陳 琳， 李秉鈞， 馮俊榮， 于本淑， 韓恭文

(1 煙臺大學海洋學院，山東 煙臺 264005；2 山東省水生生物資源養(yǎng)護管理中心，山東 煙臺 26400；3 龍口市水產(chǎn)技術(shù)推廣站，山東 龍口 265700)

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蘇云金芽孢桿菌酵解大西洋鮭加工廢棄物制備抗氧化酵解液研究

陳 琳1， 李秉鈞1， 馮俊榮1， 于本淑2， 韓恭文3

(1 煙臺大學海洋學院，山東 煙臺 264005；2 山東省水生生物資源養(yǎng)護管理中心，山東 煙臺 26400；3 龍口市水產(chǎn)技術(shù)推廣站，山東 龍口 265700)

為減少因大西洋鮭加工廢棄物中的蛋白成分而造成的環(huán)境污染和資源浪費，同時提高其綜合利用價值，探索以大西洋鮭加工廢棄物制成的干粉為原料，使用一株蘇云金芽孢桿菌，通過控制料液比、接種量、發(fā)酵時間、溫度、pH和菌齡等發(fā)酵條件來酵解魚粉，以制取抗氧化酵解液。首先以總抗氧化活性和α-氨基氮含量為指標，找到最佳單因素條件；然后在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以水解度和總抗氧化活性為指標，使用正交實驗 L25(56)對發(fā)酵條件進行優(yōu)化，確定最佳發(fā)酵條件為：料液比2.0 g/50 mL，接種量3%，發(fā)酵時間72 h，溫度30℃，pH 6.6，菌齡48 h，該條件下酵解得到的發(fā)酵液總抗氧化活性為503.59 U，魚粉水解度為17.29%。研究表明，采用蘇云金芽胞桿菌酵解大西洋鮭加工廢棄物以制取抗氧化酵解液，具有一定的可行性。

大西洋鮭；廢棄物；蘇云金芽孢桿菌；酵解；抗氧化酵解液；正交實驗

大西洋鮭已在我國成功實現(xiàn)大規(guī)模養(yǎng)殖。其加工產(chǎn)生的廢棄物中含有大量的蛋白質(zhì)，直接遺棄不但浪費資源還污染環(huán)境[1]。若能有效利用大西洋鮭加工廢棄物，將有可能獲得更多的蛋白資源[2]。人體內(nèi)過剩的活性氧自由基，與多種慢性疾病的產(chǎn)生及人體衰老有很大的關(guān)系[3-4]?？寡趸巧矬w實現(xiàn)自我保護的根本性機制[5]。通過蛋白質(zhì)可控酶解技術(shù)制取的抗氧化肽作為天然的抗氧化劑能很好地解決以上問題[6]。

酶解法是一種獲得抗氧化酵解液的有效方式，主要有內(nèi)源酶酶解法、外源酶酶解法、微生物酵解法[7-8]。微生物酵解法由于其自身的優(yōu)勢已經(jīng)成為當下研究的熱點[9]。蘇云金芽孢桿菌作為一種常見微生物被廣泛用來生產(chǎn)蛋白酶[10]。使用蘇云金芽孢桿菌直接酵解大西洋鮭加工廢棄物，來制取抗氧化酵解液的研究尚未見諸報道。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實驗材料、試劑和培養(yǎng)基：大西洋鮭加工廢棄物(魚頭、魚鰭和魚尾)；磷酸氫二鈉、瓊脂、葡萄糖、磷酸二氫鈉、氯化鈉、鹽酸、氫氧化鈉、甲醛等(均為分析純)；總抗氧化能力(T-AOC)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；菌種活化培養(yǎng)基(牛肉膏0.3%、蛋白胨1.0%、氯化鈉0.5%、瓊脂2.0%、pH 6.6)；種子液培養(yǎng)基(葡萄糖0.5%、酵母膏1%、蛋白胨0.5%、氯化鈉0.2%、pH 6.6)[11]。

