錢正月，李 俊，黃 成，孟曉明，馬陶陶，陳昭琳

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◇藥學(xué)研究◇

梔子柏皮湯不同配伍對四氯化碳誘導(dǎo)肝纖維化小鼠的治療作用

錢正月1,2,3，李 俊1,2,3，黃 成1,2,3，孟曉明1,2,3，馬陶陶1,2,3，陳昭琳1,2,3

目的 研究梔子柏皮湯不同配伍組合的抗肝纖維化藥理作用。方法 采用四氯化碳(CCl4)引起的肝纖維化小鼠模型觀察梔子柏皮湯各配伍組的抗肝纖維化作用，同時(shí)給予不同配伍的梔子柏皮湯進(jìn)行灌胃治療。生化檢測相關(guān)肝纖維化及炎癥指標(biāo)，運(yùn)用Masson染色和HE染色檢測肝纖維化的變化，Western blot 法檢測Ⅰ型膠原及α-橫紋肌肌節(jié)肌動(dòng)蛋白(α-SMA)的表達(dá)水平。結(jié)果 梔子柏皮湯及各配伍組均可不同程度的降低小鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶 (AST)、羥脯氨酸(Hyp)及透明質(zhì)酸(HA)水平，改善肝臟的病理變化，其中梔子黃柏甘草配伍組抑制 CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化效果最佳(P<0.01)，并能顯著抑制肝組織中Ⅰ型膠原和α-SMA的蛋白表達(dá)(P<0.01)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明梔子柏皮湯亦可明顯降低血清中轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)的表達(dá)水平。結(jié)論 梔子柏皮湯不同配伍組能不同程度改善小鼠肝纖維化，但梔子黃柏甘草配伍，即全湯組抗肝纖維化作用最明顯，并且梔子柏皮湯的抗肝纖維化作用可能與降低TGF-β水平有關(guān)。

梔子柏皮湯；配伍；肝纖維化；α-平滑肌肌動(dòng)蛋白

肝纖維化是因多種原因誘導(dǎo)所引起的慢性肝臟類疾病，若不積極治療，將發(fā)展為肝硬化甚至肝癌。此類疾病已引起越來越廣泛的重視,但在臨床工作中尚無有效的藥物治療方法，因而越來越多的人把目光轉(zhuǎn)向了中藥治療。梔子柏皮湯源自漢代名醫(yī)張仲景著的《傷寒論》，由梔子、黃柏和甘草按照君臣佐使的配伍原則以10 ∶6 ∶3的比例煎煮而成，主要用于治療濕熱黃疸、抗炎解熱等[1]。梔子柏皮湯在肝臟疾病治療方面已見一些報(bào)道[2-3]，但其在肝纖維化小鼠模型的配伍方面研究較少。并且該研究采取的四氯化碳(CCl4)誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化模型用作抗肝纖維化藥物的篩選和評價(jià)已見諸多報(bào)道[4]。該研究探討了梔子柏皮湯不同成分配伍對CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠的保護(hù)作用及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康ICR小鼠90只，普通級，雄性，(20±2)g，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。小鼠飼養(yǎng)在籠中，隔天更換飼料飲水，自由飲水和攝食，保持室溫(22±1)℃，相對濕度 40%～60%，常規(guī)飼養(yǎng)觀察 1 周后用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥品與試劑 梔子柏皮湯的主要成分梔子、黃柏和甘草均購自安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科，由安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院金涌教授鑒定為正品。谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase, ALT)測定試劑盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase, AST)測定試劑盒 、羥脯氨酸(hydroxyproline, Hyp)測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；透明質(zhì)酸(hyaluronic acid, HA) 測定試劑盒、轉(zhuǎn)化生長因子-β(transfoming growth factor-β,TGF-β)購自上海源葉生物有限公司；Ⅰ型膠原購自美國Southernbiotech公司；α-橫紋肌肌節(jié)肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)購自北京Bioss公司。

1.3 分組造模與藥物制備 90只小鼠隨機(jī)分為6組：正常組、模型組、梔子組、梔子+黃柏組、梔子+甘草組、梔子+黃柏+甘草組，每組各 15只。將小鼠皮下注射 20% CCl4(2 ml/kg，用橄欖油1 ∶4稀釋)，每周2次，持續(xù)4周，形成穩(wěn)定的肝纖維化動(dòng)物模型。從注射第3周開始采用梔子柏皮湯各配伍組灌胃給藥14 d(每周2次，持續(xù)2周)，正常組給予等體積的橄欖油，直至4周實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)停止給藥。各組均于4周后麻醉處死小鼠，解剖后從腹主動(dòng)脈取血，4 ℃保存及時(shí)檢測，并且收集肝臟標(biāo)本，生理鹽水洗滌后一部分用4%多聚甲醛固定待用，另一部分肝臟標(biāo)本采用液氮速凍并置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

