張永敢, 趙 娟, 張玉潔, 吳 婷, 吳孝兵, 鄭 艷

1 安徽師范大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院, 蕪湖 241000 2 安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 蕪湖 241000

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藥用植物鳳丹(Paeoniasuffruticosa)根際土壤細(xì)菌群落16S rRNA基因的ARDRA分析

張永敢1, 趙 娟1, 張玉潔1, 吳 婷1, 吳孝兵2, 鄭 艷2,*

1 安徽師范大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院, 蕪湖 241000 2 安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 蕪湖 241000

鳳丹(PaeoniasuffruticosaAndr.)為芍藥科多年生植物，是一種重要的傳統(tǒng)中藥資源。在其生長發(fā)育的周期中與土壤微生物尤其是根際土壤微生物有密切的關(guān)系。通過構(gòu)建 16S rRNA 基因克隆文庫及文庫的限制性片段長度多態(tài)性分析(ARDRA)，對中國藥用植物鳳丹 5 大主要分布區(qū)域的根際土壤細(xì)菌群落多樣性進(jìn)行了研究。采用限制性內(nèi)切酶HinfI 和Csp6I 對克隆文庫中隨機(jī)挑選的 1000 個白色克隆子進(jìn)行了酶切分型，根據(jù)酶切圖譜的不同，將其分為 324 個 OTUs，并對 38 個優(yōu)勢 OTUs 進(jìn)行了測序和系統(tǒng)發(fā)育分析。16S rRNA 基因序列分析結(jié)果表明，鳳丹根際土壤細(xì)菌種群主要包括：變形菌門(包括alpha、beta、gamma、detla 亞門)、酸桿菌門、放線菌門、擬桿菌門及厚壁菌門等 11 類細(xì)菌，此外還包含了 3 個未歸類的細(xì)菌。變形菌門和酸桿菌門為文庫中的主要菌群，分別占克隆總數(shù)的 47.34% 和 14.36%，其中Pseudomonassp.、Burkholderiasp. 和Arthrobactersp. 為優(yōu)勢菌屬。研究結(jié)果表明, 我國藥用植物鳳丹 5 大主要分布區(qū)域的根際土壤細(xì)菌種群不僅具有豐富的多樣性, 還存在豐富的潛在新菌種。

鳳丹；根際土壤；細(xì)菌；多樣性；ARDRA

鳳丹(PaeoniasuffruticosaAndr.)又稱銅陵牡丹，為芍藥科多年生藥用植物，是世界上著名的花卉之一，素有“國色天香”之美譽(yù)，在中國已有上千年的栽種歷史。其根皮可供藥用，俗稱丹皮，是一種貴重的中藥材。我國藥用植物鳳丹主要分布在河南洛陽，山東菏澤，安徽的亳州、銅陵和南陵，但地道藥材鳳丹則主產(chǎn)于安徽銅陵和南陵一帶。丹皮雖然年產(chǎn)量較高，但是地道藥材丹皮所占的比重卻較少，近年來市場上對高質(zhì)量丹皮的需求不斷增加[1]，而影響丹皮質(zhì)量的因素卻非常之多。目前，對鳳丹的研究主要集中在品種[2]、化學(xué)成分與藥理藥效[3-4]、生理生化[5-6]、病蟲害防治[7]及丹皮的儲存加工[8]等方面，而對鳳丹根際土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)和豐富度的研究相對缺乏，如康業(yè)斌等[9]利用HPLC法和涂布平板法研究了鳳丹和洛陽紅根際微生物及其與根皮中丹皮酚含量的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，洛陽紅根際土壤中微生物數(shù)量明顯高于鳳丹，但其根皮中丹皮酚含量卻低于鳳丹；Han等[10]利用傳統(tǒng)純培養(yǎng)的方法研究了牡丹(Paeoniaostii)根部土壤微生物的多樣性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同牡丹品系(藍(lán)芙蓉、鳳丹)的根部細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有明顯的差異性；Xue和Huang[11]利用了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳法(polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis, PCR-DGGE)研究了牡丹根部土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及其與牡丹品系和種植年限的變化關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，牡丹品系和種植年限均會影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)并且后者高于前者。

土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，其在物質(zhì)循環(huán)、能量流動及有機(jī)質(zhì)分解等方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[12]。土壤中存在大量的根際促生菌(PGPR)和部分有害細(xì)菌(DRB)及植物病原菌。 PGPR定殖于植物根際土壤中，通過產(chǎn)生植物激素[13]、提高營養(yǎng)成分[14]、抑制DRB和植物病原菌[15-16]等來促進(jìn)植物的生長發(fā)育；與之相反，土壤中的DRB和植物病原菌通過侵染植物維管組織、產(chǎn)生微生物毒素及與其他微生物間相互作用[17]，影響植物的健康生長。所以，研究根際土壤微生物的群落多樣性及其群落結(jié)構(gòu)在植物的生長和健康等方面是至關(guān)重要的[18]。