實驗儀器：250HG型數(shù)顯光照震蕩培養(yǎng)箱(金壇市精達儀器制造廠)；HYQ150生物搖床(武漢匯誠生物科技有限公司)；H1650-W型臺式高速離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)；V-1100D型可見分光光度計(上海美譜達儀器有限公司)；LDZM-40KCS型立式壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠)；PHS-3CpH計(上海儀電科學儀器股份有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 大西洋鮭加工廢棄物主要成分測定方法

蛋白質(zhì)含量：微量凱氏定氮法[12]；脂肪含量：索氏抽提法[13]；灰分測定：灼燒法[14]。

1.2.2 原料處理

原料處理流程[15]：原料切碎→烘干(70℃，24 h)→絞碎→第一次脫脂(乙醇原料比4∶1)→烘干(70℃，2 h)→第二次脫脂(異丙醇原料比2∶1)→烘干(70℃，24 h)→過篩網(wǎng)(120目)。

1.2.3 抗氧化酵解液制備

稱取一定量經(jīng)二次脫脂處理的魚粉與50 mL相應(yīng)pH緩沖液混合，為防止外源微生物的干擾，將混合物進行高溫蒸汽滅菌，然后再控制時間、接種量、菌齡、溫度進行振蕩培養(yǎng)(120 r/min),反應(yīng)結(jié)束后，將酵解液置于沸水浴中15 min滅酶，再將酵解液離心(10 000 r/min，10 min)，上清液即為所需酵解液[16]。

1.2.4 酵解液生化指標及其測定方法

α-氨基氮含量：甲醛滴定法[14]；樣品總氮含量：凱氏定氮法[14]；總抗氧化活性：使用總抗氧化能力(T-AOC)測定試劑盒，取樣0.5 mL[17]。

總抗氧化能力計算公式：

MT-AOC=(A-A0)×(V1/V2)×N×V3×100/30

式中：MT-AOC—總抗氧化能力，U；A—測定光密度(OD)值；A0—對照OD值；V1—反應(yīng)液總量，mL；V2—取樣量，mL；N—樣本測試前稀釋倍數(shù)；V3—發(fā)酵液體積，mL。

水解度計算公式：

S=M1/M2×100%

式中：S—水解度，%；M1—上清液中氨基氮總含量，mg；M2—樣品中總氮含量，mg。

1.2.5 實驗設(shè)計

以總抗氧化能力和氨基氮含量為指標，考察溫度、酵解時間、接種量、pH、料液比、菌齡6個因素對酵解反應(yīng)的影響，并進行單因素實驗，確定最適單因素條件。在單因素實驗基礎(chǔ)上，以總抗氧化能力和水解度為指標，采用L25(56)正交表進行正交實驗設(shè)計，確定大西洋鮭加工廢棄物的最佳酵解條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 大西洋鮭加工廢棄物魚粉的主要成分

大西洋鮭加工廢棄物制備的脫脂魚粉中含有大量的蛋白質(zhì)，可以經(jīng)過進一步加工將其酶解制成抗氧化肽，以增大其綜合利用價值以及水產(chǎn)養(yǎng)殖企業(yè)的經(jīng)濟效益，緩解水產(chǎn)加工原料不足的狀況。脫脂魚粉的蛋白質(zhì)、脂肪和灰分的含量分別為(70.596±0.247)%、(3.074±0.071)%和(25.153±0.236)%；未脫脂魚粉的蛋白質(zhì)、脂肪和灰分的含量分別為(47.504±0.315)%、(37.322±0.412)%和(13.477±0.334)%。

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 最適料液比的確定

在固定發(fā)酵時間24h、溫度30℃、pH6.6、接種量2%、菌齡24h的條件下進行發(fā)酵實驗，考察不同料液比對總抗氧化活性和氨基氮含量的影響(圖1)。隨著料液比的增大，總抗氧化活性和氨基氮含量均呈現(xiàn)出增長的趨勢，開始時增長迅速，但在達到1.25g/50mL之后增速放緩。其原因是微生物釋放的胞外酶酶解反應(yīng)必須在水溶液中進行，因為蛋白酶必須溶解在相應(yīng)的緩沖液中才能均勻分散在整個體系中，與底物接觸并對其發(fā)生作用[18]，底物濃度過高會導致流動性差，阻礙酶與底物接觸，使反應(yīng)速率降低[19]。

