixing microorganisms in anoxic and suboxic ocean environments // Neretin L N, ed. Past and Present Water Column Anoxia. Netherlands: Springer, 2006: 337-369.

[14] Mahaffey C, Michaels A F, Capone D G. The conundrum of marine N2fixation. American Journal of Science, 2005, 305(6-8): 546-595.

[15] Dang H Y, Yang J Y, Li J, Luan X W, Zhang Y B, Gu G Z, Xue R R, Zong M Y, Klotz M G. Environment-dependent distribution of the sedimentnifH-harboring microbiota in the northern South China Sea. Applied and Environmental Microbiology, 2013, 79(1): 121-132.

[16] Farnelid H, Bentzon-Tilia M, Andersson A F, Bertisson S, Jost G, Labrenz M, Jürgens K, Riemann L. Active nitrogen-fixing heterotrophic bacteria at and below the chemocline of the central Baltic Sea. The ISME Journal, 2013, 7(7): 1413-1423.

[17] 陳因, 方大惟. 藍藻Anabaena7120固氮的光調(diào)節(jié). 植物生理學報, 1983, 9(1): 51-59.

[18] Howarth R W, Marino R, Cole J J. Nitrogen fixation in freshwater, estuarine, and marine ecosystems. 2. Biogeochemical controls. Limnology and Oceanography, 1988, 33: 688-701.

[19] Havens K E, James R T, East T L, Smith V H. N∶P ratios, light limitation, and cyanobacterial dominance in a subtropical lake impacted by non-point source nutrient pollution. Environmental Pollution, 2003, 122(3): 379-390.

[20] Short S M, Jenkins B D, Zehr J P. Spatial and temporal distribution of two diazotrophic bacteria in the Chesapeake Bay. Applied and Environmental Microbiology, 2004, 70(4): 2186-2192.

[21] Wang S, Qian X, Han B P, Wang Q H, Ding Z F. Physical limnology of a typical subtropical reservoir in south China. Lake and Reservoir Management, 2011, 27(2): 149-161.

[22] Yu Z, Yang J, Zhou J, Yu X Q, Liu L M, Lv H. Water stratification affects the microeukaryotic community in a subtropical deep reservoir. Journal of Eukaryotic Microbiology, 2014, 61(2): 126-133.

[23] Olson J B, Steppe T F, Litaker R W, Paerl H W. N2-fixing microbial consortia associated with the ice cover of Lake Bonney, Antarctica. Microbial Ecology, 1998, 36(3-4): 231-238.

[24] Schloss P D, Westcott S L, Ryabin T, Hall J R, Hartmann M, Hollister E B, Lesniewski R A, Oakley B B, Parks D H, Robinson C J, Sahl J W, Stres B, Thallinger G G, Van Horn D J, Weber C F. Introducing mothur: open-source, platform-independent, community-supported software for describing and comparing microbial communities. Applied and Environmental Microbiology, 2009, 75(23): 7537-7541.

[25] Clarke K R, Gorley R N. PRIMER v6: User Manual/Tutorial. Plymouth: PRIMER-E, 2006.

[26] Kizilova A K, Titova L V, Kravchenko I K, Iutinskaya G A. Evaluation of the diversity of nitrogen-fixing bacteria in soybean rhizosphere bynifHgene analysis. Microbiology, 2012, 81(5): 621-629.

[27] Paerl H W. Nuisance phytoplankton blooms in coastal, estuarine, and inland waters. Limnology and Oceanography, 1988, 33(4part2): 823-843.

[28] Zani S, Mellon M T, Collier J L, Zehr J P. Expression ofnifHgenes in natural microbial assemblages in Lake George, New York, detected by reverse transcriptase PCR. Applied and Environmental Microbiology, 2000, 66(7): 3119-3124.

[29] Affourtit J, Zehr J P, Paerl H W. Distribution of nitrogen-fixing microorganisms along the Neuse River Estuary, North Carolina. Microbial Ecology, 2001, 41(2): 114-123.

