馬會明，張永芳，王蒙蒙，李昀伽，蒲 靜，于 佳，王燕蓉，裴秀英，徐 仙

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生長分化因子-9下調(diào)對小鼠卵巢顆粒細(xì)胞增殖能力的影響

馬會明，張永芳，王蒙蒙，李昀伽，蒲 靜，于 佳，王燕蓉，裴秀英，徐 仙

目的 探討生長分化因子-9(GDF9)對小鼠卵巢顆粒細(xì)胞增殖能力基因周期蛋白A(cyclin A)、周期蛋白D1(cyclin D1)和周期蛋白依賴性激酶抑制因子27(p27kip1)表達的影響。方法 利用CCK-8檢測法檢測細(xì)胞的增殖能力；使用流式細(xì)胞術(shù)、Real-time PCR和Western blot法驗證GDF9 siRNA的干擾效率；采用Real-time PCR和Western blot法檢測細(xì)胞增殖cyclin A、cyclin D1和p27kip1 mRNA和蛋白表達情況。結(jié)果 GDF9 siRNA顯著抑制顆粒細(xì)胞增殖活力，其中72 h抑制最明顯(P<0.05)；Real-time PCR和Western blot法檢測結(jié)果顯示GDF9 siRNA顯著下調(diào)小鼠卵巢顆粒細(xì)胞中GDF9 mRNA及蛋白的表達(P<0.01)；Real-time PCR法檢測結(jié)果顯示，細(xì)胞cyclin A、cyclin D1 mRNA表達降低，p27kip1 mRNA表達增強；Western blot法結(jié)果顯示，GDF9 siRNA可促進細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p27kip1的表達，同時下調(diào)G2/M期調(diào)控蛋白cyclin A、cyclin D1的表達。結(jié)論 靶向抑制小鼠卵巢顆粒細(xì)胞中GDF9的表達，下調(diào)細(xì)胞cyclin A、cyclin D1的表達，上調(diào)P27 kip1的表達，顯著抑制細(xì)胞的增殖。

GDF9 siRNA；細(xì)胞增殖；細(xì)胞周期；卵巢顆粒細(xì)胞；小鼠

女性卵巢儲備功能減退原因可能與顆粒細(xì)胞一系列重要的信號分子和周期蛋白調(diào)控有關(guān)[1-2]， 細(xì)胞周期蛋白和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinases，CDK)抑制劑在調(diào)控細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換過程中具有重要作用[3]，其中細(xì)胞周期D1(cyclin D1)和細(xì)胞周期A(cyclin A)的首要功能主要是促進細(xì)胞增殖[4]。CDK抑制蛋白p27(p27kip1)是一種CDK抑制劑，通過抑制cyclin D/CDK4、cyclinE/CDK2 的活性，從而抑制細(xì)胞增殖活性[5-6]，使細(xì)胞失去分裂能力。在卵母細(xì)胞的成熟過程中GDF9作為一個旁分泌因子參與調(diào)節(jié)卵丘顆粒細(xì)胞擴展的過程[7]。該研究通過GDF9基因沉默對小鼠顆粒細(xì)胞中cyclin D1、cyclin A和p27kip1表達的檢測，旨在探討小鼠顆粒細(xì)胞細(xì)胞周期調(diào)控蛋白在細(xì)胞增殖分化機制中的作用，為卵母細(xì)胞發(fā)育機制提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR(Real-time PCR,RT-PCR)試劑盒均購自日本TaKaRa 公司；實時熒光定量PCR (Real-time PCR) 試劑盒、TRIzol、DMEM/F12(1 ∶1)、Ⅰ型膠原酶、胎牛血清均購自美國Life Tech公司；兔來源cyclin A、cyclin D1及p27kip1單克隆抗體購自英國Abcam公司；β-actin兔單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司；羊抗兔二抗及ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自中國博士德生物公司；蛋白提取試劑盒購自南京凱基生物試劑公司；重組pcDNA 6.2-GDF9 siRNA(簡稱GDF9 siRNA)質(zhì)粒、siRNA轉(zhuǎn)染專用試劑HiPerFect購自美國Qiagen公司； 680型酶標(biāo)儀購自美國Bio-rad儀器公司；FACSCalibur型流式細(xì)胞儀購自美國BD公司；普通PCR儀和GelDoc XR System凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bio-rad儀器公司；Real-time PCR儀購自美國ABI公司；BX51熒光倒置顯微鏡購自日本OLYMPUS公司。