圖1 不同料液比對總抗氧化活性和 氨基氮含量的影響Fig.1 Effect of material-solvent ratio on total antioxidantactivity and amino nitrogen content

除此之外，由于蘇云金芽孢桿菌的種內(nèi)競爭作用，菌量在一定時間之后是穩(wěn)定的，從而使得蛋白酶的釋放量也穩(wěn)定，在1.25g/50mL時蛋白酶處于飽和狀態(tài)，所以料液比的繼續(xù)增大對總抗氧化活性和氨基氮含量的影響減小。因此，確定最適料液比為1.25g/50mL，此時總抗氧化活性為283.05U，氨基氮含量為20.16mg/100mL。

2.2.2 最適接種量的確定

為探索最適接種量，以總抗氧化活性和氨基氮含量為指標，在固定料液比1.25g/50mL、發(fā)酵時間24h、溫度30℃、pH6.6、菌齡24h的條件下進行發(fā)酵實驗(圖2)。

圖2 不同接種量對總抗氧化活性和 氨基氮含量的影響Fig.2 Effect of inoculum quantity on total antioxidantactivity and amino nitrogen content

在接種量低于2%時，總抗氧化活性和氨基氮含量隨著接種量的增加而增長；高于2%之后，氨基氮含量趨于穩(wěn)定而總抗氧化活性略有波動。其原因是，接種的菌株前期主要是數(shù)目的擴增。接種量較低時達到飽和要耗費更多時間，接種量高于2%時可以很快增殖到飽和，菌量穩(wěn)定后，釋放到環(huán)境中的胞外酶量也穩(wěn)定，但由于料液比已固定，所以與魚粉反應(yīng)的酶量也趨于飽和，導致氨基氮含量指標的穩(wěn)定。接種量3.5%的總抗氧化活性與2.0%相比提升不多。因此，確定最適接種量為2%。

2.2.3 最適反應(yīng)溫度的確定

在26～42℃范圍內(nèi)考察發(fā)酵溫度對總抗氧化活性和氨基氮含量的影響，其他條件為：料液比1.25g/50mL，酵解時間48h，接種量2%，pH7.4，菌齡24h。溫度不僅影響蘇云金芽孢桿菌數(shù)目的擴增，而且影響蛋白酶的酶活。從圖3可以看出，在30℃時總抗氧化活性為453.75U、氨基氮含量為31.8mg/100mL，前者達到最大值，后者趨于最大值。因此，確定最適發(fā)酵溫度為30℃。

圖3 溫度對總抗氧化活性和 氨基氮含量的影響Fig.3 Effect of temperature on total antioxidantactivity and amino nitrogen content

2.2.4 最適pH的確定

在固定料液比1.25g/50mL、發(fā)酵時間24h、溫度30℃、接種量2%、菌齡24h的條件進行發(fā)酵，當pH5.8～6.2時氨基氮含量增長迅速，而在pH6.2～7.8時增長放緩，但總抗氧化活性不斷增長，并在pH7.4時達到最大值。其原因是，蘇云金芽孢桿菌可產(chǎn)生若干種胞外蛋白酶，最適pH為6.2～7.8，在此范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)底物均可被水解，其中pH7.4時的蛋白酶可水解魚粉蛋白，產(chǎn)生最大量的抗氧化肽。因此，確定最適pH為7.4。

圖4 不同pH對總抗氧化活性和 氨基氮含量的影響Fig.4 Effect of pH on total antioxidantactivity and amino nitrogen content

2.2.5 最適酵解時間的確定

酵解時間是發(fā)酵工藝的一個重要因素。為找到最佳酵解時間，在實驗固定料液比1.25g/50mL、溫度30℃、接種量2%、pH7.4、菌齡24h的條件下分析不同發(fā)酵時間對總抗氧化活性和氨基氮含量的影響(圖5)?？偪寡趸钚钥傮w上呈先增長后下降趨勢；而氨基氮含量在前24h隨時間迅速增長，24h之后增速放緩。這與鄭毅等[20]的實驗結(jié)果相同。在48h后總抗氧化活性出現(xiàn)降低的情況，這可能是因為在48h之后隨著營養(yǎng)物質(zhì)的消耗，蘇云金芽孢桿菌進入衰老期，新陳代謝活動減弱，從而產(chǎn)酶量降低，使得氨基氮含量趨于穩(wěn)定，部分抗氧化肽消耗用于緩解衰老的緣由。綜合考慮，確定最適酵解時間為48h，這時總抗氧化活性為287.82U。