[30] Piceno Y M, Lovell C R. Stability in natural bacterial communities: Ⅰ. Nutrient addition effects on rhizosphere diazotroph assemblage composition. Microbial Ecology, 2000, 39(1): 32-40.

[31] Bagwell C E, Lovell C R. Persistence of selectedSpartinaalterniflorarhizoplane diazotrophs exposed to natural and manipulated environmental variability. Applied and Environmental Microbiology, 2000, 66(11): 4625-4633.

[32] Shade A, Jones S E, McMahon K D. The influence of habitat heterogeneity on freshwater bacterial community composition and dynamics. Environmental Microbiology, 2008, 10(4): 1057-1067.

[33] Kerr B, Riley M A, Feldman M W, Bohannan B J. Local dispersal promotes biodiversity in a real-life game of rock-paper-scissors. Nature, 2002, 418(6894): 171-174.

[34] Kumar K, Mella-Herrera R A, Golden J W. Cyanobacterial heterocysts. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology, 2010, 2(4): a000315.

[35] Karl D, Michaels A, Bergman B, Capone D, Carpenter E, Letelier R, Lipschultz F, Paerl H, Sigman D, Stal L. Dinitrogen fixation in the world′s oceans. Biogeochemistry, 2002, 57/58(1): 47-98.

[36] Laamanen M J. Environmental factors affecting the occurrence of different morphological forms of cyanoprokaryotes in the northern Baltic Sea. Journal of Plankton Research, 1997, 19(10): 1385-1403.

[37] Walsby A E. The permeability of heterocysts to the gases nitrogen and oxygen. Proceedings of the Royal society of London. Series B. Biological Sciences, 1985, 226(1244): 345-366.

[38] Staal M, Meysman F J R, Stal L J. Temperature excludes N2-fixing heterocystous cyanobacteria in the tropical oceans. Nature, 2003, 425(6957): 504-507.

[39] Jayakumar A, Al-Rshaidat M M D, Ward B B, Mulholland M R. Diversity, distribution, and expression of diazotrophnifHgenes in oxygen-deficient waters of the Arabian Sea. FEMS Microbiology Ecology, 2012, 82(3): 597-606.

[40] Toepel J, Welsh E, Summerfield T C, Pakrasi H, Sherman L A. Differential transcriptional analysis of the cyanobacteriumCyanothecesp. strain ATCC 51142 during light-dark and continuous-light growth. Journal of Bacteriology, 2008, 190(11): 3904-3913.

[41] Walsby A E, Hayes P K, Boje R, Stal L J. The selective advantage of buoyancy provided by gas vesicles for planktonic cyanobacteria in the Baltic Sea. New Phytologist, 1997, 136(3): 407-417.

[42] Walsby A E. Mechanisms of buoyancy regulation by planktonic cyanobacteria with gas vesicles // Fay P, Van Baalen C, eds. The Cyanobacteria. Amsterdam: Elsevier Science Publishers, 1987: 377-414.

[43] Langlois R J, LaRoche J, Raab P A. Diazotrophic diversity and distribution in the tropical and subtropical Atlantic Ocean. Applied and Environmental Microbiology, 2005, 71(12): 7910-7919.

[44] Bentzon-Tilia M, Traving S J, Mantikci M, Knudsen-Leerbeck H, Hansen J L S, Markager S, Riemann L. Significant N2fixation by heterotrophs, photoheterotrophs and heterocystous cyanobacteria in two temperate estuaries. The ISME Journal, 2015, 9(2): 273-285.

[45] Voss M, Croot P, Lochte K, Mills M, Peeken I. Patterns of nitrogen fixation along 10° N in the tropical Atlantic. Geophysical Research Letters, 2004, 31(23): L23S09.