擴(kuò)增核糖體DNA限制性內(nèi)切酶分析法(amplified ribosomal DNA restriction analysis, ARDRA)是基于特異限制性內(nèi)切酶對一定長度的DNA片段進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離和檢測，從而分析環(huán)境微生物的多樣性。由于該技術(shù)不受菌株能否純培養(yǎng)的限制，不受宿主的干擾，具有特異性強(qiáng)、效率高、試驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定、可重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)[19]，已被廣泛地用于環(huán)境微生物多樣性和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的研究。本研究采用PCR技術(shù)，從鳳丹(P.suffruticosa)根際土壤微生物的總DNA中選擇性地擴(kuò)增細(xì)菌群落的16S rRNA基因片斷，在此基礎(chǔ)上構(gòu)建細(xì)菌的16S rRNA基因克隆文庫，然后利用ARDRA法對其進(jìn)行分析，從而建立鳳丹栽培土壤微生物種群遺傳多樣性ARDRA研究體系，揭示其根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性特征，為研究藥材的地道性與土壤微生物之間的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品的采集和理化分析

于2012年4月在安徽銅陵(FH)、蕪湖(YS)、亳州(BZ)、山東菏澤(HZ)和河南洛陽(LY)采集3年生鳳丹的根際土壤樣品(圖1和表1)。在株齡為3a的鳳丹栽植區(qū)內(nèi)隨機(jī)選取3株鳳丹，除去表層土壤，挖掘出帶根整體植株，把附著在根系上的土壤抖落下來，作為根際土，每株鳳丹根際土壤取樣量大體一致，將采集的土壤裝入滅菌的封口聚乙烯袋中，帶回實(shí)驗(yàn)室于-20℃保存?zhèn)溆?。使用全球定位系統(tǒng)(GPS)測定了采樣點(diǎn)的經(jīng)緯度；利用pH計(jì)測量土壤樣品的pH值(土壤∶水=1∶2.5)；土壤總磷(TP)和總鉀(TK)經(jīng)過酸消解[HNO3(65%)∶ HF (40%) =9∶4, 體積分?jǐn)?shù)]后，使用ICP-OES (optic emission spectroscopy with inductively coupled plasma)進(jìn)行測定[20]；土壤總銅(TCu)和總鋅(TZn)經(jīng)過酸消解(HNO3∶HClO4= 4∶1, 體積分?jǐn)?shù))后，使用原子吸收分光光度法測定[21]；其他參數(shù)為土壤總有機(jī)碳(TOC)(重鉻酸鉀氧化法)[22]和土壤總氮(TN)(凱氏定氮法)[23]。

圖1 藥用植物鳳丹(Paeonia suffruticosa)根際土壤樣品采集點(diǎn)地圖Fig.1 The map of sampling sites of rhizosphere soil from medicinal tree peony (Paeonia suffruticosa) of variety (Fengdan)采樣點(diǎn)HZ、LY、BZ、FH、YS，分別表示采自于菏澤、洛陽、亳州、銅陵、蕪湖牡丹園內(nèi)3年生鳳丹種植區(qū)

1.2 土壤微生物基因組DNA的提取及16S rRNA基因擴(kuò)增

將每個采樣點(diǎn)的3份平行土壤樣品均勻混合后，采用試劑盒FastDNA?SPIN Kit for Soil(MP Biomedicals, CA, USA)，根據(jù)生產(chǎn)商提供的方法提取土壤微生物基因組DNA，提取的結(jié)果用經(jīng)EB(ethidium bromide)染色的1%(w/v)的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。

使用基因擴(kuò)增儀PTC- 200(MJ Research Inc, Watertown, MA, USA)，以細(xì)菌引物F27 [5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG- 3′E.colibases 8- 27]和R1487 [5′-ACGGTTACCTTGTTACGACTT- 3′E.colibases 1487—1507][24]擴(kuò)增土壤細(xì)菌16S rRNA 基因。PCR的反應(yīng)體系為30μL，包括10mmol/L的Tris-HCl (pH 8.3)，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2，0.25mmol/L dNTP，1U Taq酶(TaKaRa Biotechnology)，1μg BSA(bovine serum albumin)，50ng DNA 模版和引物各10μmol/L。PCR的反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性10min，94℃變性45s，50℃退火1s，72℃延伸1min，30個循環(huán)，最后72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物用含有EB的1% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3 16S rRNA基因文庫構(gòu)建

采用DNA凝膠純化試劑盒[AxyPrepTMPCR Cleanup Kit (AXYGEN Biotechnology (Hangzhou) Limited, Hangzhou, China)]純化擴(kuò)增后的產(chǎn)物，之后將純化產(chǎn)物通過連接試劑盒(TaKaRa, Dalian, China)連接到載體上，再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌(DH5α)的感受態(tài)細(xì)胞中，均勻涂布到含有氨芐青霉素(100μg/mL)、X-gal(5-bromo- 4-chloro- 3-indolyl β-D-galactopyranoside)(40μg/mL)和IPTG(isopropyl β-D-thiogalactopyranoside)(24μg/mL)的LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基上。每個土壤樣品隨機(jī)挑選了200個白色克隆子，并使用pMD18-T easy vector通用引物M13(- 47)[5′-AGGGTTTTCCCAGTCACG- 3′] 和M13(- 48)[5′-GAGCGGATAACAATTTCA CAC- 3′] 擴(kuò)增外源插入片斷，將插入片斷的克隆子進(jìn)行ARDRA分析。