圖5 不同酵解時間對總抗氧化活性和 氨基氮含量的影響Fig.5 Effect of time on total antioxidantactivity and amino nitrogen content

2.2.6 最適菌齡的確定

在固定料液比1.25g/50mL、酵解時間48h、接種量2%、pH7.4、溫度30℃的條件下分析不同菌齡對總抗氧化活性和氨基氮含量的影響。不同菌齡的菌種處于不同的生長階段，用對數(shù)期的菌種接種，則子代培養(yǎng)物的延滯期就短，反之如果用延滯期或者衰亡期的菌種接種，則子代培養(yǎng)物的延滯期就長。從圖6中可以看出，使用菌齡24h的種子液發(fā)酵時，總抗氧化活性為421.34U，達到

最大值，而12h菌齡的種子液細菌相對數(shù)量較少，因此，總抗氧化活性和氨基氮含量較低。大于24h菌齡的種子液或處于穩(wěn)定期或處于衰亡期，子代均需經(jīng)過較長的延滯期才能達到對數(shù)期。因此，確定最適菌齡為24h。

圖6 菌齡對總抗氧化活性和 氨基氮含量的影響Fig.6 Effect of cell age on total antioxidantactivity and amino nitrogen content

2.3 正交試驗優(yōu)化結(jié)果

根據(jù)已知的單因素試驗結(jié)果，應(yīng)用正交試驗對其酵解條件進行優(yōu)化，確定其最佳酵解工藝條件(表1)。表中：A—料液比，g/50mL；B—接種量，mL/100mL；C—時間，h；D—溫度，℃；E—pH；F—菌齡，h。

表1 正交試驗因素與水平L25(56)Tab.1 Factors and levels in L25(56)orthogonal array design

以水解度和總抗氧化活性(簡稱總抗)為指標，分析表2的正交設(shè)計方案，以確定最佳反應(yīng)條件。正交實驗結(jié)果分析見表2、表3、表4。

表2 正交試驗方案與結(jié)果分析Tab.2 The design and results of orthogonal test

表3 以水解度為指標的正交試驗方差分析結(jié)果Tab.3 Analysis of variance by comparing the degree of hydrolysis

表4 以總抗為指標的正交試驗方差分析結(jié)果Tab.4 Analysis of variance by comparing the total antioxidant activity

用蘇云金芽孢桿菌發(fā)酵大西洋鮭加工廢棄物制成的魚粉時，以水解度為指標，從表3可以看出，6個因素對水解度均有顯著性影響(P<0.05)；由極差分析表2發(fā)現(xiàn)相關(guān)因素的影響程度依次為：發(fā)酵時間，溫度，pH，料液比，菌齡，接種量；最佳實驗組合為：料液比1.0 g/50 mL，接種量2%，發(fā)酵時間60 h，溫度34℃，pH 6.6，菌齡12 h。以總抗氧化活性為指標，從表4可以發(fā)現(xiàn)，6個因素對水解度均有顯著性影響(P<0.05)；由極差分析表2發(fā)現(xiàn)相關(guān)因素的影響程度依次為：溫度，料液比，發(fā)酵時間，接種量，pH，菌齡；最佳實驗組合為：料液比2.0 g/50 mL，接種量3%，發(fā)酵時間72 h，溫度30℃，pH 6.6，菌齡48 h。