稱取梔子50 g，一煎加藥材量的8倍水，沸騰后煎30 min，20層紗布過濾，再煎加藥材量的8倍水，沸騰后再煎20 min，過濾，兩煎所得濾液混合后蒸餾濃縮至原生藥量1 g/ml，4 ℃保存待用，此為梔子組。稱取梔子50 g、黃柏30 g，同以上方法煎煮，制成約合原生藥量1 g/ml 濃縮液，此為梔子+黃柏組。再次分別稱取梔子50 g、甘草15 g，以及梔子50 g、黃柏30 g、甘草15 g，濃縮所得分別為梔子+甘草組、梔子+黃柏+甘草組。

1.4 血清學(xué)肝功能測定以及肝纖維化指標(biāo)、炎癥指標(biāo)的檢測 取血后室溫靜置1 h，3 000 r/min離心15 min，分離血清。分別按試劑盒操作檢測ALT、AST、Hyp、HA以及TGF-β。

1.5 Western blot 檢測各組肝臟組織中Ⅰ型膠原和α-SMA蛋白的表達(dá) 取適量肝組織置冰冷的裂解液中收取總蛋白，用 BCA 蛋白濃度測定試劑盒進(jìn)行蛋白定量后，蛋白樣品與上樣緩沖液共同煮沸10 min。采用5%濃縮膠和10%分離膠，用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳并轉(zhuǎn)印至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉3 h。分別與Ⅰ型膠原和α-SMA一抗4 ℃孵育過夜；二抗1 ∶10 000，內(nèi)參采用甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)。ECL發(fā)光試劑顯影，灰度成像軟件測定光密度值以計(jì)算蛋白表達(dá)水平。

1.6 肝臟組織病理學(xué)檢查 用4%多聚甲醛溶液固定的肝組織，經(jīng)常規(guī)脫水后，石蠟包埋、切片，進(jìn)行HE染色和Masson染色，在熒光顯微鏡下觀察肝組織纖維化程度。

2 結(jié)果

2.1 小鼠生存狀態(tài)比較 正常組小鼠4周內(nèi)反應(yīng)靈活，活動(dòng)正常，飲食飲水正常，毛發(fā)無脫落受損。與正常組相比，模型組隨著造模時(shí)間延長，反應(yīng)遲鈍，厭食少動(dòng)，毛發(fā)散亂，生活狀態(tài)比正常組明顯下降。但是與模型組相比，加藥組小鼠生活狀態(tài)有所改善。

2.2 小鼠血清學(xué)肝功能指標(biāo)的變化 與正常組比較，模型組血清中ALT、AST活性顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型組比較，梔子柏皮湯組能顯著降低小鼠血清ALT、AST的含量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表1。

表1 梔子柏皮湯及其配伍組對肝纖維化模型小鼠血清ALT、AST 水平的影響

與正常組比較：**P<0.01；與模型組比較:#P<0.05，##P<0.01

2.3 小鼠肝組織病理學(xué)變化的影響 組織病理學(xué)分析結(jié)果顯示，正常組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞呈索狀排列結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞無明顯壞死情況，未見肝竇異常、脂肪變性和壞死。而模型組肝損傷較重，間質(zhì)明顯增生，肝細(xì)胞索狀排列紊亂，清晰可見肝細(xì)胞點(diǎn)狀壞死以及炎性細(xì)胞浸潤，纖維間隔明顯形成，膠原明顯沉積。但使用梔子柏皮湯不同配伍組治療后，肝細(xì)胞壞死以及炎性細(xì)胞浸潤有所減少，中央靜脈和匯管區(qū)僅存在少許膠原纖維，肝細(xì)胞壞死以及纖維組織增生情況明顯改善，見圖1。以上結(jié)果表明梔子柏皮湯各配伍組均可不同程度地改善CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝臟的病理損傷。

2.4 小鼠肝纖維化指標(biāo)的變化 與正常組相比，模型組小鼠血清HA和Hyp的含量顯著增加(P<0.05)，但是與模型組相比，加藥組則明顯降低，梔子+黃柏+甘草組降低更明顯，但還未恢復(fù)到正常水平(P<0.01)。以上結(jié)果表明，梔子柏皮湯各配伍組均可不同程度地降低HA和Hyp的血清含量，進(jìn)一步提示梔子柏皮湯可能對纖維化的治療有一定作用，見圖2。