1.4 ARDRA分析

以限制性內(nèi)切酶HinfI 和Csp6I(Fermentas, AM)酶切上述從各個克隆子擴(kuò)增出來的16S rRNA基因片斷。雙酶切的反應(yīng)體系為：2μL 1×TangoTM酶切反應(yīng)緩沖液，限制性內(nèi)切酶HinfI 和Csp6I各1μL(10U)，10μL(約 0.5μg DNA)PCR產(chǎn)物，最后加滅菌水至30μL，37℃過夜消化，最后經(jīng) 65℃ 水浴20min，終止酶切反應(yīng)。酶切產(chǎn)物用經(jīng)EB染色的2%(w/v)瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到的酶切譜型圖，利用軟件GelComparv. 3.0 (Applied Math, Kortrijk, Belgium)進(jìn)行分析，小于100bp的片段比較模糊，在本研究中不計(jì)數(shù)。

1.5 部分克隆子的16S rRNA基因測序

根據(jù)ARDRA譜型分析，將克隆文庫中的優(yōu)勢酶切譜型(>3個克隆子)挑選一個克隆子送交上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。

1.6 數(shù)據(jù)分析

以稀疏曲線(http://www.uga.edu/strata/software/anRareReadme.html)和Coverage C[25]評價所構(gòu)建的克隆文庫的庫容；采用Shannon-Wiener多樣性指數(shù)(H′)和均勻度指數(shù)(EH)[11]及Chao1指數(shù)[26]進(jìn)行多樣性分析；16S rRNA基因序列經(jīng)軟件ContigExpress (version, June 20, 2000) 拼接，用Mallard[27]進(jìn)行嵌合體檢查，剩下的序列利用RDP II(http://rdp.cme.msu.edu/classifier/classifie)和NCBI BLASTN(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)分析后，用軟件Clustal X (1.81) 和MEGA 5.0 (Molecular Evolutionary Genetics Analysis, MEGA) 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(Neighbor-joining tree)。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤理化性質(zhì)

5個采樣點(diǎn)鳳丹根際土壤的理化性質(zhì)見表1。所測的土壤pH值范圍為6.04—6.62，趨于中性。TOC和TN在YS最高，其次是HZ、LY、BZ，F(xiàn)H最低，TP在BZ最高(0.978g/kg)，F(xiàn)H最低(0.536g/kg)，TK、TZn和TCu的濃度范圍分別為：17.499—19.669g/kg、0.077—0.139g/kg和0.015—0.029g/kg。

表1 采樣點(diǎn)地理位置、經(jīng)緯度和樣品理化性質(zhì)

P<0.05水平下 LSD檢驗(yàn)，相同的字母代表差異不顯著的同一組

2.2 ARDRA分析

對從5個樣品中隨機(jī)挑選的1000個白色克隆子進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得其外源插入片斷，然后進(jìn)行雙酶切。酶切結(jié)果顯示，庫中的ARDRA譜型包含2—6個條帶，條帶大小范圍在100—1302bp(圖2)。用NTSYSpc 2.10e進(jìn)行聚類分析，將具有相同ARDRA譜型的克隆子歸為同一種可操作分類單元(OTU)[28]。聚類分析結(jié)果顯示702個含有外源插入片段的克隆子被聚為324個OTUs，F(xiàn)H、YS、BZ、HZ、LY分別包含74、69、76、73、72個OTUs，其中含有1、2、3個克隆子的OTU分別占所有被分析16S rRNA基因克隆子的26%、23% 和18%，優(yōu)勢ARDRA譜型(>3個克隆子)有38個，占所有被分析16S rRNA基因克隆子的33%(圖3)。

圖2 鳳丹根際土壤16S rRNA基因文庫中部分克隆的酶切圖譜(a．從克隆子中擴(kuò)增出的16S rRNA基因插入片斷，b．經(jīng)HinfI和Csp6I消化產(chǎn)生的片斷多態(tài)性)Fig.2 16S rRNA gene enzyme digestion process (a. Inserted 16S rRNA gene from clones, b. RFLP profiles of some clones digested by HinfI and Csp6I)

圖3 五個克隆文庫中細(xì)菌群落16S rRNA基因克隆的ARDRA型分布Fig.3 ARDRA distribution in five 16S rRNA gene clone libraries from bacteria community

2.3 16S rRNA基因克隆文庫的評估和細(xì)菌多樣性分析

所構(gòu)建的5個鳳丹根際土壤細(xì)菌群落的16S rRNA基因文庫的Coverage C為71.32— 81.40，均大于70% 且YS(81.40%)明顯高于其他4個(表2)。稀疏曲線分析結(jié)果見圖4?？寺∥膸斓亩鄻有灾笖?shù)分析顯示，F(xiàn)H、YS、BZ、HZ、LY克隆文庫的Shannon-Wiener多樣性指數(shù)(H′)依次分別為4.141、3.949、4.173、4.184和4.120。均勻度指數(shù)(EH)范圍為0.933—0.975且YS(0.933)明顯小于其他4個。Chao1指數(shù)YS最高(107.25)，HZ最低(89.52)。