1.2 小鼠卵泡顆粒細(xì)胞的獲得 取18～22 g 未成熟的雌性Bal小鼠30只(寧夏醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心)，按照常規(guī)方法[8]每只腹腔注射孕馬血清(PMSG) 5 IU，注射42 h后在無菌條件下迅速剖取卵巢放入無菌的PBS 中，去除卵巢周圍組織及表面包膜，PBS清洗后置于TCM199-Hepes培養(yǎng)基中。用不銹鋼針刺破卵巢表面的3～8 mm卵泡, 使顆粒細(xì)胞釋放于TCM199-Hepes培養(yǎng)基中。1 000 r/min 低速離心5 min，洗滌2次。將生長培養(yǎng)基TCM199 (含100 IU/ml雙抗、10% FBS、10 ng/ml EGF) 加入細(xì)胞團并制成單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞接種在 6 孔培養(yǎng)板中，在5% CO2、37.5 ℃條件下孵育24 h。鏡下觀察是否污染及細(xì)胞的生長情況, 去除未貼壁細(xì)胞。此后隔日換液1次。所有動物實驗均遵循實驗動物的倫理要求和實驗動物管理條例。

1.3 顆粒細(xì)胞轉(zhuǎn)染及最適條件確定 小鼠顆粒細(xì)胞貼壁24 h后，開始轉(zhuǎn)染，按照質(zhì)粒GDF9 siRNA DNA量和HiPerFect量為1.5 μg和12 μg設(shè)計實驗；每組設(shè)置3個復(fù)孔，轉(zhuǎn)染后48 h換生長培養(yǎng)基TCM199。在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染情況，用PBS充分洗滌去除漂浮的死細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀分析轉(zhuǎn)染率，確定最佳轉(zhuǎn)染時間。轉(zhuǎn)染率(%)=綠色熒光細(xì)胞/細(xì)胞總數(shù)×100%。轉(zhuǎn)染設(shè)計分為空質(zhì)粒siRNA control組和blank control組及GDF9 siRNA組。

1.4 小鼠顆粒細(xì)胞增殖情況的確定 按照常規(guī)方法[8]將分離純化的小鼠顆粒細(xì)胞接種至96孔培養(yǎng)板，使每孔細(xì)胞密度為1×104個，按照實驗設(shè)計，每組設(shè)3個平行孔，并設(shè)不含細(xì)胞的空白對照，37 ℃培養(yǎng)24 h使細(xì)胞貼壁。然后根據(jù)上述方法開始轉(zhuǎn)染GDF9 siRNA及對照siRNA，轉(zhuǎn)染48 h后，按照CCK-8試劑盒使用說明每孔加入10 μl CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，檢測波長為450 nm下的光密度(optical density，OD)值。

1.5 反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)和Real-time PCR法檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞中mRNA的表達 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48 h，清洗、消化細(xì)胞后按照常規(guī)方法(9)分別提取總RNA，并用Oligo(dT)反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。利用GDF9、cyclin A、cyclin D1和p27kip1 mRNA特異性引物(表1)，擴增特異性條帶。RT-PCR擴增反應(yīng)結(jié)束后用2%的瓊脂糖凝膠檢測擴增的條帶大小；Real-time PCR反應(yīng)以β-actin mRNA的表達作為內(nèi)參，每組平行試驗重復(fù)3次，計算基因的相對表達量并用2-ΔΔCt法表示，各組的Ct值均經(jīng)β-actin校正，以正常組的表達作為100%。

1.6 Western blot 法檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞中蛋白表達 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48 h，清洗、消化細(xì)胞并裂解細(xì)胞全蛋白，按照常規(guī)方法[9]用BCA法測定濃度并定量，取 50 μg 蛋白樣品按照常規(guī)方法進行聚丙烯酰胺凝膠電泳, 并濕轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，封閉液封閉后，分別加入一抗cyclinA、cyclinD1和p27kip1 (1 000 ∶1)，4 ℃孵育過夜；漂洗后加入相應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗 (2 000 ∶1)，37 ℃室溫孵育1 h，增強化學(xué)發(fā)光顯色系統(tǒng)ECL顯色，曝光。以β-actin作為等量蛋白質(zhì)上樣對照，每個樣本至少重復(fù)3 遍，曝光圖片經(jīng)GelDoc XR System凝膠成像系統(tǒng)掃描后，計算條帶的吸光度，cyclin A、cyclin D1和p27kip1 蛋白相對表達采用與β-actin吸光度比值來表示。

表1 Real-time PCR相關(guān)基因的引物序列及參數(shù)

2 結(jié)果

2.1 GDF9 siRNA對小鼠卵巢顆粒細(xì)胞干擾后干擾效率的檢測 分離純化的小鼠卵巢顆粒細(xì)胞用GDF9 siRNA和無關(guān)序列siRNA control分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞，48 h 后更換為正常培養(yǎng)基TCM199，熒光顯微鏡下觀察(圖1A)，經(jīng)流式細(xì)胞儀分析GDF9 siRNA和siRNA control兩組細(xì)胞，約有70%以上卵巢顆粒細(xì)胞已經(jīng)表達綠色熒光蛋白(圖1B、1C)，能滿足后續(xù)表達調(diào)控分析的要求。GDF9 siRNA和siRNA control轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h 后，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄后采用Real-time PCR檢測GDF9 mRNA的表達。結(jié)果表明，GDF9 siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞GDF9 mRNA表達顯著下調(diào)(F=33.058，P<0.05)，siRNA control轉(zhuǎn)染細(xì)胞GDF9 mRNA表達沒有顯著變化(圖1D)。

