李 亮，彭 瓊，蔡亦紅，戴 夫

?

體外研究人臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞對大鼠枯否細(xì)胞極化的影響

李 亮1，彭 瓊1，蔡亦紅2，戴 夫1

目的 采用脂多糖(LPS)誘導(dǎo)大鼠枯否細(xì)胞(KCs)發(fā)生極化改變，之后用人臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞(huMSCs)與LPS誘導(dǎo)的KCs在Transwell內(nèi)共培養(yǎng),以觀察huMSCs對KCs極化偏移的調(diào)節(jié)作用。方法 實(shí)驗(yàn)分為KCs組、KCs+LPS組、KCs+LPS+MSCs組。對各組的白介素-4(IL-4)、腫瘤壞死因子(TNF-α)、白介素-10(IL-10)、白介素-6(IL-6)等上清因子采用ELISA法進(jìn)行檢測；誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)、精氨酸酶-1(Arg-1)、信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3、6(STAT-3、STAT-6)、核因子kappaB(NF-κB)用Western bolt進(jìn)行檢測，同時(shí)用熒光實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)對以上結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果 KCs+LPS組促炎因子TNF-α、IL-6分泌增加，KCs+LPS+MSCs組抑炎因子IL-10、IL-4分泌增加；而Western blot檢測表明，KCs+LPS組中iNOS升高，NF-κB p65入核增高；而KCs+LPS+MSCs組高表達(dá)Arg-1，同時(shí)pSTAT-3、pSTAT-6表達(dá)增加。結(jié)論 huMSCs能誘導(dǎo)已經(jīng)發(fā)生M1極化的KCs向M2表型偏移，考慮可能與huMSCs分泌細(xì)胞因子有關(guān)，起到一種免疫調(diào)節(jié)作用，huMSCs調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化的分子機(jī)制可能與通過JAK-STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)。

枯否細(xì)胞；人間充質(zhì)干細(xì)胞；免疫調(diào)節(jié)；極化

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell,MSCs)取材方便，易于體外培養(yǎng)增殖，除了多向分化能力，還具有獨(dú)特免疫特性，因此MSCs移植有希望成為很多疾病治療的有效手段。越來越多的研究者認(rèn)為MSCs分泌的細(xì)胞因子和免疫調(diào)節(jié)對肝臟損傷起主要作用[1]。另外MSCs分泌的細(xì)胞因子也具有強(qiáng)大的調(diào)節(jié)作用。近年來MSCs對巨噬細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用的研究也成為熱點(diǎn)。巨噬細(xì)胞參與對抗病原體的第一道防線，各組織的巨噬細(xì)胞具有相對特異性，肝臟的巨噬細(xì)胞稱為KCs，占肝臟非實(shí)質(zhì)細(xì)胞的0.35，占生物體所有實(shí)質(zhì)臟器的巨噬細(xì)胞總數(shù)的0.8～0.9[2]，對各種肝臟疾病的發(fā)病與轉(zhuǎn)歸起重要作用。成熟巨噬細(xì)胞在不同的微環(huán)境中可被誘導(dǎo)分化出不同的表型和功能狀態(tài)，稱為巨噬細(xì)胞的極化。目前很多研究[3-5]已經(jīng)證實(shí)MSCs能促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2方向極化，所以研究巨噬細(xì)胞極化機(jī)制對治療各種肝病具有重要意義。目前人臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord blood mesenchymal stem cells，huMSCs)和大鼠KCs體外共培養(yǎng)尚無報(bào)道，該實(shí)驗(yàn)首先提取大鼠原代KCs，并觀察huMSCs在體外對大鼠KCs偏移極化的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞 普通級健康雄性SD大鼠20只，8～10周齡，(200±20) g，購于蘇州工業(yè)園區(qū)愛爾麥特科技有限公司，室溫下自由進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料、衛(wèi)生飲水，實(shí)驗(yàn)前12 h禁食，6 h前禁水。huMSCs為合肥市濱湖醫(yī)院干細(xì)胞中心劉尚全教授饋贈。