Spatiotemporal patterns of diazotrophic microorganisms in a subtropical stratified reservoir

WANG Lina1,2, CHEN Huihuang1, LIU Lemian1, YU Zheng1, YANG Jun1,*

1 Aquatic EcoHealth Group, Key Laboratory of Urban Environment and Health, Institute of Urban Environment, Chinese Academy of Sciences, Xiamen 361021, China 2UniversityofChineseAcademyofSciences,Beijing100049,China

Biological nitrogen fixation, which is mediated by nitrogen-fixing microorganisms (diazotrophs), is an important source of fixed nitrogen in aquatic ecosystems. Recent advances in molecular biology techniques are leading to progress in the elucidation of the diazotrophic community possessing thenifHnitrogenase gene in various ecosystems. So far, the majority of studies of diazotrophic communities are based on marine samples, with freshwater habitats remaining largely unexplored. The aims of this study are to characterize the spatiotemporal patterns of a diazotrophic microbial community in a subtropical stratified reservoir (Tingxi Reservoir, southeast China), and to examine the relationships between the diazotrophic community structure and environmental variables. In this study, samples from the water column (five layers) were collected in July and October 2012, and in January and April 2013. Nitrogen-fixing microorganisms were studied using quantitative real-time PCR and clone library techniques. In Tingxi Reservoir, the water column was well mixed in winter, whereas there was clear and stable stratification in spring, summer, and autumn. Our results indicated that there were distinct spatial and seasonal patterns of abundance, activity, composition, and diversity in the diazotrophic community that was linked to water stratification in the Tingxi Reservoir. In total, 106 OTUs belonging to seven groups (i.e., 46 Cyanobacteria, 21 α-Proteobacteria, 3 β-Proteobacteria, 9 γ-Proteobacteria, 1 Firmicutes, 18 unidentified nitrogen-fixing bacteria, and 8 unknown taxa) were observed, the most diverse and dominant group of which was cyanobacteria. Both α-and γ-proteobacteria were much more common than β-proteobacteria in the reservoir.The deeper waters harbored a high percentage of unidentified bacteria and unknown taxa. The number of sequences similar to cyanobacteria in the surface water was higher than in the bottom water in spring, summer, and autumn. The Cyanobacteria OTUs number contributed more than 50% of the total OTUs in both surface and bottom waters in winter. Firmicutes were only detected in the surface water sample in October. Interestingly, our cluster analysis indicated that surface water diazotrophic communities in spring, summer, and autumn (with a stable stratification) first formed a group, then clustered with the bottom communities. However, both surface and bottom diazotrophic communities exhibited a relatively high similarity in winter due to water mixing. The pH, dissolved oxygen, and chlorophyllashowed a significant negative relationship with the DNA copy number, whereas the NOx-N showed a strong positive correlation with the DNA copy number. Water temperature and NH4-N had a negative significant relationship with RNA/DNA ratio and RNA copy number, respectively. It appeared that nitrogen-fixing bacteria showed distinctly nonrandom spatial and seasonal distributions in the Tingxi Reservoir, and their communities were either complexly structured by the thermal stratification or adapted to different environmental niches. Therefore, a stratification-based management strategy should be considered when developing methods for protecting drinking water quality and for controlling the cyanobacterial blooms.

nitrogen fixing;nifHgene; stratified reservoir; Tingxi Reservoir; spatiotemporal variation

國家自然科學基金項目(31370471, 31172114)；福建省杰出青年科學基金項目(2012J06009)

2015-04-25;

日期:2016-01-05

10.5846/stxb201504250854

*通訊作者Corresponding author.E-mail: jyang@iue.ac.cn

王麗娜,陳輝煌,劉樂冕,余正,楊軍.亞熱帶分層水庫固氮微生物時空分布格局.生態(tài)學報,2016,36(18):5827-5837.

Wang L N, Chen H H, Liu L M, Yu Z, Yang J.Spatiotemporal patterns of diazotrophic microorganisms in a subtropical stratified reservoir.Acta Ecologica Sinica,2016,36(18):5827-5837.