2.4 序列及系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析

為了更詳細(xì)了解鳳丹根際土壤的優(yōu)勢細(xì)菌種類組成，從庫中占優(yōu)勢的ARDRA譜型中挑選了38個代表克隆子，對其插入的16S rRNA基因片段進(jìn)行測序，并建立系統(tǒng)發(fā)育樹(圖5)。優(yōu)勢OTU所代表的細(xì)菌類群詳細(xì)描述見表3，主要包括變形菌門(Proteobacteria)的alpha、beta、gamma、delta 亞門，酸桿菌門(Acidobacteria)，放線菌門(Actinobacteria)，擬桿菌門(Bacteroidetes)及厚壁菌門(Firmicutes)等11類細(xì)菌，此外，還包含了3個未歸類的細(xì)菌。克隆文庫中16S rRNA基因序列相似性為95%—99%，其最相似細(xì)菌主要來自花生、向日葵、草原、森林等不同類型的土壤。

表2 細(xì)菌群落 16S rRNA 基因克隆文庫多樣性指數(shù)

樣品FH、YS、BZ、HZ、LY，分別表示采自于銅陵、蕪湖、亳州、菏澤、洛陽牡丹園內(nèi)3年生4月份鳳丹根際土壤

圖4 鳳丹根際土壤細(xì)菌群落16S rRNA 基因克隆文庫的稀疏曲線分析Fig.4 Rarefaction curves generated for 16S rRNA genes in clones libraries from soil samples collected in YS, FH, BZ, HZ and LY, indicating the observed number of operational taxonomic units (OTUs) at a genetic distance of 3%樣品FH、YS、BZ、HZ、LY，分別表示采自于銅陵、蕪湖、亳州、菏澤、洛陽牡丹園內(nèi)3年生4月份鳳丹根際土壤

2.4.1 變形菌門(Proteobacteria)

在測序的優(yōu)勢代表克隆子中，有15個屬于變形細(xì)菌，代表了15個OTUs，其中α-、β-、γ-、δ-Proteobacteria分別為1、8、5、1個。在γ-Proteobacteria的5個OTUs中，豐度最高的克隆子(13個)代表了與Pseudomonassp. 相近的3個OTUs，序列相似性為96%—99%，為文庫優(yōu)勢菌屬。在β-Proteobacteria的8個OTUs中，有2個OTUs(含有10個克隆子)與Burkholderiasp. 相近，16S rRNA基因序列相似性為99%，為文庫優(yōu)勢菌屬。此外，有2個OTUs分別與Polaromonassp. 和Cupriavidussp. 相近，序列相似性為98%。在與變形細(xì)菌相似的OTU中，僅有1個OTU與α-Proteobacteria的Sphingomonassp. 聚為一群，序列相似性為98%。而與δ-Proteobacteria相近的1個OTU與已知的Sorangiumcellulosumstrain KYC3466的序列相似性為95%。

2.4.2 酸桿菌門(Acidobacteria)

有5個OTUs與酸桿菌門的細(xì)菌聚為一群(圖5)，共包含了28個克隆子，均為不可培養(yǎng)的細(xì)菌，16S rRNA基因序列相似性為97%—99%。

2.4.3 放線菌(Actinobacteria)

在放線菌的5個OTUs中，豐度最高的克隆子(14個)代表了與Arthrobactersp. 相近的3個OTUs，序列相似性為98%—99%，為文庫優(yōu)勢菌屬。其余2個OTUs分別于Solirubrobactersp. 和Streptomycessp. 相近，16S rRNA基因序列相似性為96%—99%。

圖5 基于16S rRNA基因序列同源性的38個優(yōu)勢OTUs系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree showing the relationship of 16S rRNA gene sequences of 38 dominant OTUs compared with the most similar GenBank sequences. The tree was constructed by the use of neighbor-joining analysis based on rRNA gene sequences. Only bootstrap values (n=1000 replicates) above 50% were displayed and the par represents a 0.05 of nucleotide divergence. All the sequences highlighted in bold were retrieved from this study

表3 與測序克隆16s rRNA基因序列最相似的NCBI基因庫中的微生物種類

2.4.4 其他細(xì)菌

有3個OTUs與擬桿菌門的細(xì)菌聚在一起(圖5)，序列相似性為97%—99%。2個 OTUs分別以98%和99%的相似水平與從土壤中分離到的厚壁菌門菌株P(guān)aenisporosarcinamacmurdoensis和Bacillusniacini聚在一起。分別有1個OUT與芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、TM7菌和疣微菌門(Verrucomicrobia)聚在一起。