1.2 主要試劑和儀器 青霉素、鏈霉素、胰酶細(xì)胞消化液和谷氨酰胺(上海碧云天生物技術(shù)研究公司)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；Percoll細(xì)胞分離液、臺盼藍(lán)(美國Sigma公司)；APC-CD68抗體(美國eBioscience公司)；HEPA Class l00二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Termo electron corporation)；TSl00倒置顯微鏡(日本Nikon公司)；IX51 熒光倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；AllegraX-30R梯度離心機(jī)(美國Beckman Coulter公司)；6孔細(xì)胞培養(yǎng)板和Transwell(美國Corning公司)；PCR試劑盒(美國AXYGEN公司)；Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit (加拿大Fermentas公司)；PCR Master Mix和二抗 tetramethylrhodamine goat-anti-rabbit IgG(美國Promega公司)；SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(日本TaKaRa公司)；TRIzol(美國Invitrogen公司)；一抗anti-iNOS和anti-STAT6(美國BD Transduction Laboratories公司)；anti-Arg 1、anti-NF-κB p65(美國Santa Cruz公司)，免疫熒光一抗NF-κB p65抗體(英國Abcam公司)；核蛋白提取試劑盒NucBuster Protein Extraction Kit(德國Novagen公司)；磷酸化酶/蛋白酶抑制劑 Protease/Phosphatase Inhibitor Cocktail (美國Cell Signaling公司)。

1.3 大鼠原代KCs的提取及鑒定 SD大鼠吸入乙醚麻醉，酒精消毒，放于無菌托盤，打開腹部和胸腔至見到肝、肺、心臟等器官，結(jié)扎下腔靜脈，行門靜脈插管，以15 ml/min速度灌注PBS液10 min，0.5 mg/ml濃度的IV型膠原酶20 ml原位灌注10 min，取肝臟并剪碎至1 mm小塊。0.5 mg/ml IV型膠原酶30 ml震蕩消化(37 ℃)。用細(xì)胞濾網(wǎng)(200目)濾過，去除未消化的肝臟組織。肝臟細(xì)胞懸液300 r/min離心5 min(4 ℃)，離心2次，棄上清液除去殘留消化酶，再次1 550 r/min離心5 min(4 ℃)，取沉渣重懸，0.30和0.60 percoll密度梯度1 850 r/min離心20 min(20 ℃)；取出乳白色細(xì)胞層，利用KCs貼壁特性進(jìn)一步純化，純化后細(xì)胞以2×106/孔鋪板，進(jìn)一步用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。臺盼藍(lán)染色實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞提取后，立即以10 μl細(xì)胞懸液和90 μl 0.4%臺盼藍(lán)充分混勻，2～3 min后，取10 μl至計(jì)數(shù)板，臺盼藍(lán)染色實(shí)驗(yàn)后顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)。吞墨實(shí)驗(yàn)：用培養(yǎng)24 h后的細(xì)胞加入經(jīng)過濾紙多次過濾并高壓滅菌過的墨汁，6 h后顯微鏡下觀察細(xì)胞的吞噬能力。可見細(xì)胞內(nèi)充滿大小不一的黑色顆粒，但細(xì)胞仍然存活。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面標(biāo)志物 收集KCs，調(diào)整細(xì)胞濃度為(1～2)×106/ml，取50 μl細(xì)胞懸液，加入2 μl FITC-CD68，低速振蕩5 s、混勻，室溫下避光孵育20 min后，加適量PBS洗1次，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

1.5 huMSCs與 KCs在 Transwell內(nèi)共培養(yǎng) 將KCs細(xì)胞以1×106/ml鋪到Transwell(0.4 μm孔徑)的下層，并加入終濃度為1 μg/ml的LPS，培養(yǎng)18 h后，將huMSCs以1×105/孔鋪到Transwell板的上層，將二者共培養(yǎng)18 h，同時(shí)設(shè)置正常培養(yǎng)的KCs組及加入LPS誘導(dǎo)的KCs組以及KCs+LPS+MSCs組。huMSCs和KCs共培養(yǎng)時(shí)，KCs+LPS組同時(shí)加等量DMEM作對照，分別收集各組培養(yǎng)18 h上清液、18 h KCs細(xì)胞蛋白、RNA以便進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.6 ELISA試劑盒檢測上清液相關(guān)細(xì)胞因子 收集各組上清液，用ELISA試劑盒分別檢測IL-6、IL-10、IL-4、TNF-α細(xì)胞因子的水平。采用終濃度為1 μg/ml的LPS與KCs共培養(yǎng)18 h，再與等量DMEM或者h(yuǎn)uMSCs 共培養(yǎng)18 h后檢測各組IL-4、IL-6、IL-10細(xì)胞因子水平。而TNF-α為Transwell內(nèi)與huMSCs共培養(yǎng)18 h后，再以終濃度為1 μg/ml的LPS誘導(dǎo)6 h后再檢測。