上述兩個最佳組合并未出現(xiàn)在正交表中，需要對其進行驗證實驗。采用兩組優(yōu)化工藝參數(shù)對大西洋鮭魚加工廢棄物進行酵解反應(yīng)，魚粉水解度分別為27.25%和17.29%，二者具有顯著性差異(P<0.05)；總抗氧化活性分別為282.88 U和503.59 U，二者具有顯著性差異(P<0.05)。與表2中的數(shù)據(jù)比對發(fā)現(xiàn)，優(yōu)化后的水解度最優(yōu)實驗組合比正交表中水解度提高了14.40%，總抗氧化活性最優(yōu)實驗組合提高了6.62%。通過兩個最優(yōu)組合比較可以發(fā)現(xiàn)，水解度和總抗氧化活性不成正變關(guān)系。

艾冰花等[15]使用響應(yīng)面法優(yōu)化后蘇云金芽孢桿菌鲅魚肽制備工藝條件為：料液比2.9 g/50 mL，接種量2%，發(fā)酵時間48 h，溫度30℃，pH 6.6，菌齡24 h，所得總抗氧化活性為537.73U。比較后發(fā)現(xiàn)，溫度和pH接近，其他因素有差異，但總抗氧化活性接近。分析原因是原料的不同造成各因素間相互作用，以及微生物發(fā)酵過程中太多的不可控因素。

3 結(jié)論

用蘇云金芽孢桿菌發(fā)酵大西洋鮭加工廢棄物干粉制取抗氧化酵解液，以總抗氧化活性和水解度為指標，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，使用正交法對發(fā)酵條件進行優(yōu)化，兩個優(yōu)化組合在總抗氧化活性和水解度上都有所提高；而溫度、料液比、發(fā)酵時間、接種量、pH、菌齡等6個因素對總抗氧化活性均有顯著影響。優(yōu)化后得到的最佳反應(yīng)條件為：料液比2.0 g/50 mL，接種量3%，發(fā)酵時間72 h，溫度30℃，pH 6.6，菌齡48 h，該條件下酵解得到的發(fā)酵液總抗氧化活性為503.59 U，魚粉水解度為17.29%。研究結(jié)果證明，用蘇云金芽孢桿菌處理大西洋鮭魚加工廢棄物制取抗氧化酵解液是可行的

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[1] 閆鳴艷,秦松.酶解刺參內(nèi)臟蛋白制備抗氧化肽的研究[J].食品工業(yè)科技,2013,34(19):115-118.

[2] 裴小平,唐道邦,肖更生,等.抗氧化肽制備的應(yīng)用現(xiàn)狀及趨勢[J].食品工業(yè)科技,2009,30(2):319-322.

[3] KAWANISHI S,HIRAKU Y,MURATA M,etal.The role of metals in site-specific DNA damage with reference to carcinogenesis[J].Free Radic Biol Med,2002,32:822-832.

[4] SACHIDANANDAME K,FAGAN S C,ERGUL A.Oxidative stress and cardiovascular disease:antioxidants and unresolved issues[J].Cardiovascular Drug Rev,2005,23:115-132.

[5] 樊金娟,羅霞,付巖松,等.米糠抗氧化肽大鼠體外抗氧化作用研究[J].食品科學,2010,31(9):251-254.

[6] CHAN K M,DECKER E A,MEANS W J.Extraction and activity of Carnosine,a naturally occurring antioxidant in beef muscle[J].Food Science,1993,58(1):1-4.

[7] SITTHIPONGi N,SOOTTAWAT B,HIDEKI K,etal.Functionalities and antioxidant properties of protein hydrolysates from the muscle of ornate threadfin bream treated with pepsin from skipjack tuna[J].Food Chemistry,2011,124:1354-1362.

[8] 彭德翔,丁卓平.抗衰老活性肽的研究進展[J].現(xiàn)代食品科技,2006,22(2):267- 270

[9] DEMAIN A L,ADRIO J.Contributions of microorganisms to industrial biology[J].Molecular Biotechnology,2008,38(1):41-55．

[10]CHEN C,LI JY,GUAN X.Optimization of growth medium for bacillus thuringiensis using rotational-combinational design[J].Journal of Fujian Agriculture and Forestry University,2005,34(1):34-36.

[11]艾冰花,李秉鈞,馮俊榮.一株產(chǎn)蛋白酶芽孢桿菌紫外誘變育種的初步研究[J].漁業(yè)現(xiàn)代化,2015,42(4):39-43.