3 討論

16S rRNA基因克隆文庫的構(gòu)建是微生物分子生態(tài)學(xué)中用來研究環(huán)境中微生物多樣性的主要方法之一[29]。通過對文庫中的克隆進(jìn)行測序, 了解環(huán)境樣品中的微生物組成。但是要獲得一個較全面、詳細(xì)的微生物群落組成分析結(jié)果，就需要建一個足夠大的文庫，而對文庫中每個克隆進(jìn)行測序，就需要高昂的費(fèi)用[30]。ARDRA不但可以快速、穩(wěn)定地分析微生物群落組成，而且可以減少測序費(fèi)用[31]。為了驗(yàn)證ARDRA的分析結(jié)果，隨機(jī)挑選了5種譜型，每種譜型送2—3個克隆子進(jìn)行序列測定，結(jié)果表明來自同一種譜型不同克隆子的序列是一樣的。通過ARDRA分析，702個陽性克隆子被聚為324個OTUs，這樣測序量就大大降低。通過對譜型圖的觀察分析發(fā)現(xiàn)，不同類型的細(xì)菌具有不同的譜型，這表明所使用的限制性內(nèi)切酶HinfI和Csp6I可以很好地區(qū)分所研究的細(xì)菌種群。此外，大部分的譜型只包含了1—3個克隆，說明鳳丹根際土壤具有豐富的細(xì)菌多樣性。

為了對鳳丹根際土壤細(xì)菌群落做一個較全面的分析，本研究中使用了稀疏曲線和Coverage C[25]來評價所構(gòu)建的克隆文庫大小。Coverage C越高，表明所構(gòu)建的文庫越能代表環(huán)境中的細(xì)菌群落多樣性。結(jié)果顯示，所構(gòu)建的5個鳳丹根際土壤細(xì)菌群落的16S rRNA基因文庫的Coverage C均大于70%(表2)，說明所構(gòu)建的克隆文庫基本可以反映所采集土壤細(xì)菌群落的多樣性，這一結(jié)果與稀疏曲線分析一致(圖4)。此外，YS的Coverage C明顯高于其他4個，表明YS未被檢測到的微生物最少，最能反應(yīng)其土壤細(xì)菌群落的多樣性。

細(xì)菌多樣性分析結(jié)果顯示，雖然YS的Chao1指數(shù)最高(107.25)，但是其均勻度(EH)和Shannon-Wiener多樣性指數(shù)(H′)卻最低(0.933和3.949)(表2)。這可能因?yàn)镃hao1指數(shù)用于反映物種豐富度的非參數(shù)估計(jì)[26]，而Shannon-Wiener多樣性指數(shù)不僅反映了物種的豐富度，而且反映了其均勻度[32]。與前人相似的研究比較發(fā)現(xiàn)，使用分子方法研究微生物多樣性[11]比使用傳統(tǒng)純培養(yǎng)方法[10]獲得的細(xì)菌多樣性指數(shù)要高。鳳丹地道產(chǎn)區(qū)(FH和YS)與非地道產(chǎn)區(qū)(BZ、HZ和LY)的細(xì)菌群落都具有較高的多樣性(表2)，這可能與藥用植物鳳丹在生長發(fā)育的周期中形成的特殊根際土壤微環(huán)境有關(guān)[11]。

由于優(yōu)勢細(xì)菌種類可能對碳、氮循環(huán)和其他地球生物化學(xué)循環(huán)產(chǎn)生較大的影響，因此，了解所研究環(huán)境的優(yōu)勢細(xì)菌種群是至關(guān)重要的。此外，對于特定的細(xì)菌主導(dǎo)著微生物群落一直是生態(tài)學(xué)研究的根本問題[33]。本研究中挑選了優(yōu)勢細(xì)菌種群進(jìn)行測序，并對其進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果表明，鳳丹根際土壤的優(yōu)勢細(xì)菌種群主要包括變形菌門的alpha、beta、gamma、delta亞門，酸桿菌門，放線菌門，擬桿菌門及厚壁菌門等11類細(xì)菌，此外，還包含了3個未歸類的細(xì)菌。其中Pseudomonassp.、Burkholderiasp. 和Arthrobactersp.為優(yōu)勢菌屬。Pseudomonas是土壤中最常見的細(xì)菌，也是根際土壤細(xì)菌群落的主要成員之一，具有抑制植物病原菌、促進(jìn)植物生長的作用[34]?？赡芤?yàn)檠芯糠椒ú煌?Han等[10]利用傳統(tǒng)純培養(yǎng)的方法研究了牡丹(P.ostii)根部土壤微生物的多樣性，卻沒有發(fā)現(xiàn)Pseudomonas。Burkholderia是β-Proteobacteria中最豐富的一個屬，在礦石風(fēng)化和氮固定方面具有重要作用[35]。Arthrobacter是放線菌中最主要的一個屬，廣泛的存在于土壤中。該屬的許多種類在不同植物的土壤微生物區(qū)系中占優(yōu)勢地位[36],并參與有毒金屬(包括銅、錳、鎳和鉛)的生物吸附[37]。值得注意的是：(1)克隆文庫中存在大量未歸類的細(xì)菌種類，這可能與鳳丹根際土壤形成的特殊微環(huán)境有關(guān)[11]；(2)僅在TCu含量最高YS和LY發(fā)現(xiàn)了厚壁菌門的細(xì)菌優(yōu)勢菌屬，這一結(jié)果與前人研究結(jié)論相一致[38]；(3)鳳丹地道產(chǎn)區(qū)(FH和YS)與非地道產(chǎn)區(qū)(BZ、HZ和LY)根際土壤細(xì)菌優(yōu)勢菌群均為變形菌門(包括alpha、beta、gamma、detla 亞門)、酸桿菌門、放線菌門，這可能是因?yàn)檫@些優(yōu)勢菌群普遍存在于種植鳳丹的根際土壤中。為了更深入地研究鳳丹地道產(chǎn)區(qū)與非地道產(chǎn)區(qū)根際細(xì)菌群落間的差異，后續(xù)將所有剩下的OTUs進(jìn)行測序和系統(tǒng)發(fā)育分析。