圖1 梔子柏皮湯及其配伍組對 CCl4致肝纖維化小鼠肝組織病理變化的影響 ×100

2.5 小鼠肝組織Ⅰ型膠原和α-SMA蛋白的表達(dá)變化 Western blot檢測結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組兩種蛋白的相對密度值均顯著升高(P<0.05)；而與模型組相比，加藥組明顯下調(diào)兩種蛋白的表達(dá)，梔子+黃柏+甘草組降低更明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖3。以上結(jié)果表明，梔子柏皮湯各配伍組可不同程度地降低肝纖維化相關(guān)蛋白Ⅰ型膠原和α-SMA的表達(dá)，進(jìn)一步證明了梔子柏皮湯可能對肝纖維化有一定程度的治療作用。

2.6 小鼠血清中TGF-β活性的變化 用ELISA法檢測小鼠血清中TGF-β的變化，模型組小鼠血清中TGF-β活性顯著高于正常組(P<0.01)，與模型組比較, 梔子柏皮湯各配伍組能顯著降低小鼠血清TGF-β的含量(P<0.01)，提示梔子柏皮湯對肝纖維化的治療作用可能與降低TGF-β的活性有關(guān)，見圖4。

圖2 梔子柏皮湯及其配伍組對肝纖維化模型小鼠血清HA以及Hyp水平的影響

A：血清中HA含量；B：血清中Hyp含量；1：正常組；2：模型組；3：梔子組；4：梔子+黃柏組；5：梔子+甘草組；6：梔子+黃柏+甘草組；與正常組比較：*P<0.05；與模型組比較：##P<0.01

圖3 梔子柏皮湯及其配伍組對CCl4致肝纖維化小鼠肝組織Ⅰ型膠原和α-SMA蛋白變化的影響

1：正常組；2：模型組；3：梔子組；4：梔子+黃柏組；5：梔子+甘草組；6：梔子+黃柏+甘草組；與正常組比較：*P<0.05，**P<0.01; 與模型組比較：##P<0.01

圖4 梔子柏皮湯及其配伍組對肝纖維化模型小鼠血清TGF-β水平的影響

1：正常組；2：模型組；3：梔子組；4：梔子+黃柏組；5：梔子+甘草組；6：梔子+黃柏+甘草組；與正常組比較：**P<0.01; 與模型組比較:#P<0.05，##P<0.01

3 討論

肝纖維化是由多種因素引起肝細(xì)胞壞死，纖維結(jié)締組織沉積異常而導(dǎo)致的慢性肝臟損傷。而注射CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化模型是最常用的肝纖維化模型[5]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與正常組比較，模型組小鼠血清ALT、AST以及HA、Hyp水平明顯升高，組織病理學(xué)分析結(jié)果顯示，模型組小鼠肝損傷較重，并且模型組Ⅰ型膠原和α-SMA蛋白的表達(dá)水平也明顯升高。以上結(jié)果說明CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化模型已成功復(fù)制。迄今為止，雖然治療肝纖維化的藥物繁多，但治療效果并不理想，因而中藥治療成為研究和臨床治療的熱點(diǎn)。梔子柏皮湯用于治療肝臟類疾病歷史悠久，但其在肝纖維化小鼠模型的配伍研究方面卻鮮見報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)主要從這些方面展開研究。

造模期間，模型組小鼠的行為習(xí)慣均異于正常組，表現(xiàn)出行動(dòng)遲緩，毛發(fā)散亂，厭食少動(dòng)，而加藥組小鼠則表現(xiàn)得相對正常。當(dāng)肝臟受到損害，肝功能發(fā)生改變，通過檢測肝細(xì)胞內(nèi)相關(guān)酶的變化可對肝細(xì)胞的受損程度進(jìn)行評價(jià)，目前常用的檢測指標(biāo)有ALT、AST等[6]。血清學(xué)研究結(jié)果表明，模型組小鼠ALT、AST 水平均明顯高于正常組，與模型組相比，加藥組均可不同程度降低ALT、AST水平，并且梔子、黃柏和甘草三種藥物的配伍組保護(hù)作用更明顯，初步證明其對CCl4所致的小鼠肝纖維化可能有不同程度地保護(hù)作用。組織病理學(xué)分析結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了以上結(jié)論，與正常組相比，模型組膠原沉積，纖維組織增生，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重。與模型組相比，加藥組則趨向于正常，肝纖維化程度明顯減輕。HA和Hyp是目前肝纖維化的主要血清標(biāo)志物，其升高程度與纖維化和炎癥程度呈正相關(guān)[7]。本研究顯示與正常組相比，模型組小鼠血清HA和Hyp的含量顯著增加，表明模型組肝纖維化的形成和炎癥的產(chǎn)生，但是與模型組相比，加藥組則明顯降低，表明加藥后小鼠的肝纖維化程度和炎癥程度有所減輕。Ⅰ型膠原、α-SMA的表達(dá)水平是反映藥物對肝纖維化治療效果的直接指標(biāo)[8]。而蛋白表達(dá)水平表明，與正常組相比，模型組蛋白表達(dá)明顯升高，加藥后，蛋白表達(dá)較模型組呈降低的趨勢。上述結(jié)果說明，梔子柏皮湯能降低肝臟損傷的程度，抑制肝纖維化的進(jìn)展。