1.7 Western blot檢測iNOS、Arg-1、STAT3、p-STAT3、STAT6、p-STAT6、NF-κB p65蛋白表達(dá) 實(shí)驗(yàn)各組KCs中加入磷酸化酶/蛋白酶抑制劑，加入裂解緩沖液提取總蛋白，并按試劑盒說明提取核蛋白。將提取蛋白按100 μg/孔加樣，置于SDS-PAGE凝膠上電泳分離，在硝酸纖維素膜上進(jìn)行轉(zhuǎn)膜、電轉(zhuǎn)、TBST清洗硝酸纖維素膜3次后移至含有封閉液的平皿中，稀釋一抗(1 ∶500)后孵育2 h，后進(jìn)行二抗孵育(1 ∶1 000)，最后化學(xué)發(fā)光，顯影，定影，將膠片進(jìn)行掃描，用凝膠圖象處理系統(tǒng)(Image J)分析目標(biāo)帶的分子量和凈光密度值。用全蛋白裂解液檢測目的蛋白表達(dá)，用GAPDH為內(nèi)參照；用核蛋白裂解液檢測細(xì)胞核內(nèi)NF-κB p65水平，用Histone為內(nèi)參照。

1.8 熒光實(shí)時(shí)定量PCR分析M1/M2相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平 收集各組的KCs細(xì)胞總RNA用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,設(shè)計(jì)引物，用SYBR Green PCR mix試劑盒分別檢測IL-10、IL-6、iNOS、Arg-1 mRNA水平，引物見表1。

表1 熒光實(shí)時(shí)定量PCR所用引物序列

2 結(jié)果

2.1 SD大鼠KCs鑒定 剛提取的KCs成圓形或者橢圓形，透光性好，大小均勻，可見微量雜細(xì)胞。臺盼藍(lán)染色后經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)，細(xì)胞活力為(0.931 1±0.009)(n=3)。培養(yǎng)48 h后可見細(xì)胞貼壁，變得形狀不規(guī)則，部分細(xì)胞呈梭形。培養(yǎng)1周后可見大部分細(xì)胞形態(tài)更加不規(guī)則，貼壁牢固，透光性較前略差。臺盼藍(lán)染色實(shí)驗(yàn)、吞墨實(shí)驗(yàn)以及流式細(xì)胞術(shù)鑒定細(xì)胞活力及純度，經(jīng)檢測活力及純度均大于0.92，可用于下一步實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見圖1。

2.2 各組培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子的表達(dá) KCs+LPS組中的KCs經(jīng)LPS刺激后，促炎因子TNF-α分泌增加，KCs+LPS+MSCs組中的IL-10、IL-4分泌增加。說明KCs+LPS+MSCs組中的KCs高分泌抗炎因子IL-4和IL-10，結(jié)果見圖2。

2.3 各組蛋白表達(dá)情況 KCs+LPS組高表達(dá)iNOS，而KCs+LPS+MSCs組高表達(dá)Arg-1，KCs+LPS+MSCs組可誘導(dǎo)STAT3/STAT6磷酸化；而KCs+LPS組可誘導(dǎo)NF-κB p65磷酸化，促進(jìn)其核轉(zhuǎn)位，見圖3。通過收集KCs+LPS+MSCs組及KCs+LPS組細(xì)胞24 h后的細(xì)胞全蛋白裂解液，經(jīng)Western blot檢測，以正常細(xì)胞為陰性對照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，KCs+LPS+MSCs組高表達(dá)Arg-1，低表達(dá)iNOS；而KCs+LPS組高表達(dá)iNOS，低表達(dá)Arg-1，見圖3。