4 結(jié)論

目前，16S rRNA基因克隆文庫和ARDRA方法已廣泛應(yīng)用于生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性研究中。該方法體系可以反映群落基因組的遺傳信息和單個菌株的系統(tǒng)發(fā)育信息，但是，要獲得較全面的群落結(jié)構(gòu)信息，就需要進(jìn)行大量樣品分析，以確保所構(gòu)建的克隆文庫庫容達(dá)到要求。

我國藥用植物鳳丹(P.suffruticosa)主要分布區(qū)域的根際土壤細(xì)菌種群有11類和3個未歸類細(xì)菌，其中變形菌門和酸桿菌門為文庫中的主要菌群，Pseudomonassp.、Burkholderiasp. 和Arthrobactersp. 為優(yōu)勢菌屬。表明我國藥用植物鳳丹(P.suffruticosa)主要分布區(qū)域的根際土壤細(xì)菌種群不僅具有豐富的多樣性, 還存在豐富的潛在新種類。

[1] He L X, Suo Z L, Zhang C H, Jin X B, Zhao D X, Zhao X Q, Hou B X, Deng C F. Classification of Chinese medicinal tree peony cultivars based on chloroplast DNA sequences. AASRI Procedia, 2012, 1: 344- 352.

[2] Guo D L, Hou X G, Zhang J. Sequence-related amplified polymorphism analysis of tree peony (PaeoniasuffruticosaAndrews) cultivars with different flower colours. Journal of Horticultural Science & Biotechnology, 2009, 84: 131- 136.

[3] Han X Y, Wang L S, Shu Q Y, Liu Z A, Xu S X, Tetsumura T. Molecular characterization of tree peony germplasm using sequence-related amplified polymorphism markers. Biochemical Genetics, 2008, 46(3/4): 162- 179.

[4] Wu M J, Gu Z Y. Screening of bioactive compounds from Moutan Cortex and their anti-inflammatory activities in RatSynoviocytes. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, 2009, 6(1): 57- 63.

[5] 覃逸明, 聶劉旺, 黃雨清, 王千, 劉欣, 周科. 鳳丹(PaeoniaostiiT.)自毒物質(zhì)的檢測及其作用機(jī)制. 生態(tài)學(xué)報, 2009, 29(3): 1153- 1160.

[6] Liu Y L, Xia Y, Guo P, Wang G P, Shen Z G, Xu Y C, Chen Y H. Copper and bacterial diversity in soil enhance paeonol accumulation in Cortex Moutan ofPaeoniasuffruticosa′Fengdan′. Horticulture, Environment, and Biotechnology, 2013, 54(4): 331- 337.

[7] 康業(yè)斌, 商鴻生, 成玉梅. 牡丹病害及其固有的化學(xué)抗病物質(zhì)研究進(jìn)展. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報: 自然科學(xué)版, 2005, 33(8): 247- 249.

[8] 易建利. 儲存時間對牡丹皮藥材和飲片中丹皮酚含量的影響. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報, 2008, 28(3): 42- 43.

[9] 康業(yè)斌, 商鴻生, 董苗菊. 鳳丹與洛陽紅根際微生物及其與根皮中丹皮酚含量的關(guān)系. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報: 自然科學(xué)版, 2006, 34(12): 159- 162.

[10] Han J G, Song Y, Liu Z G, Hu Y H. Culturable bacterial community analysis in the root domains of two varieties of tree peony (Paeoniaostii). Fems Microbiology Letters, 2011, 322(1): 15- 24.

[11] Xue D, Huang X D. Changes in soil microbial community structure with planting years and cultivars of tree peony (Paeoniasuffruticosa). World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2014, 30(2): 389- 397.

[12] Bastida F, Kandeler E, Moreno J L, Ros M, García C, Hernández T. Application of fresh and composted organic wastes modifies structure, size and activity of soil microbial community under semiarid climate. Applied Soil Ecology, 2008, 40(2): 318- 329.

[13] Davies P J. The plant hormones: Their nature, occurrence, and functions // Plant Hormones-Biosynthesis, Signal Transduction, Action, 3rd ed. The Netherlands: Springer, 2010: 1- 15.