TGF-β被普遍認(rèn)為是主要的促肝纖維化細(xì)胞因子，其表達(dá)水平可反映肝纖維化程度及組織炎癥壞死程度[9]。本研究中也發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，模型組TGF-β的表達(dá)顯著升高，而加藥組其表達(dá)呈逐漸降低趨勢，并且梔子、黃柏和甘草組作用最佳。因此，本研究認(rèn)為梔子柏皮湯可能是通過調(diào)節(jié)小鼠肝臟TGF-β的表達(dá)來發(fā)揮其抗肝纖維化的作用。

本研究結(jié)果證明了在 CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化模型中，梔子柏皮湯能夠明顯抑制肝臟纖維化的進(jìn)展，減輕肝臟的損傷，并且在本實(shí)驗(yàn)中，梔子、黃柏、甘草的配伍組合治療效果最佳，進(jìn)一步證實(shí)了傳統(tǒng)湯劑配伍的合理性。

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Therapeutical effects of Zhizi Bopi Decoction and its compatibility on CCl4induced hepatic fibrosis in mice

Qian Zhengyue1,2,3, Li Jun1,2,3, Huang Cheng1,2,3, et al

(1School of Pharmacy,Anhui Medical University,2Anhui Key Laboratory of Bioactivity of Natural Products,3Anhui Institute of Innovative Drugs, Hefei 230032)

Objective To study the anti-hepatofibrotic effects of Zhizi Bopi Decoction and its compatibility on liver fibrosis. Methods The model of mouse liver fibrosis which was induced by carbon tetraehlofide (CCl4) was used to investigate the effects of Zhizi Bopi Decoction and its compatibility by gavage. Indicators of hepatic fibrosis and inflammation were detected with automated biochemistry analyzer and liver fibrosis of the mice was assessed by Masson staining and HE staining. Meanwhile, the protein levels of collagen typeⅠ and α-smooth muscle actin (α-SMA) were evaluated by Western blot analysis. Results Zhizi Bopi Decoction and each different treatment group could evidently inhibit the increased serum alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), hydroxyproline (Hyp) and hyaluronic acid (HA) activities, and improve the pathological changes of mouse livers. Furthermore, the therapeutic effects on liver fibrosis induced by CCl4in mice were primarily ascribed to the synergic effect ofGardeniajasminoidesEllis,CortexphellodendriandGlycyrrhizaeRadixetRhizoma(P<0.01). And they could obviously reduce the protein expression levels of collagen typeⅠ and α-SMA in the liver (P<0.01). In addition, Zhizi Bopi Decoction could also obviously reduce the contents of transforming growth factor-beta (TGF-β). Conclusion Zhizi Bopi Decoction and its compatibility all perform significant anti-fibrotic effects on the liver in different degree, but the compatibility ofGardeniajasminoidesEllis,CortexphellodendriandGlycyrrhizaeRadixetRhizomaexert the most distinctly anti-fibrotic effects among them, possibly by reducing the contents of TGF-β.

Zhizi Bopi Decoction; compatibility; hepatic fibrosis; α-SMA

時(shí)間：2015-12-30 14:38

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20151230.1438.032.html

國家自然科學(xué)基金(編號:81473526、81202978)；高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)基金(編號:20123420120001)；安徽省科技攻關(guān)計(jì)劃(編號:1301042212)；安徽省自然科學(xué)基金(編號:1308085MH145)

1安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院、2安徽天然藥物活性研究省級實(shí)驗(yàn)室、3安徽創(chuàng)新藥物產(chǎn)業(yè)共性研究院，合肥 230032

錢正月，女，碩士研究生；

李 俊，男，教授，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail:lj@ahmu.edu.cn

R 285

A

1000-1492(2016)01-0068-05

2015-10-22接收