圖1 GDF9 siRNA轉(zhuǎn)染顆粒細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率分析

A：顆粒細(xì)胞原代轉(zhuǎn)染×100；B：siRNA control轉(zhuǎn)染效率；C：GDF9 siRNA轉(zhuǎn)染效率；D：GDF9轉(zhuǎn)染后基因沉默檢測;與siRNA control和blank control比較：*P<0.05

2.2 siRNA干擾顆粒細(xì)胞GDF9基因表達對細(xì)胞增殖的影響 顆粒細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)GDF9 siRNA顆粒細(xì)胞開始表現(xiàn)為細(xì)胞輪廓稍有萎縮，細(xì)胞漂浮物變多。CCK-8法檢測結(jié)果顯示：siRNA control與blank control相比，siRNA control轉(zhuǎn)染后48 h的OD值降低，GDF9 siRNA與siRNA control和blank control組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=5.321，P<0.05)。見圖2。

2.3 siRNA干擾顆粒細(xì)胞GDF9對cyclin A、cyclin D1和p27kip1 mRNA表達的影響 GDF9 siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后, RT-PCR分別擴增出特異性cyclin A、cyclin D1和p27kip1片段，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖3A，擴增的條帶大小與理論片段大小一致；Real-time PCR分析檢測cyclin A、cyclin D1和p27kip1基因表達情況 (圖3B)。siRNA control與blank control組相比較，cyclin A、cyclin D1和p27kip1基因表達無顯著性差異。干擾GDF9后p27kip1的mRNA表達量顯著上升 (F=259.165，P<0.05)；干擾GDF9后cyclin D1的mRNA表達顯著下降(F=17.224，P<0.05)；cyclin A的mRNA表達量降低，但沒有顯著性變化。

圖2 CCK-8法檢測GDF9 siRNA 對細(xì)胞增殖的影響

圖3 GDF9 siRNA 對p27 kip1、cyclin D1及cyclin A mRNA表達的影響

A：瓊脂糖凝膠電泳擴增結(jié)果；B：Real-time PCR分析結(jié)果；1: cyclin A; 2: cyclin D1; 3: p27kip1;與blank control組比較：*P<0.05

2.4 siRNA干擾顆粒細(xì)胞GDF9對cyclin A、cyclin D1和p27kip1 蛋白表達的影響 Western blot檢測顯示，干擾GDF9后，可顯著增加p27kip1蛋白的表達(F=123.564，P<0.05)，cyclin D1蛋白的表達明顯下降(F=11.237，P<0.05)。但干擾GDF9 后，cyclin A蛋白表達下降，但是沒有顯著性改變。見圖4。

圖4 GDF9 siRNA 對p27kip1、cyclin D1及cyclin A 蛋白表達的影響

1:blank control組; 2:siRNA control組; 3:GDF9 siRNA組；與blank control組比較：*P<0.05

3 討論

在正常卵巢的周期性卵泡發(fā)育過程中, 卵泡發(fā)育與顆粒細(xì)胞增殖分化和凋亡密切相關(guān)。GDF9對卵泡發(fā)育有重要作用的細(xì)胞因子，可以通過多個信號通路促進顆粒細(xì)胞增殖過程[7]。本研究中利用RNA干擾技術(shù)沉默GDF9基因的表達，達到抑制顆粒細(xì)胞增殖，首先發(fā)現(xiàn)靶向GDF9的siRNA對顆粒細(xì)胞干擾效果明顯，GDF9基因表達量明顯降低，能夠通過細(xì)胞周期蛋白表達研究卵巢顆粒細(xì)胞增殖，為研究PCOS患者卵巢顆粒細(xì)胞黃素化和凋亡的機制提供實驗依據(jù)，為研究細(xì)胞周期調(diào)控的相關(guān)信號通路奠定基礎(chǔ)。