[14] Berg G. Plant-microbe interactions promoting plant growth and health: Perspectives for controlled use of microorganisms in agriculture. Applied Microbiology and Biotechnology, 2009, 84(1): 11- 18.

[15] Zhou H Y, Wei H L, Liu X L, Wang Y, Zhang L Q, Tang W H. Improving biocontrol activity ofPseudomonasfluorescensthrough chromosomal integration of 2,4-diacetylphloroglucinol biosynthesis genes. Chinese Science Bulletin, 2005, 50(8): 775- 781.

[16] Franke-Whittle I H, Knapp B A, Fuchs J, Kaufmann R, Insam H. Application of COMPOCHIP microarray to investigate the bacterial communities of different composts. Microbial Ecology, 2009, 57(3): 510- 521.

[17] Benizri E, Piutti S, Verger S, Pagès L, Vercambre G, Poessel J L, Michelot P. Replant diseases: Bacterial community structure and diversity in peach rhizosphere as determined by metabolic and genetic fingerprinting. Soil Biology & Biochemistry, 2005, 37(9): 1738- 1746.

[18] Milling A, Smalla K, Maidl F X, Schloter M, Munch J C. Effects of transgenic potatoes with an altered starch composition on the diversity of soil and rhizosphere bacteria and fungi. Plant and Soil, 2005, 266(1/2): 23- 39.

[19] Kirk J L, Beaudette L A, Hart M, Moutoglis P, Klironomos J N, Lee H, Trevors J T. Methods of studying soil microbial diversity. Journal of Microbiological Methods, 2004, 58(2): 169- 188.

[20] Sardans J, Peuelas J, Prieto P, Estiarte M. Drought and warming induced changes in P and K concentration and accumulation in plant biomass and soil in a Mediterranean shrubland. Plant and Soil, 2008, 306(1/2): 261- 271.

[21] Lee C S, Li X D, Shi W Z, Cheung S C, Thornton I. Metal contamination in urban, suburban, and country park soils of Hong Kong: A study based on GIS and multivariate statistics. Science of the Total Environment, 2006, 356(1/3): 45- 61.

[22] Nelson D W, Sommers L E. Total carbon, organic carbon, and organic matter // Sparks D L, Page A L, Helmke P A, Loeppert R H, Soltanpour P N, Tabatabai M A, Johnson C T, Sumner M E, eds. Methods of Soil Analysis. Part 3—Chemical Methods. Madison: Soil Science Society of America Inc., 1996: 961- 1010.

[23] Keeney D, Nelson D. Nitrogen-inorganic forms // Page A L, Miller R H, Keeney D R, eds. Methods of Soil Analysis. Part 2. Chemical and Microbiological Properties. American Society of Agronomy, 1982: 643- 698.

[24] Zhao J, Wu X B, Nie C P, Wu T, Dai W H, Liu H, Yang R Y. Analysis of unculturable bacterial communities in tea orchard soils based on nested PCR-DGGE. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2012, 28(5): 1967- 1979.

[25] Good I J. The population frequencies of species and the estimation of population parameters. Biometrika, 1953, 40(3/4): 237- 264.

[26] Chao A. Estimating the population size for capture-recapture data with unequal catchability. Biometrics, 1987, 43(4): 783- 791.

[27] Ashelford K E, Chuzhanova N A, Fry J C, Jones A J, Weightman A J. New screening software shows that most recent large 16S rRNA gene clone libraries contain chimeras. Applied and Environmental Microbiology, 2006, 72(9): 5734- 5741.

[28] Moyer C L, Dobbs F C, Karl D M. Estimation of diversity and community structure through restriction fragment length polymorphism distribution analysis of bacterial 16S rRNA genes from a microbial mat at an active, hydrothermal vent system, Loihi Seamount, Hawaii. Applied and Environmental Microbiology, 1994, 60(3): 871- 879.

[29] Amann R I, Ludwig W, Schleifer K H. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 1995, 59(1): 143- 169.

[30] Sogin M L, Morrison H G, Huber J A, Mark W D, Huse S M, Neal P R, Arrieta J M, Herndl G J. Microbial diversity in the deep sea and the underexplored "rare biosphere". Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2006, 103(32): 12115- 12120.

[31] Sun L, Qiu F B, Zhang X X, Dai X, Dong X Z, Song W. Endophytic bacterial diversity in rice (OryzasativaL.) roots estimated by 16S rDNA sequence analysis. Microbial Ecology, 2008, 55(3): 415- 424.

[32] Shannon C E, Weaver W. The Mathematical Theory of Communication. Urbana IL: University of Illinois Press, 1949: 3- 18.

[33] Cottrell M T, Kirchman D L. Community composition of marine bacterioplankton determined by 16S rRNA gene clone libraries and fluorescence in situ hybridization. Applied and Environmental Microbiology, 2000, 66(12): 5116- 5122.

[34] Jorquera M A, Crowley D E, Marschner P, Greiner R, Teresa Fernández M, Romero D, Menezes-Blackburn D, de la Luz Mora M. Identification of beta-propeller phytase-encoding genes in culturablePaenibacillusandBacillusspp. from the rhizosphere of pasture plants on volcanic soils. Fems Microbiology Ecology, 2011, 75(1): 163- 172.