[12]史瑋,孫瑩,徐振斌.凱氏定氮法測定糧食蛋白質(zhì)含量方法研究[J].糧食科技與經(jīng)濟,2013,38(5):31-32.

[13]王玉玲,丁淑芬,宋巖,等.索氏抽提法測定粗脂肪含量方法的探討[J].糧食加工,2014,39(5):76-77.

[14]大連輕工業(yè)學院.食品分析[M].北京:中國輕工業(yè)出版社,1994:234-235.

[15]艾冰花,艾麗花,陳琳,等.響應(yīng)面法優(yōu)化鲅魚抗氧化肽發(fā)酵條件[J].漁業(yè)現(xiàn)代化,2016,43(2):56-61.

[16]溫建豐,楊文鴿,徐大倫.響應(yīng)面法優(yōu)化花蟹肉制備抗氧化肽的酶解工藝[J].核農(nóng)學報,2013,27(12):1881-1886.

[17]吳永沛,劉明,倪輝.大豆抗氧化活性肽固態(tài)發(fā)酵工藝優(yōu)化[J].中國食品學報,2007(6):52-57.

[18]鄭毅,張志國,關(guān)雄.蘇云金芽孢桿菌蛋白酶發(fā)酵動力學模型的構(gòu)建[J].生物數(shù)學學報，2008,23(4):727-734.

[19]PHANTURAT P,BENJAKUL S,VISESSANGUAN W,et al.Use of pyloric caeca extract from bigeye snapper (Priacanthusmacracanthus) for the production of gelatin hydrolysate with antioxidant activity[J].LWT-Food Science and Technology,2010,43(1):86-97.

[20]姜艷喜,張建友,丁玉庭.魷魚副產(chǎn)物自溶水解過程的生化變化及其機理[J].食品工業(yè)科技,2010,31(12):142-145.

Study on the optimal conditions of preparing antioxidant hydrolysate from Atlantic salmon processing wastes usingBacillusThuringiensis

CHEN Lin1,LI Bingjun1,FENG Junrong1,YU Benshu2,HAN Gongwen3

(1SchoolofOcean,YantaiUniversity,Yantai264005,China;2ShandongHyelrobrosConservationandManagementCenter,Yantai264005,China;3LongkouAquacultureTechnologyExtendingStation,Longkou265700,China)

There are abundant proteins that are of high value in the processing residues of Atlantic salmon (Salmosalar); to avoid waste and environmental pollution caused by throwing them away,and to improve their comprehensive utilization value,the research was conducted where the dry powder made from Atlantic salmon processing residues were hydrolyzed byBacillusThuringiensisto produce antioxidant hydrolysate.The reaction conditions of the enzymatic hydrolysis including material-to-solvent ratio,inoculum quantity,time,temperature,pH and cell age were investigated.Firstly the best single factor was found by comparing the total antioxidant activity and amino nitrogen concentration; then based on single factor experiment and taking the degree of hydrolysis and the total antioxidant activity as indicators,orthogonal experimental design method was used to optimize the hydrolysis conditions,and the optimal conditions were determined by as follows:material-to-solvent ratio 0.7 g/50 mL,inoculum quantity 3%,time 72 h,temperature 30 ℃,pH 6.6 and cell age 48 h; under such conditions the total antioxidant activity and degree of hydrolysis were 503.59 U and 17.29%,respectively.In conclusion,it is feasible and practical to prepare antioxidant hydrolysate from Atlantic salmon processing wastes usingBacillusThuringiensis.

Atlantic salmon; processing wastes;bacillusthuringiensis; enzymolysis; antioxidant hydrolysate; orthogonal experiment

10.3969/j.issn.1007-9580.2016.05.006

2016-07-03

2016-09-20

山東省科技發(fā)展計劃項目(2012GHY11515)

陳琳(1987—)，男，碩士研究生，研究方向：水生生物學。E-mail：641584489@qq.com

李秉鈞(1961—)，男，教授，研究方向：水產(chǎn)養(yǎng)殖學、遺傳育種學、海洋生物技術(shù)。E-mail：li6234307@163.com

TS254.9

A

1007-9580(2016)05-028-08