圖1 SD大鼠KCs的鑒定

A：新提取原代細(xì)胞培養(yǎng)6 h KCs×100；B：KCs臺盼藍(lán)染色圖×100；C：原代培養(yǎng)48 h KCs×200；D： KCs吞墨實(shí)驗(yàn)；E：未經(jīng)CD68染色的正常細(xì)胞作為空白對照組；F：CD68流式抗體染色，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測，分析細(xì)胞的純度大于92%(n=3)

圖2 各組上清液中細(xì)胞因子水平 (n=3)

圖3 各組相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)量A：各組收集全細(xì)胞裂解液用相應(yīng)的抗體進(jìn)行蛋白印跡實(shí)驗(yàn)；用灰度測定法定量分析蛋白印跡結(jié)果并進(jìn)行比較；B：實(shí)驗(yàn)各組收集細(xì)胞全蛋白裂解液(檢測NF-κB p65、NF-κB p-p65)；各組收集細(xì)胞核蛋白裂解液(NF-κB p65)；用灰度測定法定量分析核內(nèi)蛋白印跡NF-κB p-p65結(jié)果；C：收集細(xì)胞核蛋白裂解液(檢測NF-κB p65)；1：KCs組；2：KCs+LPS+MSCs組；3：KCs+LPS組；與KCs組比較： **P<0.01；與KCs+LPS組比較：##P<0.01

2.4 各組iNOS、Arg-1、IL-10、IL-6 mRNA水平 通過熒光實(shí)時(shí)定量PCR對以上結(jié)果中iNOS、Arg-1、IL-10、IL-6 mRNA表達(dá)水平進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示，KCs+LPS+MSCs組高表達(dá)Arg-1、IL-10 mRNA，而KCs+LPS組高表達(dá)iNOS mRNA。KCs+LPS組與KCs+LPS+MSCs組IL-6 mRNA水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖4。

2.5 huMSCs促進(jìn)大鼠KCs向M2方向轉(zhuǎn)化 當(dāng)用LPS誘導(dǎo)KCs時(shí)，KCs高表達(dá)TNF-α，并且Westein blot檢測結(jié)果顯示iNOS高表達(dá)，提示KCs經(jīng)LPS誘導(dǎo)后可以成功向M1表型轉(zhuǎn)化。在此基礎(chǔ)上，用huMSCs與極化的KCs共培養(yǎng)，KCs+LPS+MSCs組高表達(dá)Arg-1，并且上清液細(xì)胞因子IL-10、IL-4濃度明顯增加，提示KCs向M2方向極化。以上結(jié)果經(jīng)熒光實(shí)時(shí)定量PCR鑒定，提示KCs表型發(fā)生改變。為進(jìn)一步研究表型轉(zhuǎn)化機(jī)制，從胞質(zhì)蛋白中提取STAT-3、STAT-6、pSTAT-3、pSTAT-6以及在核內(nèi)和核外提取NF-κB p65。結(jié)果顯示，在靜息狀態(tài)時(shí)，NF-κB p65蛋白主要是位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，LPS能刺激NF-κB p65核轉(zhuǎn)位增加，但與huMSCs共培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)其入核減弱，而NF-κB p-p65入核增多，弱化了炎性基因表達(dá)，提示其參與了KCs的表型轉(zhuǎn)化。因此，可以得知MSCs通過分泌細(xì)胞因子調(diào)節(jié)KCs表型轉(zhuǎn)化。

圖4 各組同一時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞后提取RNA，應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR分析相關(guān)基因的mRNA水平