[35] Leveau J H J, Uroz S, de Boer W. The bacterial genusCollimonas: mycophagy, weathering and other adaptive solutions to life in oligotrophic soil environments. Environmental Microbiology, 2010, 12(2): 281- 292.

[36] Xu C W, Yang M Z, Chen Y J, Chen L M, Zhang D Z, Mei L, Shi Y T, Zhang H B. Changes in non-symbiotic nitrogen-fixing bacteria inhabiting rhizosphere soils of an invasive plantAgeratinaadenophora. Applied Soil Ecology, 2012, 54: 32- 38.

[37] Veglió F, Beolchini F, Gasbarro A. Biosorption of toxic metals: an equilibrium study using free cells ofArthrobactersp. Process Biochemistry, 1997, 32(2): 99- 105.

[38] Wakelin S A, Chu G X, Lardner R, Liang Y C, McLaughlin M. A single application of Cu to field soil has long-term effects on bacterial community structure, diversity, and soil processes. Pedobiologia, 2010, 53(2): 149- 158.

Bacterial diversity in rhizosphere soil of the medicinal tree peony (Paeoniasuffruticosa) revealed by amplified ribosomal DNA restriction analysis

ZHANG Yonggan1, ZHAO Juan1, ZHANG Yujie1, WU Ting1, WU Xiaobing2, ZHENG Yan2,*

1 School of Environmental Science and Engineering, Anhui Normal University, Wuhu 241000, China 2SchoolofLifeScience,AnhuiNormalUniversity,Wuhu241000,China

The medicinal tree peony (Paeoniasuffruticosa) is an important resource in traditional Chinese medicine. Soil bacteria, especially rhizosphere bacteria, have strong effects on plant health and growth. In this study, the bacterial community structure and diversity inP.suffruticosarhizosphere soil in five major distribution areas in China were investigated by amplified ribosomal DNA restriction analysis (ARDRA). The ARDRA patterns of the amplified 16S rRNA gene produced an average of 2—6 bands that ranged in size from 100 to 1302 bp, which indicated that the fragments of the 16S rRNA gene were efficiently double-digested with the restriction endonucleasesHinfI andCsp6I. ARDRA-based cluster analysis showed that 702 positive clones were clustered into 74, 69, 76, 73, and 72 operational taxonomic units (OTUs) in the FH, YS, BZ, HZ, and LY libraries, respectively. Most of the OTUs contained 1—3 clones, which implied high diversity in the peony rhizosphere soil; twenty-six OTUs contained 4—6 clones; and five OTUs contained 7—12 clones. Rarefaction analysis showed that the positive clones in each library covered the diversity of bacterial taxa, which was further confirmed by clone library coverage (range: 71.32%—81.40%). Diversity analysis indicated high bacterial diversity in the soils (Shannon diversity index 3.949—4.184; Chao1 index range 89.52—107.25). Sequence analysis revealed diverse bacterial phyla in the 16S rRNA gene library, consisting of α, β, γ, and δ subclasses of Proteobacteria, Acidobacteria, Actinobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes, Verrucomicrobia, TM7, Gemmatimonadetes, and three unclassified bacteria. The dominant phyla were Proteobacteria and Acidobacteria (47.34% and 14.36% of the total clones, respectively), and the dominant genera in the clone libraries werePseudomonas,Burkholderia, andArthrobacter. In addition, a portion of the clones was only distantly related to sequences in the GenBank database, suggesting that bacteria in rhizosphere soil of the medicinal tree peony were unique and diverse. Furthermore, the relative abundance of Firmicutes (mainlyBacillusspp.) was positively correlated with soil Cu content. The rhizosphere bacteria belonged the same dominant phyla (Proteobacteria, Acidobacteria, and Actinobacteria) and showed high diversity between geo-authentic and non-authentic areas, implying thatP.suffruticosatended to form a similar microenvironment and select similar bacterial communities in the rhizosphere soil.

tree peony (Paeoniasuffruticosa); rhizosphere soils; bacteria; diversity; ARDRA

國家自然科學(xué)基金(81173491)；安徽省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(1308085MC42)

2015- 03- 03;

2016- 03- 21

10.5846/stxb201503030405

*通訊作者Corresponding author.E-mail: zhengyan67@126.com

張永敢, 趙娟, 張玉潔, 吳婷, 吳孝兵, 鄭艷.藥用植物鳳丹(Paeoniasuffruticosa)根際土壤細(xì)菌群落16S rRNA基因的ARDRA分析.生態(tài)學(xué)報,2016,36(17):5564- 5574.

Zhang Y G, Zhao J, Zhang Y J, Wu T, Wu X B, Zheng Y.Bacterial diversity in rhizosphere soil of the medicinal tree peony (Paeoniasuffruticosa) revealed by amplified ribosomal DNA restriction analysis.Acta Ecologica Sinica,2016,36(17):5564- 5574.