細(xì)胞周期是與細(xì)胞生長增殖極其相關(guān)的一系列細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)過程，在這一重要過程中有許多關(guān)鍵的因子調(diào)控細(xì)胞的進程，這些分子包括cyclin D1、cyclin A和p27kip1等，正常的細(xì)胞周期有序的循環(huán)是通過激活和失活CDK來實現(xiàn)的。cyclinD1作為細(xì)胞周期進程的啟動子，是調(diào)控細(xì)胞周期G1期的關(guān)鍵蛋白，能夠促進細(xì)胞的生長增殖。cyclin A在細(xì)胞周期中的G1-S和G2-M時相中均發(fā)揮了作用，能夠以有活性的cyclin A-CDK-2復(fù)合物的形式促進細(xì)胞的增殖[10]。本研究結(jié)果顯示，沉默GDF9基因的表達后，cyclin D1的mRNA和蛋白表達顯著下降，導(dǎo)致細(xì)胞周期進程減慢，抑制細(xì)胞生長增殖。其中，可以與CDK4結(jié)合形成復(fù)合體，通過磷酸化和失活視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白(RB)，促進細(xì)胞周期從G1期到S期的進展，并通過這種方式介導(dǎo)DNA的合成，是一個比其他Cyclins更加敏感的指標(biāo)，對細(xì)胞周期調(diào)控至關(guān)重要[10]。cyclin A可在細(xì)胞周期的不同時相分別與 CDK-1、CDK-2結(jié)合，并激活其活性[11]?？梢粤姿峄疪B蛋白而使E2F游離，活化、細(xì)胞便進入增殖階段[12]。Viglietto et al[13]研究結(jié)果顯示，cyclin A的表達量有一定的降低，但是沒有顯著性下降，p27kip1可以與cyclin E-CDK2、cyclin A-CDK2、cyclin D-CDK4復(fù)合物結(jié)合抑制其對底物的磷酸化作用，使細(xì)胞不能發(fā)生G1～S期的時相轉(zhuǎn)換，停滯于G1期，細(xì)胞增殖停止。本研究結(jié)果顯示，干擾GDF9后， p27kip1的mRNA和蛋白表達量顯著上升，細(xì)胞增殖減緩，因此也證實了p27kip1在介導(dǎo)細(xì)胞外信號，尤其在細(xì)胞增殖及其調(diào)控中扮演負(fù)性調(diào)節(jié)的角色[14]，可能p27kip1在細(xì)胞PI3K 和 Notch通路中參與細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期調(diào)控[15]， 本研究也證實了p27kip1表達上升促進了對cyclin D1的抑制作用，使cyclin D1表達顯著性下降，從而抑制了細(xì)胞的增殖分裂。但是研究中是否存在PI3K/Akt/p27kip1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，顆粒細(xì)胞PI3K通路活性是否受到影響，從而影響細(xì)胞周期的正常調(diào)控，需要進一步對顆粒細(xì)胞進行研究。

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Effect of downregulated growth differential factor-9 on cell proliferative activity in mouse ovarian granulose cell

Ma Huiming，Zhang Yongfang，Wang Mengmeng，et al

(Key Laboratory of Fertility Preservation and Maintenance of Ministry of Education,FertilityCenterforReproductiveMedicine,DeptofAnotomyandHistology-Embryology,NingxiaMedicalUniversity，yinchuan750004)

Objective In the present study, we determined whether GDF9 siRNA were involved in the expressions of cyclin A, cyclin D1 and p27kip1 which were key molecules in controlling cell cycling and cell proliferation by regulating cyclin D1 expression in mouse ovary granulose cell. Methods Real-time PCR and Western blot assay were used to investigate the expressions of cyclin D1, cyclin A, and p27kip1.We further observed the effect of GDF9 siRNA on the cell proliferation by regulating the expressions of cyclin D1, cyclin A, and p27kip1 in mouse ovary granulose cell.Results We found that the expressions of cyclin D1 and cyclin A were down-regulated at both protein and mRNA levels in GDF9 siRNA group while p27kip1 was upregulated by real-time PCR and Western blot assay. Furthermore, GDF9 siRNA had additive effect in down-regulation of cyclin D1,cyclin A and upregulation of p27kip1.Compared with the control group，the expression level of cyclin D1 was significantly decreased(P<0.05)and p27kip1 was significantly increased(P<0.05).Conclusion These data suggest that cell cyclin signal pathway may coordinately regulate the cell proliferation and differentiation processes through up-regulating cyclin D1 and down-regulating p27kip1 of mouse ovary granulose cell.

GDF9 siRNA;cell proliferation;ovary granulose cell;mouse

時間：2015-12-30 14:38

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20151230.1438.024.html

寧夏自然科學(xué)基金(編號：NZ11128)

寧夏醫(yī)科大學(xué)生育力保持教育部重點實驗室、寧夏回族自治區(qū)生殖與遺傳重點實驗室、人體解剖與組織胚胎學(xué)系,寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，銀川 750004

馬會明，男，講師，博士；

裴秀英，女，教授，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：peixiuying@163.com；

R 711.6

A

1000-1492(2016)01-0051-05

2015-09-30接收

徐 仙，男，主任醫(yī)師，教授，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：xux36@163.com