1：KCs組；2：KCs+LPS組；3： KCs+LPS+MSCs組；與KCs組比較：**P<0.01；與KCs+LPS組比較：#P<0.05，##P<0.01

3 討論

有研究者利用人骨髓MSCs治療豬的爆發(fā)性肝衰竭[6]，所以利用不同種系的細(xì)胞共培養(yǎng)具有可行性。當(dāng)肝臟發(fā)生急性炎癥變化時(shí)，MSCs條件培養(yǎng)基能改變白細(xì)胞浸潤，通過分泌營養(yǎng)因子減少肝細(xì)胞凋亡，增加肝細(xì)胞的增殖，進(jìn)一步發(fā)揮對炎癥部位進(jìn)行修復(fù)作用。MSCs可以引起調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的增加并減少樹突細(xì)胞分泌TNF-α，Th1細(xì)胞分泌IFN-α和Th-2細(xì)胞分泌IL-4[7]。不論外源性或者內(nèi)源性MSCs對巨噬細(xì)胞的極化起到明顯調(diào)節(jié)作用。目前，根據(jù)巨噬細(xì)胞的功能和表型分為經(jīng)典活化的M1型極化和選擇性活化的M2型極化，經(jīng)典激活途徑的巨噬細(xì)胞通?？梢杂蒐PS、干擾素α、腫瘤壞死因子和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子誘導(dǎo)M1方向極化，主要參與體內(nèi)炎癥反應(yīng)，有促炎作用，能高分泌IL-1、IL-6、TNF-α，具有高IL-12、IL-23、低IL-10表型。而旁路激活途徑的巨噬細(xì)胞具有清除寄生蟲，促進(jìn)組織修復(fù)，促進(jìn)血管形成及腫瘤發(fā)展的作用。具有高IL-10、低IL-12、IL-23表型，高水平清道夫受體，CD206并高表達(dá)Arg-1[8]，類似于T細(xì)胞亞群Th1和Th2亞群在炎癥中的變化。眾所周知，LPS能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向經(jīng)典的M1型巨噬細(xì)胞偏移，但是近年巨噬細(xì)胞極化后在乙型病毒性感染所致的肝纖維化中發(fā)揮重要作用[9]。M2型巨噬細(xì)胞在酒精性肝病中促進(jìn)肝細(xì)胞衰老[10]，所以采用huMSCs對LPS已經(jīng)誘導(dǎo)M1型巨噬細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)來研究KCs的偏移極化。

本實(shí)驗(yàn)在Transwell內(nèi)共培養(yǎng)huMSCs和KCs兩種細(xì)胞，用huMSCs和經(jīng)LPS誘導(dǎo)后的KCs共培養(yǎng)證明實(shí)驗(yàn)組IL-10、IL-4分泌增加，體外研究表明MSCs能夠通過分泌IL-10、IL-4部分促進(jìn)巨噬細(xì)胞激活途徑改變，并發(fā)現(xiàn)MSCs分泌前列腺素E2與前列腺素E2受體亞型EP4作用后可以增加巨噬細(xì)胞IL-10的分泌，熒光實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證結(jié)果提示KCs分泌細(xì)胞抗炎因子IL-4、IL-10增加。本實(shí)驗(yàn)中ELISA檢測提示IL-6在實(shí)驗(yàn)組升高，而M2表型的枯否細(xì)胞多為IL-6分泌減少，近年來發(fā)現(xiàn)MSCs也存在不同表型[11]，因此，MSCs不同表型是否對巨噬細(xì)胞極化有影響值得進(jìn)一步研究。從上清液TNF-α以及iNOS表達(dá)增加看，經(jīng)LPS誘導(dǎo)后部分細(xì)胞已經(jīng)發(fā)生M1極化，再與huMSCs細(xì)胞共培養(yǎng)后，經(jīng)本實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，提示可以進(jìn)一步發(fā)生M2極化偏移，這可能反映從炎癥到修復(fù)的一個(gè)過程，巨噬細(xì)胞M1和M2極化代表了一個(gè)廣泛的、連續(xù)的巨噬細(xì)胞功能狀態(tài)[12]，與不同表型的巨噬細(xì)胞在不同炎癥階段發(fā)揮不同作用相符。但也有研究[13]表明M2極化的巨噬細(xì)胞能促進(jìn)M1細(xì)胞凋亡，調(diào)節(jié)肝臟炎癥反應(yīng)。這說明不同表型的巨噬細(xì)胞來源及作用和調(diào)節(jié)機(jī)制需要進(jìn)一步證實(shí)和驗(yàn)證。

目前肝臟疾病中巨噬細(xì)胞的個(gè)體發(fā)生情況仍不清楚，巨噬細(xì)胞發(fā)生極化的分子機(jī)制很復(fù)雜，包括多種信號通路參與其中，激活NF-κB和STAT1主要促進(jìn)M1巨噬細(xì)胞極化，而STAT3和STAT6激活促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2極化進(jìn)一步發(fā)揮其免疫功能[14]。其中NF-κB信號蛋白的激活對于M1型巨噬細(xì)胞偏移極化非常重要。NF-κB家族含有5個(gè)成員：p50、p52、p65(RELA)、RELB和REL蛋白，這些蛋白二聚化可引發(fā)NF-κB的入核增加，促進(jìn)炎癥因子表達(dá)，同時(shí)也參與細(xì)胞的生存和凋亡過程。NF-κB檢測結(jié)果提示經(jīng)LPS誘導(dǎo)后，激活M1型巨噬細(xì)胞并產(chǎn)生相關(guān)炎癥介質(zhì)如TNF-α升高，iNOS表達(dá)增加。在試驗(yàn)中當(dāng)LPS刺激后，NF-κB p65入核增多，但與huMSCs共培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)其入核減弱，提示其參與了KCs的表型轉(zhuǎn)化。體外實(shí)驗(yàn)已經(jīng)明確提示MSCs能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞發(fā)生M2極化，本研究結(jié)果顯示KCs+LPS+MSCs組pSTAT-3、pSTAT-6蛋白合成增加，提示其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑與JAK-STAT信號通路有關(guān)。STAT-6是IL-4介導(dǎo)的信號通路主要效應(yīng)蛋白分子[15]，這與本實(shí)驗(yàn)中IL-4升高是一致的，IL-4的升高通過各種途徑進(jìn)一步促進(jìn)核內(nèi)基因表達(dá)，介導(dǎo)M2細(xì)胞分化成熟[16]。M2型巨噬細(xì)胞可以通過Arg-1水解精氨酸，產(chǎn)生鳥氨酸，鳥氨酸是脯氨酸和多肽前體，與纖維化疾病相關(guān)。

總的來說，本實(shí)驗(yàn)證明了huMSCs分泌的可溶性因子誘導(dǎo)大鼠KCs向M2表型的轉(zhuǎn)化，這一過程通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞JAK-STAT信號通路實(shí)現(xiàn)。但是，由于巨噬細(xì)胞極化的分子機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜，需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。目前明確的是MSCs分泌的細(xì)胞因子及免疫調(diào)節(jié)作用是明確的，對進(jìn)一步研究huMSCs應(yīng)用于終末期肝病的治療有明確的意義，同時(shí)也說明了MSCs細(xì)胞治療具有獨(dú)特的免疫優(yōu)勢，可以用于多種疾病的免疫治療。

[1] Meirelles Lda S,Fontes A M,Covas D T.et al.Mechanisms involved in the therapeutic properties of mesenchymal stem cells[J].Cytokine Growth Factor Rev,2009,20(5-6):419-27.

[2] Liaskou E,Wilson D V,Oo Y H.Innate immune cells in liver inflammation[J].Mediators Inflamm,2012，2012:949157.

[3] Zhang Q Z,Su W R,Shi S H, et al.Human ingiva-derived mesenchymal stem cells elicit polarization of m2 macrophages and enhance cutaneous wound healing[J].Stem Cells,2010,28(10):1856-68.

[4] Kim J,Hematti P.Mesenchymal stem cell-educated macrophages:a novel type of alternatively activated macrophages[J].Exp Hematol,2009,37(12):1445-53.

[5] Dayan V,Yannarelli G,Billia F,et al.Mesenchymal stromal cells mediate a switch to alternatively activated monocytes/macrophages after acute myocardial infarction[J].Basic Res Cardiol,2011,106(6):1299-310.

[6] Li J,Zhang L,Xin J, et al.Immediate intraportal transplantation of human bone marrow mesenchymal stem cells prevents death from fulminant hepatic failure in pigs[J].Hepatology,2012,56(3):1044-52.

[7] Fibbe W E,Nauta A J,Roelofs H. Modulation of immune responses by mesenchymal stem cells[J].Ann N Y Acad Sci,2007,1106:272-8.

[8] Locati M, Mantovani A, Sica A. Macrophage activation and polarization as an adaptive component of innate immunity[J]. Adv Immunol,2013,120:163-84.

[9] Moses T B,Cheng L,Zhang Z,et al.Hepatitis B virus infection and immunopathogenesis in a humanized mouse model: induction of human-specific liver fibrosis and M2-like macrophages[J].PLoS Pathog,2014,10(3):e1004032.

[10] Wan J, Benkdane M, Alons E,et al.M2 Kupffer cells promote hepatocyte senescence an IL-6-dependent protective mechanism against alcoholic liver disease[J].Am J Pathol,2014,184(6):1763-72.

[11] Waterman R S,Tomchuck S L,Henkle S L,et al.A new mesenchymal stem cell (MSCs) paradigm: polarization into a pro-inflammatory MSCs1 or an immunosuppressive MSCs2 phenotype[J].PLoS One,2010,5(4):e10088.

[12] Biswas S K,Mantovani A.Orchestration of metabolism by macrophages[J].Cell Metab,2012,15(4):432-7.

[13] Wan J,Benkdane M,Teixeira-Clerc F,et al.M2 Kupffer cells promote M1 Kupffer cell apoptosis: a protective mechanism against alcoholic and non-alcoholic fatty liver disease[J].Hepatology,2014;59(1):130-42.

[14] Sica A,Mantovani A.Macrophage plasticity and polarization:invivoveritas[J].J Clin Invest,2012,122(3):787-95.

[15] Goenka S,Kaplan M H.Transcriptional regulation by STAT6[J].Immunol Res,2011,50(1):87-96.

[16] Ishii M,Wen H,Corsa C A, et al.Epigenetic regulation of the alternatively activated macrophage phenotype[J].Blood,2009,114(15):3244-54.

Li Liang1，Peng Qiong1，Cai Yihong2，et al

[1DeptofGastroenterology,TheThirdAffiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity(TheFirstPeople’sHospitalofHefei),Hefei230001；2SchoolofPublicHealth,AnhuiMedicalUniversity，Hefei230032]

The effect of human umbilical cord blood mesenchymal stem cells on the polarization of rat Kupffer cellsinvitro

ObjectiveLPS-stimulatedKupffercells(KCs)andhumanumbilicalcordbloodmesenchymalstemcells(huMSCs)wereco-culturedinTranswelltoobservetheeffectofhuMSCsonthepolarizationofKCs.MethodsDuringthisstudy,themodelofhuMSCsin vitroco-culturingwithKCswasbuilt,andthreegroupswereassigned,whichwereKCsgroup(normalgroup)，KCscells+LPSgroup(controlgroup),KCs+LPS+MSCsgroup(experimentalgroup).Amongthethreegroups,IL-4,TNF-α,IL-10,IL-6weredetectedbyELISAwhileinduciblenitricoxidesynthase(iNOS),arginase-1(Arg-1),phosphorylationreactionlevelofsignaltransducerandactivatoroftranscription-3,6(STAT-3,STAT-6)andnuclearfactor-κB(NF-κB)weredetectedbyWesternbolt.Afterthat,qRT-PCTwasadoptedtocheckthepreviousresults.ResultsItwasfoundthatbothTNF-αandIL-6secretionincreasedinthecontrolgroup,whilebothIL-10andIL-4secretionincreasedintheexperimentalgroup.WesternblotdetectionshowedthatthelevelofiNOSincreasedinthecontrolgroup,NF-κBp65increasedinthenucleus,whiletheexperimentalgroupwashighexpressionofArg-1,pSTAT-6,pSTAT-3.ConclusionOurexperiment’sfindingsindicatethathuMSCscaninducealternativeactivationofKCs,andtheactivationpathwaymightbetheJAK-STATpathways.

mesenchymalstemcells；Kupffercells；polarization；signalingpathway

時(shí)間：2015-12-30 14:38

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20151230.1438.020.html

國家自然科學(xué)基金(編號：81101272)

1安徽醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院(合肥市第一人民醫(yī)院)消化內(nèi)科， 合肥 230001

2安徽醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院， 合肥 230032

李 亮，男，碩士研究生；

戴 夫，男，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：hfsdf@sina.com

R 318.06

A

1000-1492(2016)01-0041-06

2015-10-12接收